二補助育改良方對反復體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜容受性的影響

石玥　劉雁峰　穆國華　武穎　辛明蔚　何軍琴

摘要 目的：觀察二補助育改良方對反復體外受精-胚胎移植（IVF-ET）失敗患者子宮內(nèi)膜容受性的影響。方法：選取2016年1月至2018年3月東直門醫(yī)院、北京婦產(chǎn)醫(yī)院及海淀區(qū)婦幼保健院多中心收集的因反復IVF-ET失敗而就醫(yī)患者資料，二補助育改良方藥物干預(yù)3個月后，與未用藥干預(yù)組比較，采集2組患者黃體中期子宮內(nèi)膜活體檢查，從分子生物學層面進行研究觀察，以qPCR研究同源盒基因（HOX）A10 mRNA表達，以免疫組織化學法檢測白血病抑制因子（LIF）、整合素αⅤβ3等指標，同時記錄妊娠結(jié)局。結(jié)果：在HOXA mRNA表達中，2組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;在LIF、整合素αⅤβ3的表達，2組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;胚胎種植率和臨床妊娠率有顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：二補助育改良方可以改善反復IVF-ET失敗患者黃體中期子宮內(nèi)膜HOXA 10mRNA、LIF、整合素αⅤβ3的表達。二補助育改良方的藥效值得肯定，可以改善反復IVF-ET失敗患者的子宮內(nèi)膜容受性。

關(guān)鍵詞 二補助育湯;二補助育改良方;子宮內(nèi)膜容受性;體外受精-胚胎移植;子宮內(nèi)膜活體檢查;同源盒基因A10;白血病抑制因子;整合素αⅤβ3

Effects of Modified Erbu Zhuyu Formula on Endometrial HOXA10 mRNA，LIF and Integrin ανβ3 in Patients with Repeated IVF-ET Failure

Shi Yue1，Liu Yanfeng2，Mu Guohua2，Wu Ying3，Xin Mingwei3，He Junqin3

（1 Haidian Maternal & Child Health Hospital，Beijing 100080，China; 2 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 3 Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100026，China）

Abstract Objective：To observe effects of modified Erbu Zhuyu Formula on endometrial receptivity in patients with repeated IVF-ET failure.Methods：Data of multicenter patients with repeated IVF-ET failure from January 2016 to March 2018 were collected.After 3 months of intervention with modified Erbu Zhuyu Formula，it was compared with non-intervention group.Endometria of patients in the 2 groups were collected during mid-luteal phase for biopsy and they were studied and observed from the perspective of molecular biology.Expression of HOXA10 mRNA was studied by qPCR.Immunohistochemistry was used to detect indexes such as LIF and integrin ανβ3.Pregnancy outcomes were collected.Results：There was obvious difference between the 2 groups in the expression of HOXA mRNA（P<0.05）.There were obvious differences between the 2 groups in the expressions of LIF and integrin ανβ3（P<0.05）.The embryo implantation rate and clinical pregnancy rate were increased significantly（P<0.05）.Conclusion：Modified Erbu Zhuyu Formula can improve the expressions of endometrial HOXA10 mRNA，LIF and integrin ανβ3 within mid-luteal phase in patients with repeated IVF-ET failure.Its efficacy should be affirmed that modified Erbu Zhuyu Formula can improve the endometrial receptivity in patients with repeated IVF-ET failure.

Key Words Erbu Zhuyu Decoction; Modified Erbu Zhuyu Formula; Endometrial receptivity; Repeated IVF-ET failure; Endometrial biopsy; HOXA10; LIF; Integrin ανβ3

中圖分類號：R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.066

隨著體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)在輔助生殖領(lǐng)域的日益進步，胚胎移植率得到顯著提高。但最終妊娠率仍不理想。國內(nèi)外臨床研究發(fā)現(xiàn)，胚泡著床障礙是導致IVF-ET妊娠率低的主要原因之一，而子宮內(nèi)膜容受性降低又是阻礙胚泡著床的主要因素之一。子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控機制需要諸多因素的參與。其中，同源盒基因（HOX）中HOXA10是子宮內(nèi)膜容受性建立和著床成功的必需調(diào)節(jié)因子，可能是影響子宮內(nèi)膜容受性更深層次的起源[1];白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）目前被認為是種植著床預(yù)測的金標準[2];整合素αⅤβ3是目前公認的、影響子宮內(nèi)膜容受性的指標之一[3]。

