“三棱-莪術(shù)”組分配伍介導(dǎo)PI3K-AKT通路治療大鼠子宮肌瘤的研究

肖紅妮　劉志杰

摘要 目的：研究三棱-莪術(shù)對治療子宮肌瘤的療效及可能作用機(jī)制。方法：36只雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、1∶1組、1∶2組，每組9只，其中模型組、1∶1組、1∶2組制備子宮肌瘤模型，空白組、模型組用生理鹽水灌胃，1∶1組、1∶2組根據(jù)三棱-莪術(shù)配伍比例進(jìn)行灌胃，干預(yù)結(jié)束后比較各組子宮/卵巢系數(shù)、子宮大小，子宮病理形態(tài)以及PI3K/AKT通路標(biāo)志因子的表達(dá)的變化。結(jié)果：1）模型組子宮平滑肌出現(xiàn)明顯的病變，三棱-莪術(shù)干預(yù)后大鼠子宮組織病變有所改善，其中1∶1組改善較1∶2組明顯。2）子宮肌瘤大鼠子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、子宮橫豎徑、子宮組織中E2和ER、PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)水平均明顯增加（P<0.05），經(jīng)三棱-莪術(shù)干預(yù)后上述指標(biāo)下降，其中術(shù)1∶1組改善較1∶2組明顯（P<0.05）。結(jié)論：三棱-莪術(shù)配伍可改善子宮肌瘤，這一作用機(jī)制可能通過激活PI3K/AKT通路實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 三棱-莪術(shù);組分配伍;PI3K-AKT通路;大鼠;子宮肌瘤;子宮系數(shù);卵巢系數(shù);子宮橫豎徑

Study on PI3K-AKT Pathway Mediated by “Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii” Components in the Treatment of Rat Uterine Leiomyoma

Xiao Hongni，Liu Zhijie

（Department of Gynecology，People′s Liberation Army Joint Service Support Unit 94th Hospital，Lanzhou 730050，China）

Abstract Objective：To study the therapeutic effect and possible mechanism of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii in the treatment of uterine leiomyoma.Methods：A total of 36 female SD rats were randomly divided into a blank group，a model group，a 1∶1 group and a 1∶2 group，with 9 rats in each group.The model group，1∶1 group and 1∶2 group were used to prepare uterine myoma model.The blank group and the model group were given normal saline by gastric lavage.The 1∶1 group and 1∶2 group were given gastric lavage according to the compatibility ratio of trigonum and zedoary turmeric.After intervention，the changes of uterus/ovary coefficient，uterine size，uterine pathological morphology and the expression of PI3K/AKT pathway marker factors were compared in each group.Results：1）The uterine smooth muscle in the model group showed obvious pathological changes，and the uterine tissue lesions improved after the intervention of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii，and the improvement in the 1∶1 group was more obvious than that in the 1∶2 group.2）The uterine coefficient，ovarian coefficient，transverse and vertical diameter of uterus，and the expression levels of E2，ER，PI3K and p-AKT/AKT in uterine tissue of rats with uterine leiomyoma significantly increased（P<0.05）.The above indexes decreased after intervention with Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii.The improvement in 1∶1 group was more obvious than that in 1∶2 group（P<0.05）.Conclusion：The compatibility of Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii can improve uterine leiomyoma，and this mechanism may be achieved by activating PI3K/AKT pathway.

Key Words Rhizoma Sparganii-Rhizoma Sparganii; Component compatibility; PI3K-AKT pathway; Rat; Uterine leiomyoma; Uterine coefficient; Ovarian coefficient; Transverse and vertical diameter of uterus

