植物乳酸菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

劉利利 周勇 盧宗梅

摘 ? ? ?要：主要探索了如何提高植物乳桿菌高密度發(fā)酵活菌數(shù)，研究了培養(yǎng)基成分、pH值等發(fā)酵條件。結(jié)果表明：植物乳酸菌生長最適碳源是淀粉、葡萄糖，最適氮源是酵母浸粉;二價錳離子和無機鹽對菌體的生長有促進作用;最適培養(yǎng)基組成：酵母浸粉3%，醋酸鈉0.5 %，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀0.3%，氯化鈉0.2%，吐溫80 0.1%，硫酸錳0.3‰，硫酸鎂0.2‰，無水葡萄糖2.2%，碳酸鈣0.5%，淀粉4.4%。在5 L半自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵16 h左右，活菌數(shù)為8.9×1011 CFU/mL，發(fā)酵液保存周期較長，在75 d跟蹤檢測中活菌數(shù)無數(shù)量級變化。

關(guān) ?鍵 ?詞：植物乳酸菌;培養(yǎng)基組分;活菌數(shù);保存周期

中圖分類號：Q 815 ? ? ?文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）04-0616-04

Abstract： How to increase the number of viable bacteria in high-density fermentation of lactobacillus plantarum was mainly explored， and the fermentation conditions were studied，such as medium composition and pH value. The results showed that the mixture of starch and glucose was the optimum carbon source for the growth of lactic acid bacteria， while yeast extract was the optimum nitrogen source;Divalent manganese ions and inorganic salts could promote the growth of bacteria;the optimum medium composition was as follows： yeast extract 3%， sodium acetate 0.5%， triammonium citrate 0.2%， dipotassium phosphate 0.3%， sodium chloride 0.2%， Tween80 0.1%， manganese sulfate 0.3‰，magnesium sulfate 0.2teanhydrous glucose 2.2%，calcium carbonate 0.5%，starch 4.4%. The number of viable bacteria reached 8.9che11 CFU/mL after 16-hour fermentation in a 5 L semi-automatic fermentation tank，and the change of number of viable bacteria in the fermentation broth was not more than one magnitude order after 75-day storage.

Key words： Plant lactobacillus; Medium composition; Number of living bacterium; Preservation period

植物乳酸菌（LacLo ba-cillus planlarum）具備免疫調(diào)節(jié)、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等很多保健作用，同時也廣泛應(yīng)用于微生物制劑[1]。植物乳酸菌可以抑制腸道中有害菌體的繁殖，保持腸道中較多數(shù)量有益菌的生長，可改變腸道蠕動，保持健康的身體。而植物乳酸菌在腸道中可以制造人體所需的維生素VK、VB6、VB12、RIBOFLAVIN、葉酸等，同時可以抑制破壞維生素B1酵素，使腸道內(nèi)維生素B族保持穩(wěn)定。在動物腸道內(nèi)生長代謝，可以轉(zhuǎn)變多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、營養(yǎng)因子等，參與動物腸道中的有益菌生長，為微生物提供良好的環(huán)境[2]。乳酸菌是飼料添加劑中四大類微生物之一。

微生物自身的生長、繁殖以及代謝產(chǎn)物的累積離不開各種營養(yǎng)成分，在生長過程中需要提供一定的碳源、氮源、營養(yǎng)因子以及金屬離子等。碳源有利于微生物進行呼吸作用，氮源利于菌體蛋白的合成、核酸的生成。高密度培養(yǎng)是采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基MRS，根據(jù)菌體生長環(huán)境進行培養(yǎng)基優(yōu)化，在一定pH條件下進行搖瓶試驗，益生菌含量優(yōu)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再利用5 L發(fā)酵罐驗證其發(fā)酵效果，跟蹤發(fā)酵液保存周期，從而對飼料添加劑混菌發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 ?實驗部分

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株

菌種來源于中糧生物科技股份有限公司安徽研發(fā)基地。

1.1.2 ?試劑

蛋白胨酵、母粉浸粉FM 812、硫酸銨、牛肉浸膏、葡萄糖、硫酸鎂 、磷酸氫二鉀、硫酸錳、氯化鈉、碳酸鈣，均購買于北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.1.3 ?儀器及設(shè)備

艾貝泰全自動5 L發(fā)酵罐、立式壓力滅菌鍋、無菌凈化臺、分析天平、LRH-150生化培養(yǎng)箱、722可見分光光度計、pH計、電子調(diào)溫電爐、1 000 mL燒杯、1 000 mL三角燒瓶、500 mL藍蓋瓶。

1.1.4 ?培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉粉 1%，酵母粉 0.5%，葡萄糖 2%，醋酸鈉 0.5%，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀 0.2%，吐溫80 ?0.1%，硫酸錳0.05‰，硫酸鎂 0.1‰，瓊脂粉 1.6%。，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，溫度降至50 ℃左右備用。