二補助育湯是名老中醫(yī)肖承悰教授調(diào)治子宮內(nèi)膜容受性低的經(jīng)驗方，全方“補腎氣，通胞脈”，從而改善子宮內(nèi)膜容受性[4]。該方中“二補”是指以補骨脂、骨碎補為君藥。目前補骨脂的肝腎毒性存在爭議[5-6]，臨床應(yīng)用時常去除，故在干預(yù)藥物上，本研究改用二補助育改良方（去補骨脂）進行深入研究。前期工作中，本課題組已對該類患者的中醫(yī)證型、相關(guān)癥狀評分、女性激素水平并結(jié)合超聲等各項指標進行了臨床研究[7-9]，同時對改良方進行了相關(guān)實驗研究[10-11]。在上述基礎(chǔ)上，我們采用子宮內(nèi)膜活體檢查的方法，采集反復IVF-ET失敗腎虛血瘀證患者黃體中期子宮內(nèi)膜，以qPCR研究HOXA10 mRNA表達，以免疫組織化學法檢測LIF、整合素αⅤβ3等指標，研究二補助育改良方對子宮內(nèi)膜容受性在分子生物學方面的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年3月就診于東直門醫(yī)院、北京婦產(chǎn)醫(yī)院及海淀區(qū)婦幼保健院，因子宮內(nèi)膜容受性低下致IVF-ET反復失敗而欲再行IVF-ET的患者31例。觀察組的樣本來自因反復IVF-ET失敗而于東直門醫(yī)院就診尋求中醫(yī)治療診斷為腎虛血瘀證的患者，對照組的樣本來自北京婦產(chǎn)醫(yī)院及海淀區(qū)婦幼保健院。患者皆因反復IVF-ET失敗而求子宮內(nèi)膜活體檢查，未經(jīng)中醫(yī)藥干預(yù)，腎虛血瘀證病例共16例。

對照組16例，年齡27～42歲，平均年齡（36.13±1.01）歲，其中35～42歲有12例，占75%;觀察組15例，年齡30～43歲，平均年齡（38.60±0.83）歲，其中35～42歲有13例，占86%。2組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。具有可比性。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準

對于反復IVF-ET失敗患者，子宮內(nèi)膜容受性低下的診斷標準，參照相關(guān)文獻[12-14]制定。1）婚后未避孕，有正常性生活1年而未受孕者;2）行2次及以上IVF-ET技術(shù)失敗，擬再行IVF-ET治療者;3）月經(jīng)周期規(guī)律（21～35 d），月經(jīng)量少;4）子宮形態(tài)正常;5）基礎(chǔ)體溫（BBT）雙相和（或）超聲監(jiān)測有正常排卵;6）超聲Salle評分≤13分;7）男方精液常規(guī)正常。

1.2.2 中醫(yī)證候診斷標準

腎虛血瘀證的證候診斷標準，參照《中醫(yī)病證診斷療效標準》[15]、《中醫(yī)婦科學》[16]不孕癥中腎虛證和血瘀證、月經(jīng)過少中的血瘀證等相關(guān)標準制定：主癥：1）婚久不孕;2）月經(jīng)量少或行經(jīng)時間不足2 d。次癥：1）腰酸膝軟;2）經(jīng)色紫黯有血塊;3）頭暈耳鳴;4）性欲淡漠或陰中干澀;5）經(jīng)行腹痛;6）面唇暗斑。典型舌脈：舌質(zhì)淡黯，舌邊有瘀點，脈沉細或澀。凡具備主癥及3項次癥參考典型舌脈即可診斷。

1.3 納入標準

1）符合上述診斷標準;2）同意并接受子宮內(nèi)膜活體檢查;3）能夠堅持口服中藥并積極配合完成治療者。

1.4 排除標準

1）因甲狀腺、腎上腺、垂體等器質(zhì)性病變及其他內(nèi)分泌疾病導致月經(jīng)過少者;2）患有輸卵管積水、子宮肌瘤、腺肌癥、內(nèi)異癥等;3）治療前3個月內(nèi)使用過激素類藥物治療者;4）嚴重的精神及心理疾患者;5）患有性傳播疾病或泌尿生殖系統(tǒng)急性炎性反應(yīng)者;6）資料不完整;7）私自改用其他治療，影響療效評定者。