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.009

子宮肌瘤是婦科常見的良性腫瘤之一，以下腹部疼痛、墜脹不適、異常出血等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響婦女的孕育，更甚者常因治療不及時而出現(xiàn)惡變[1]。目前子宮肌瘤的病因尚未完全明了，學(xué)者推測其可能與卵巢分泌功能紊亂、雌孕激素平衡受破壞以及生長因子異常有關(guān)[2]。隨著研究的逐漸深入，越來越多文獻(xiàn)支持肌瘤細(xì)胞增殖/凋亡失常是導(dǎo)致子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，PI3K-AKT信號通路是經(jīng)典的與細(xì)胞增殖/凋亡密切相關(guān)的分子信號通路，同時亦與激素受體調(diào)控環(huán)節(jié)關(guān)系密切，有研究[5]顯示子宮肌瘤細(xì)胞侵襲能力的強(qiáng)弱與PI3K/AKT信號通路激活程度密切相關(guān)。

子宮肌瘤屬于中醫(yī)“癥瘕”“積聚”等范疇，《難經(jīng)·五十五難》云：“氣之所積為積，陽之所聚為聚，積者陰氣也，聚者陽氣也”。認(rèn)為子宮肌瘤分為癥積與瘕聚，其中癥積乃有形之邪，并多在血分，瘕聚為無形之邪，病在氣分，行氣消積、破血消癥只治療本病的關(guān)鍵。通過對近10年文獻(xiàn)的整理罵我們發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀型是子宮肌瘤發(fā)病率最高的證型，故行氣活血化瘀乃其之治則。三棱、莪術(shù)均為破血化瘀之良品，二藥屬于“相須”配伍的關(guān)系，首載于《經(jīng)驗良方》，臨床亦不乏二藥合用有效治療婦科疾病的記載[6-7]。隨著中醫(yī)藥國際化進(jìn)程的推進(jìn)，藥物組份的配伍逐漸成為研究的熱點，本團(tuán)隊在臨床研究中證實三棱-莪術(shù)組份確可有效治療子宮肌瘤，但二藥的配伍比例及作用機(jī)制尚不明確，基于此，由此我們以子宮肌瘤模型鼠為研究對象，旨在明確三棱、莪術(shù)的配伍規(guī)律及可能作用機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本研究采用36只雌性SD大鼠購買于長沙市天勤生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0011，平均大鼠體質(zhì)重為（200±20）g、所有的實驗大鼠和飼料均經(jīng)湖南省動檢二站檢測，均達(dá)到國家檢疫標(biāo)準(zhǔn)后方簽訂購買合同。所有大鼠均飼養(yǎng)于室溫（23±0.5）℃、濕度（51±3）%環(huán)境中，自由攝食，12 h/12 h交替光照。

1.1.2 藥物 三棱莪術(shù)配伍組分：1）三棱總黃酮制備：取適量三棱，第一步先采用乙醇提取法進(jìn)行初提，獲得三棱濃縮液第二步采用石油醚對三棱濃縮液進(jìn)行脫脂，隨后將脫脂后的三棱樣品進(jìn)行聚酰胺柱層析，經(jīng)過蒸餾水、乙醇的層層洗脫后進(jìn)行真空干燥，獲得三棱總黃酮浸膏并以此為基礎(chǔ)配制成5 g/mL的三棱生藥溶液;2）莪術(shù)揮發(fā)油的制備：第一步采用水蒸氣蒸餾提取法進(jìn)行初提，并以此為基礎(chǔ)配制成2 g/mL的莪術(shù)生藥溶液;3）“三棱-莪術(shù)”組分配伍：將總黃酮與揮發(fā)油按生藥量進(jìn)行折算，其配伍比例為1∶1，1∶2，臨用前加吐溫-80配成乳化劑備用。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠雌二醇（E2）ELISA分析試劑盒（北京綠源博德生物科技有限公司，型號：F15321）;大鼠雌激素受體（ER）ELISA分析試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，型號：XL-Er1021）;吐溫-80（Solarbio life sciences公司，型號：T8360）;PI3K一抗[賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號39202]，AKT一抗[購自賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號2812]，p-AKT一抗[購自賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號32412]和GAPDH一抗[賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號16234];酶標(biāo)儀[邁瑞Mindray有限公司，型號：MR-96A];電泳儀（廠家：美國伯樂BIO-RAD公司，型號：PowerPac Basic）;正置LED熒光顯微鏡（上海正晞儀器設(shè)備有限公司，型號：ZFM-650）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 36只雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、1∶1組、1∶2組，每組9只，其中模型組、1∶1組、1∶2組制備子宮肌瘤模型（制備方法如下）。各組大鼠在體質(zhì)重、飼養(yǎng)環(huán)境等條件一致（P>0.05），具有可比性。子宮肌瘤模型制備：除了空白組外，其余的SD雌性大鼠每日灌胃給予己烯雌酚藥液1.35 mg/kg、下肢外側(cè)肌肉注射黃體酮注射液1.0 mg/只，3次/周，間隔1 d注射，連續(xù)5周;最后2周（即第4周和第5周）開始皮下注射鹽酸腎上腺素注射液0.9 mg/（kg·d），注射4 h后給予隨機(jī)給予1種慢性不可預(yù)見性刺激，保證整個周期中每種刺激不少于2次。慢性不可預(yù)見性刺激分別為以下5種：1）連續(xù)3 h不間斷的60 db噪聲刺激，2）晝夜顛倒，3）5～10 ℃冰水浴游泳4 min，4）懸尾10 min，5）50 ℃烘箱烘10 min）?？瞻捉M每日灌胃2 mL生理鹽水，下肢外側(cè)肌肉注射生理鹽水0.05 mL/只，3次/周，間隔1 d注射，連續(xù)5周。