種子搖瓶培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉粉 1%，酵母粉 0.5%，葡萄糖 2%，醋酸鈉 0.5%，檸檬酸三銨 0.2%，磷酸氫二鉀 0.2%，吐溫80 ?0.1%，硫酸錳 0.05‰，硫酸鎂 0.1‰，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基：酵母浸粉 3%，醋酸鈉 0.5 %，檸檬酸三銨 0.2%，磷酸氫二鉀 0.3%，磷酸二氫鉀0.2‰，氯化0.2%，吐溫80 ?0.1%，硫酸錳0.3‰，硫酸鎂0.2‰，無水葡萄糖 2.2%，碳酸鈣 0.5%，淀粉 4.4%，121 ℃滅菌20 min。

1.1.5 ?活菌數(shù)檢測

將0.85%生理鹽水滅菌后樣品按1 mL溶于9 mL生理鹽水中10倍稀釋即為10-1梯度，同樣操作稀釋到10-2至所需的稀釋梯度，取稀釋液1 mL與空平皿中，傾注MRS瓊脂培養(yǎng)基20 mL，每個梯度傾注兩個平行樣，平皿培養(yǎng)48 h菌落數(shù)30～300個之間即可讀數(shù)，最后取平均值計數(shù)。

1.2 ?實驗方法

1.2.1 ?一級搖瓶培養(yǎng)

將保存在超低溫冰箱中植物乳酸桿菌提前0.5 h自然解凍，接種量為0.2%，34±2 ℃靜置培養(yǎng)。待OD值長至6～7，pH為4.0左右，一級種子搖瓶結(jié)束。

1.2.2 ?二級搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化

將一級搖瓶轉(zhuǎn)接至二級發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%，34±2 ℃靜置培養(yǎng)。待OD值長至6～7，pH為4.0左右，二級發(fā)酵搖瓶結(jié)束。

1.2.3 ?5 L自動發(fā)酵罐培養(yǎng)

5 L發(fā)酵罐按照70%～80%的體積比裝液，調(diào)節(jié)pH到6.4±0.2，然后將培養(yǎng)好的二級搖瓶種子液以3%（v）的量接入5 L罐，溫度控制在35±2 ℃、轉(zhuǎn)速50 r/min，發(fā)酵周期18 h左右。

1.3 ?實驗設(shè)計

（1）發(fā)酵液中營養(yǎng)成分對菌體代謝的影響。研究碳源對菌體代謝的影響[3]，在發(fā)酵液中加入淀粉+葡萄糖混合物、淀粉、葡萄糖、蔗糖，添加比例均為2%;研究氮源對菌體生長和代謝的影響，在培養(yǎng)基中選擇加入酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉、玉米漿，添加比例按照3%;研究無機鹽對菌體生長代謝的影響，在發(fā)酵液中加入碳酸鈣、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉，具體濃度見表1，試驗無機鹽對菌體的影響。以上試驗都選擇在500 mL藍瓶蓋中培養(yǎng)，裝液量60%，培養(yǎng)溫度為35 ℃、靜置培養(yǎng)，發(fā)酵周期22 h，最后檢測菌體密度。

（2）不同發(fā)酵酸度對菌體生長的影響。通過上表試驗結(jié)果，配制起始pH值不同的物料：5.0、5.5、6.2、6.8、7.2，研究初始pH值對菌體生長的影響;分別裝入培養(yǎng)基300 mL于500 mL藍瓶蓋，恒溫35 ℃培養(yǎng)22 h后檢測OD值。以上均培養(yǎng)3個重復(fù)性試驗。

1.4 ?分析方法

1.4.1 ?益生菌數(shù)量

按照MRS瓊脂平板傾注法檢測乳酸益生菌含量。

1.4.2 ?菌密度檢測

使用722可見分光光度計檢測，波長600 nm。

1.4.3 ?pH值

pH計直接檢測。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同碳源及混合比例對菌體生長的影響

碳源是構(gòu)成物質(zhì)細胞的基礎(chǔ)，是培養(yǎng)基組成的主要成分。由圖1得知，植物乳酸菌菌體密度因碳源不同活菌數(shù)不同，其中以單一碳源與混合碳源相比較，淀粉與葡萄糖相結(jié)合為碳源使植物乳酸菌菌體活菌數(shù)最高，碳源對菌體生長有明顯影響，淀粉與葡萄糖相結(jié)合發(fā)酵效果最佳，活菌數(shù)達7.2×1011 CFU/mL。