1.5 干預(yù)方法

觀察組給予口服二補助育改良方（去補骨脂），主要藥物組成為：骨碎補、巴戟天、桑寄生、川牛膝、川續(xù)斷、郁金、雞血藤等，并隨辨證加減，制成顆粒劑，每日1劑，1劑2袋，早晚各1袋開水沖服。連續(xù)服用中藥3個月經(jīng)周期（月經(jīng)期間不停藥）。服滿3個周期中藥且同意子宮內(nèi)膜活體檢查患者。

對照組患者皆因反復IVF-ET失敗而求子宮內(nèi)膜活體檢查，未經(jīng)中醫(yī)藥干預(yù)，腎虛血瘀證患者。

1.6 觀察指標

3個月經(jīng)周期后，于黃體中期取患者子宮內(nèi)膜活體檢查。以試紙測定月經(jīng)周期中尿黃體生成素（LH），以LH高峰日確定排卵日（LH 0 d），視為黃體期開始，于黃體中期（LH+7 d）取子宮內(nèi)膜活體檢查?；蚪Y(jié)合超聲，明確排卵后7 d采集子宮內(nèi)膜標本。內(nèi)膜檢測當月月經(jīng)周期禁同房一個月。

治療結(jié)束患者再行IVF-ET治療，判定胚胎種植率和臨床妊娠情況。胚胎移植后2周抽血測定血β-人類絨毛膜性腺激素（β-hCG），陽性結(jié)果確定為生化妊娠，即為種植成功;胚胎移植后5周婦科超聲發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)孕囊和胎心搏動即確診為臨床妊娠。

采用一次性使用內(nèi)膜取樣管負壓吸取少量內(nèi)膜組織，以4 ℃生理鹽水快速洗去血污，用無菌干紗塊吸去水分，分成2份，一份置于無菌EP管于-80 ℃冰箱凍存，以備qPCR實驗;另一份存放于4%多聚甲醛固定液中，以備免疫組織化學染色。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理上述所采集的數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用獨立t檢驗，非正態(tài)數(shù)據(jù)用中位數(shù)（M）（min，max）表示，采用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組IVF-ET失敗次數(shù)比較

對照組IVF-ET失敗中位數(shù)為3（2，5）;觀察組IVF-ET失敗中位數(shù)3（2，4）。差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 二補助育改良方對反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA表達的影響

2組患者子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA表達比較，觀察組患者子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA表達明顯提高。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1，圖1～2。

2.3 二補助育改良方對反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜LIF表達的影響

2組患者子宮內(nèi)膜LIF表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2，圖3。

2.4 二補助育改良方對反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達的影響

2組患者子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3，圖4。

2.5 2組胚胎種植率和臨床妊娠率比較

對照組胚胎種植率（25%），低于觀察組（40%），對照組臨床妊娠率（6.25%），明顯低于觀察組（40%），P=0.014<0.05，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

3.1 一般情況分析

因教育水平提高、生活壓力增大、社會環(huán)境改變等原因，女性孕育年齡推后，加上正值二胎政策開放，此年齡段患者的生育欲望強烈，考慮到年齡因素及身體原因等，求助于輔助生殖技術(shù)的患者較多，但成功率較低，失敗次數(shù)增多。正如《素問·上古天真論》中言“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長;二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……五七陽明脈衰，面始焦，發(fā)始墮;六七三陽脈衰于上，面皆焦，發(fā)始白;七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”?？紤]該年齡患者正處于“五七”至“六七”之間，天癸漸衰，又可能因多次孕產(chǎn)而損傷腎氣，致腎氣虧虛;同時因患者求孕心切，多次試管經(jīng)歷，使得精神壓力較大，可能導致心氣虧損，心血不足。如《素問·評熱病論》中言，“胞脈者，屬心而絡(luò)于胞中”，心氣虧損，心血不足，氣血運行受阻而瘀滯，致胞脈不暢。此類患者符合子宮內(nèi)膜容受性低的主要病機-腎氣不足，胞脈不暢[4]，亦合于二補助育改良方補腎氣、通胞脈[4]的立法。通過2組間年齡分布和IVF-ET失敗次數(shù)的比較，差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。年齡（35～42歲）、IVF-ET失敗次數(shù)（2次及以上）在本研究納入的患者中具有一定的代表性。