1.2.2 干預(yù)方法 1）空白組：10 mL（kg·只）生理鹽水灌胃;2）模型組：10 mL/（kg·只）生理鹽水灌胃;3）三棱莪術(shù)1∶1組：根據(jù)1∶1配伍比例10 mL（kg·只）灌胃給藥;4）三棱莪術(shù)1∶2組：根據(jù)1∶2配伍比例10 mL/kg/只灌胃給藥。均連續(xù)給藥10周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 子宮和卵巢系數(shù) 大鼠常規(guī)麻醉處死后，解剖取出所需子宮組織和卵巢組織，清除組織表面脂肪和血跡，稱取各臟器濕重，計算子宮和卵巢系數(shù)，子宮系數(shù)=子宮濕重/大鼠體質(zhì)重×100;卵巢系數(shù)=卵巢濕重/大鼠體質(zhì)重×100%。

1.2.3.2 子宮橫徑和豎徑 采用游標(biāo)卡尺測量子宮分角上的部分，記錄子宮橫徑和子宮豎徑，其中子宮橫徑為子宮兩分支中最寬處的長度;子宮豎徑為子宮兩分支中較長一支的長度。

1.2.3.3 子宮病理學(xué)觀察 取子宮分角上病理改變較典型部位的組織，常規(guī)固定石蠟包埋制作病理切片，經(jīng)過常規(guī)HE染色后，在正置LED熒光顯微鏡下觀察子宮平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞排列、體積及數(shù)量等形態(tài)，觀察是否有炎性浸潤等。

1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 檢測E2和ER子宮均漿組織，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進(jìn)行檢測E2、ER，包被、封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔、洗滌、加入待檢測樣品、加入酶標(biāo)抗體、加入底物液、終止反應(yīng)等過程均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，檢測時一定要首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)孔設(shè)置，使標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性加強(qiáng)。

1.2.3.5 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路 裂解液各組大鼠子宮組織，取上清;采用BCA法測蛋白濃度;將等量蛋白（50 μg）上樣至SDS-PAGE凝膠電泳2 h;PVDF膜轉(zhuǎn)膜，條件：100 V，100 mA，2 h;5%脫脂奶粉封閉2 h;PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH一抗抗體孵育，4 ℃過夜后;加入HRP標(biāo)記二抗;用化學(xué)發(fā)光法系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行顯影及拍照分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料用例（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 “三棱-莪術(shù)”組方對子宮病理形態(tài)的影響 空白組的子宮組織形態(tài)學(xué)顯示子宮平滑肌細(xì)胞排列、體積及數(shù)量均正常，排列有序未見明顯病變;模型組顯示子宮平滑肌纖維排列紊亂無序，體積變大，黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生變厚，肌層和肌間均可見炎性細(xì)胞浸潤;三棱莪術(shù)1∶1組細(xì)胞排列較模型組有序，黏膜上皮細(xì)胞僅有少量空泡變性;三棱莪術(shù)1∶2組可見肌纖維排列紊亂但較模型組有序，黏膜上皮細(xì)胞空泡變性較三棱莪術(shù)1∶1組多，肌層少量炎性細(xì)胞浸潤較模型組輕微。見圖1。