2.2 ?不同氮源及濃度對菌體生長的影響

微生物生長和代謝需要氮源，主要用于菌體細胞壁（蛋白質(zhì)、氨基酸）和代謝產(chǎn)物的合成[4]。選取5種有機氮源：酵母浸粉FM812、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉添加到搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中[5]。植物乳酸菌對幾種氮源利用發(fā)酵效果不同，活菌數(shù)最佳的是酵母浸粉，具體見圖2所示。

根據(jù)上圖得知，酵母浸粉作為碳源對菌體生長有顯著影響，主要由于酵母浸粉中的葉酸、尼克酸、鈷胺素含量較高，其在中性和酸性對熱穩(wěn)定，且富含多種氨基酸，對菌體生長有明顯的促進作用[5]，因此使用酵母浸粉為最佳碳源[6]，本實驗結(jié)果也符合這種結(jié)論。

將發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母浸粉不同添加量對植物乳酸菌菌體生長的影響做進一步研究，其濃度為25 g/L和35 g/L時，菌體活菌數(shù)相當，考慮節(jié)約成本，所以優(yōu)先選擇濃度為25 g/L，已達到高密度發(fā)酵效果，實驗結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，當酵母浸粉濃度25 g/L時，發(fā)酵效果最佳。

2.3 ?無機鹽對菌體生長的影響

菌體生長不但需要碳源和氮源類營養(yǎng)因子，同時也需要無機鹽、生長因子等。無機鹽的主要功能是合成菌體的結(jié)構(gòu)成分，參與能量的儲存和運作，調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外滲透壓等。為研究無機鹽對菌體生長的影響情況，調(diào)配4種不同濃度組合的無機鹽進行試驗，結(jié)果如圖3所示。

上圖結(jié)果顯示，無機鹽濃度組合3活菌數(shù)最優(yōu)，為5.5×1011 CFU/mL。根據(jù)試驗結(jié)論配制最適碳源、氮源、無機鹽培養(yǎng)基。菌體生長環(huán)境需要一定添加量的微量元素，二價錳離子就是其中的一種[7]，二價錳離子使菌體生長速率較高，當濃度超過臨界值時，反而會抑制菌體生長。

2.4 ?pH值的影響

pH值決定著生物大分子的結(jié)構(gòu)和活性的許多方面，微生物的生長和生物合成都需要在合適的生長環(huán)境中，太高或太低的pH值均不利于菌體生長繁殖[8]。大部分菌體生長在酸度條件下，當pH 大于7.5或小于4.5時，生長和發(fā)育緩慢或停止。所以配制初始pH為 5.2、5.8、6.2、6.8、7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基來研究菌體生長最合適的酸堿條件，具體見圖4所示。

從圖4可知，初始pH值小于6.2與大于6.2終點OD值均偏低，初始pH值6.2時，菌體的生長條件最適宜，因此植物乳酸菌菌體生長的最適宜pH值為6.2。

2.5 ?5 L艾貝泰自動發(fā)酵罐發(fā)酵驗證

根據(jù)搖瓶試驗結(jié)論，配制5 L艾貝泰發(fā)酵罐發(fā)酵物料。發(fā)酵培養(yǎng)基濃度：淀粉+葡萄糖混合2∶1比例、濃度為2%，酵母浸粉濃度2.5%，無機鹽選組合3，培養(yǎng)溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速50 r/min，具體結(jié)果見圖5。

從圖5可知，開始8-12 h內(nèi)植物乳酸菌都在迅速生長;12 h以后進入穩(wěn)定期，活菌數(shù)增值較明顯;培養(yǎng)16 h后活菌數(shù)達最高，為8.2×1011CFU/mL;18 h后活菌數(shù)成下降趨勢，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束。試驗所示，在5 L艾貝泰發(fā)酵罐中其發(fā)酵效果較好，并對發(fā)酵液貨架期跟蹤，發(fā)酵液保存周期較長，在75 d的跟蹤檢測中活菌數(shù)無數(shù)量級變化，具體如表4所示。

3 ?結(jié) 論

以植物乳酸菌為菌種進行高密度培養(yǎng)基優(yōu)化，經(jīng)過對碳源、氮源、無機鹽以及環(huán)境因素等條件的研究，通過搖瓶試驗得出有利于菌體生長及代謝產(chǎn)物形成的發(fā)酵配方：最佳氮源為酵母浸粉;最佳碳源是比例為2∶1的混合型淀粉+葡萄糖;最佳無機鹽為組合3。用5 L發(fā)酵罐在初始pH值為6.2時進行發(fā)酵驗證，菌體密度大幅度增加，活菌數(shù)上升趨勢明顯，可以得到高密度發(fā)酵水平，活菌數(shù)為8.2×1011 CFU/mL。發(fā)酵液保存周期較長，在75 d的跟蹤檢測中活菌數(shù)無數(shù)量級變化。

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