3.2 HOXA10 mRNA、LIF及整合素αⅤβ3與子宮內(nèi)膜容受性

對照組與觀察組在HOXA10 mRNA表達上有明顯差異。相關(guān)研究表明，已普遍認同HOXA-10的表達與子宮內(nèi)膜容受性之間的關(guān)系，其可能是影響子宮內(nèi)膜容受性更深層次的起源。HOXA-10是胞飲突形成、子宮內(nèi)膜容受性和胚胎植入等成功建立的必需調(diào)節(jié)因子[1]。結(jié)果表明二補助育改良方能明顯改善反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA表達，作用機制為可能通過上調(diào)HOXA-10 mRNA，從而使子宮內(nèi)膜容受性得到改善。

本研究中對照組與觀察組LIF表達有明顯差異。LIF在胚胎移植中起著重要的作用，參與子宮轉(zhuǎn)變?yōu)榻邮軤顟B(tài)、蛻膜化、胚泡生長、胚胎-子宮內(nèi)膜相互作用、滋養(yǎng)層細胞侵入，以及免疫調(diào)制，在胚胎著床期高水平表達，在子宮內(nèi)膜的LIF水平可以作為胚胎著床的預(yù)測指標[2]。結(jié)果表明二補助育改良方能明顯改善反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜LIF表達，改善子宮內(nèi)膜容受性，促進胚胎著床。

對照組與觀察組整合素αⅤβ3表達亦有明顯差異。αⅤβ3是整合素的兩個亞單位，兩者通過共價鍵連接，在子宮內(nèi)膜“著床窗口期”（排卵后第6～10 d），兩者可同時表達于子宮內(nèi)膜的腺上皮和腔上皮，此時子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)最佳[2]。子宮內(nèi)膜中低水平的整合素αⅤβ3與子宮內(nèi)膜容受性下降有關(guān)，整合素表達上調(diào)可促進早期胚泡的黏附，反之，表達下降則不利于胚泡的植入[3]。本研究結(jié)果表明二補助育改良方能明顯改善反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達，改善子宮內(nèi)膜容受性，有助于胚泡對子宮內(nèi)膜的黏附。

在本研究統(tǒng)計結(jié)果中，觀察組與對照組HOXA10 mRNA、LIF、整合素ανβ3表達，胚胎種植率及臨床妊娠率有明顯差異。表明二補助育改良方能明顯改善反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA、LIF、整合素ανβ3表達，并改善妊娠結(jié)局?？烧J為二補助育改良方的藥效值得肯定，作用機制可能為通過上調(diào)HOXA10 mRNA、LIF、整合素ανβ3的表達，從而改善子宮內(nèi)膜容受性，有利于胚泡對子宮內(nèi)膜的黏附。同時顯著提高患者成功妊娠率，降低流產(chǎn)率，為臨床提高IVF-ET受孕率提供一定的試驗依據(jù)，為苦惱于“試管嬰兒”反復失敗的家庭帶來希望。

3.3 不足與展望

本研究采集的樣本數(shù)目較少。試驗群體皆為IVF-ET失敗2次以上的患者，采集的子宮內(nèi)膜為珍稀樣本。該群患者大多受孕意愿較迫切，而再次失敗的代價較高，使得患者對子宮內(nèi)膜活檢及再次活檢的接受度不高。盡管子宮內(nèi)膜活檢的相關(guān)技術(shù)已比較成熟，且機械性刺激有助于改善子宮內(nèi)膜容受性[17]，但畢竟屬于有創(chuàng)檢查，患者依從性較差;另外，采集時間又必須在黃體中期，患者有自然受孕及移植周期安排等相關(guān)顧慮。但對于評估二補助育湯及其改良方對反復IVF-ET失敗患者子宮內(nèi)膜的影響，在前期動物實驗及臨床觀察的基礎(chǔ)上，內(nèi)膜的直接檢測是更有說服力的，其結(jié)果能作為依據(jù)更好地為臨床服務(wù)。在今后的研究中，將盡可能收集自身前后對照，并進一步擴大樣本量。

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（2018-09-04收稿 責任編輯：楊覺雄）