2.2 “三棱-莪術(shù)”組分對子宮/卵巢系數(shù)、子宮橫豎徑的影響 與空白組比較，模型組、三棱莪術(shù)1∶1組、三棱莪術(shù)1∶2組的子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、子宮橫徑和豎徑均明顯增加（P<0.05）;三棱莪術(shù)1∶1組、三棱莪術(shù)1∶2組較模型組均明顯下降（P<0.05），其中三棱莪術(shù)1∶1組下降程度優(yōu)于三棱莪術(shù)1∶2組（P<0.05）。見表1。

2.3 三棱-莪術(shù)”組分對子宮組織中E2和ER表達(dá)水平影響 與空白組比較，模型組、三棱莪術(shù)1∶1組、三棱莪術(shù)1∶2組的子宮組織中E2和ER表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P<0.05）;三棱莪術(shù)1∶1組、三棱莪術(shù)1∶2組較模型組均明顯下調(diào)（P<;0.05），其中三棱莪術(shù)1∶1組下調(diào)程度優(yōu)于三棱莪術(shù)1∶2組（P<0.05）。見表2。

2.4 三棱-莪術(shù)”組分對對PI3K/AKT通路的影響 與空白組比較，模型組、三棱莪術(shù)1∶1組、三棱莪術(shù)1∶2組的子宮組織中PI3K/GAPDH、p-AKT/AKT表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P<0.05）;三棱莪術(shù)1∶1組、三棱莪術(shù)1∶2組較模型組均明顯下調(diào)（P<0.05），其中三棱莪術(shù)1∶1組下調(diào)程度優(yōu)于三棱莪術(shù)1∶2組（P<0.05）。見表3及圖2。

3 討論

3.1 三棱-莪術(shù)組分配伍的用藥比例 莪術(shù)，性味屬辛苦溫，歸屬于肝脾兩經(jīng)。該藥首載于《藥性論》，有破氣行血、消積止痛的作用。常用于氣滯血瘀所致的癥瘕積聚、經(jīng)閉痛經(jīng)、心腹瘀痛、食積脘腹脹痛等。早在明代《藥品化義》亦云：“蓬術(shù)味辛性烈，專攻氣中之血，主破積消堅，去積聚癖塊，經(jīng)閉血瘀，撲損疼痛，與三棱功用頗同”，書中蓬術(shù)即莪術(shù)，莪術(shù)油是發(fā)揮藥效的主要成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為莪術(shù)油是莪術(shù)發(fā)揮抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，該成分同時還可預(yù)防血栓、消炎、抑制肝纖維化以及鎮(zhèn)痛等[8-10]。三棱，性味屬辛苦平溫，亦歸屬于肝脾兩經(jīng)，乃止血、消食和胃、破血行氣之要藥。雖然莪術(shù)與三棱均有破氣行血之功，但《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中記載：“三棱、莪術(shù)二藥性皆微溫，為化瘀血之要藥。若細(xì)核二藥之區(qū)別，化血之力三棱優(yōu)于莪術(shù)，理氣之力莪術(shù)優(yōu)于三棱”，故目前認(rèn)為三棱偏于破血，莪術(shù)偏于破氣，二藥因“相須”為用。三棱總黃酮是三棱的主要藥物成分，大量的基礎(chǔ)實驗[11-14]證實三棱總黃酮具有理想的抗栓作用，同時亦有抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在諸多古籍中三棱-莪術(shù)應(yīng)用比例多為1∶1，正如《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的理沖湯方中三棱-莪術(shù)各9 g，旨在調(diào)經(jīng)祛瘀，主治主治婦女經(jīng)閉不行、陽虛作冷、食少勞嗽等?！镀諠?jì)方》中的三棱莪術(shù)湯亦將三棱-莪術(shù)等分為用，以治療小兒疳積?，F(xiàn)代臨床報道亦不乏三棱-莪術(shù)1∶1應(yīng)用治療子宮肌瘤的報道，如賈文芳[15]用海藻昆布湯（三棱和莪術(shù)各10 g）治療子宮肌瘤，其有效率高達(dá)82.35%;辛昕[16]亦使用等份的三棱-莪術(shù)對子宮肌瘤患者進(jìn)行中藥穴位貼敷，結(jié)果顯示83.33%比例的患者治療有效。由此可見三棱-莪術(shù)1∶1比例具有扎實的臨床研究支持。在本研究中我們將SD雌性大鼠隨機(jī)分為4組，模擬子宮肌瘤病理，將三棱-莪術(shù)比例設(shè)置為1∶1及1∶2 2組，結(jié)果顯示三棱-莪術(shù)1∶1組在降低子宮、卵巢系數(shù)方面明顯優(yōu)于1∶2組，同時，與1∶2組比較，1∶1組大鼠的子宮組織的纖維化程度受到更為明顯的抑制。佐證了三棱-莪術(shù)1∶1比例對子宮肌瘤確有更為理想的療效。

3.2 基于PI3K-AKT信號通路探討三棱-莪術(shù)組分抗子宮肌瘤的作用機(jī)制 近年來大量研究對三棱-莪術(shù)組分的作用機(jī)制進(jìn)行研究，但目前尚無明確結(jié)論。目前資料顯示當(dāng)孕激素表達(dá)減少或雌激素作用被抑制時，孕激素誘發(fā)子宮肌瘤增殖的效應(yīng)被拮抗，故我們認(rèn)為雌激素與孕激素在研究子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展方面均具有重要作用。子宮內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖的同時E2和ER被活化，進(jìn)一步介導(dǎo)激素相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)該傳遞通路的活性，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生異常的有絲分裂，從而影響了肌瘤細(xì)胞的增殖、分化、增生等過程。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)E2和ER在模型鼠中存在高表達(dá)，隨著三棱-莪術(shù)組分的干預(yù)，大鼠的E2和ER水平逐漸減少，我們有理由相信三棱-莪術(shù)組分抗子宮肌瘤的可能機(jī)制與糾正孕激素和雌激素異常激活有關(guān)，其中1∶1比例組顯示出了更明顯的優(yōu)勢。ER水平的高低受到多方因素的調(diào)控，大量的分子信號通路均可通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切等途徑對ER的表達(dá)進(jìn)行介導(dǎo)，其中PI3K/Akt信號通路是目前備受關(guān)注的機(jī)制之一。生長因子將PI3K活化后將下游的磷脂酰肌醇催化成二磷酸磷酯酰肌醇、三磷酸磷酯酰肌醇，上述2種物質(zhì)均是細(xì)胞重要的第二信使，二磷酸磷酯酰肌醇及三磷酸磷酯酰肌醇被催化激活后進(jìn)一步將下游的AKT活化，AKT的功能涉及細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡的啟動、血管生成、端粒酶活性和細(xì)胞侵襲性等諸多方面[17-18]，與諸多疾病均有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較模型組及三棱-莪術(shù)組分組大鼠子宮組織的PI3K、p-AKT濃度上調(diào)，其中三棱-莪術(shù)組PI3K、p-AKT濃度較模型組明顯降低，其中1∶1比例組大鼠降低更為明顯，這提示1∶1三棱-莪術(shù)組分可更有效治療子宮肌瘤，且其作用機(jī)制可能是通過介導(dǎo)PI3K/Akt通路實現(xiàn)。

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（2019-07-15收稿 責(zé)任編輯：王明）