農(nóng)村宴席沙門菌食物中毒脈沖場凝膠電泳溯源及藥敏分析

王文斟，李志峰，王 紅，趙 婷，廖春艷，代裕露，王子豪△

(1.重慶市疾病預(yù)防控制中心,重慶 400042；2.重慶市綦江區(qū)疾病預(yù)防控制中心,重慶 401420)

2018年1月17日，綦江區(qū)疾病預(yù)防控制中心接到轄區(qū)內(nèi)某中心衛(wèi)生院報告，該院陸續(xù)收治了多個腹瀉病例，腹瀉患者均參加某鎮(zhèn)某村一農(nóng)戶家的宴席后，出現(xiàn)不同程度腹痛、腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀。疾病預(yù)防控制中心相關(guān)人員立即開展流行病學(xué)調(diào)查、現(xiàn)場危害因素調(diào)查、衛(wèi)生學(xué)調(diào)查和采樣工作，經(jīng)實驗室檢測共分離到21株生化特性一致的D1群沙門菌，其中6株分離至宴席晚餐中的剩余菜品。綦江區(qū)疾病預(yù)防控制中心將收集到的21株D1群沙門菌送至重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測所實驗室進行菌株生化復(fù)核、血清型復(fù)核、脈沖場凝膠電泳、藥敏檢測?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 本次食物中毒分離到21株D1群沙門菌；相對分子質(zhì)量標準菌株為H9812，由中國疾病預(yù)防控制中心流行病研究所下發(fā)。藥敏質(zhì)控標準菌株大腸桿菌ATCC25922購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑 增菌液、選擇性培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板為青島海博產(chǎn)品；細菌生化鑒定卡(GN)為生物梅里埃產(chǎn)品；沙門菌屬診斷血清為泰國S&A產(chǎn)品；革蘭陰性菌藥敏檢測卡(CHNMCMM2)為ThermoFisher產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ為TAKARA產(chǎn)品，蛋白酶K為上海生工產(chǎn)品，乙二胺四乙酸、Tris、十二烷基硫酸鈉、TBE、Gelred染料為Solarbio產(chǎn)品或代理；所有試劑耗材均在效期內(nèi)使用。

1.1.3儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱(型號：MIR-254)為松下公司產(chǎn)品；全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)(型號：Vitek2)為生物梅里埃公司產(chǎn)品；全自動藥敏檢測系統(tǒng)(型號：430-A)、二級生物安全柜(型號：1300 SERIES A2)為ThermoFisher公司產(chǎn)品；脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)(型號：CHEF-Mapper XA/CHEF-DRⅢ)及凝膠成像儀(型號：XRS+)為BIO-RAD公司產(chǎn)品；比濁儀(型號：DMtm)為西門子公司產(chǎn)品；所有儀器設(shè)備均使用正常。

1.2方法

1.2.1菌株表型分型 按照GB4789.4-2016中的方法進行生化鑒定、血清學(xué)試驗[1]。

1.2.2藥敏檢測 采用微量肉湯稀釋法進行藥敏檢測，所使用的商品化CHNMCMM2革蘭陰性菌藥敏檢測板中包含氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦(2∶1比例)、四環(huán)素等15種抗菌藥物，每種抗菌藥物有5～11個倍比稀釋濃度；同時用標準菌株ATCC25922對本次試驗進行質(zhì)量控制。

1.2.3脈沖場凝膠電泳分型 檢測程序按照中國疾病預(yù)防控制中心流行病所致病菌識別網(wǎng)提供的標準程序進行，主要步驟：將培養(yǎng)18 h的新鮮菌落制備菌懸液(0.52透光率)，取等體積菌懸液與恒溫至56 ℃的SKG1%瓊脂糖混勻，制備成Plug。將Plug置于細胞裂解液，54 ℃裂解1 h，然后用超純水和TE溶液清洗。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ在37 ℃進行酶切2 h，酶切后的膠塊用于脈沖場凝膠電泳。電泳條件：最小相對分子質(zhì)量為30 kb，最大相對分子質(zhì)量為700 kb(2.16～63.80 s)，電壓6 V，轉(zhuǎn)換角度120°，電泳時間18.5 h，電泳溫度14 ℃，起始電流強度為123～125 mA。電泳結(jié)束后，Gelred染料染色30 min，純水中脫色60 min，凝膠成像儀生成指紋圖譜保存。

1.2.4脈沖場凝膠電泳分子分型圖譜的聚類分析 使用BioNumerics生物分析軟件對21株沙門菌的指紋圖譜進行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1生化及血清學(xué)試驗復(fù)核結(jié)果 21株D1群沙門菌經(jīng)過全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定為可信度98%的沙門菌屬。挑取營養(yǎng)瓊脂上的純培養(yǎng)菌落進行血清凝集試驗，實驗結(jié)果為：A-F多價+++，O9+++，O12+++，生理鹽水對照：-，證實該菌為D1群沙門菌。鞭毛抗原沒有立即凝集，經(jīng)過瓊脂含量3%的半固體瓊脂傳代以后該菌表達鞭毛抗原：HMB++,HG++,Hg++，Hm++，其余血清不凝集。經(jīng)Hg、Hm誘導(dǎo)血清進行相位誘導(dǎo)試驗后無第二相出現(xiàn)；根據(jù)Kauffman-Whit血清分型標準，得出該菌抗原式為：“9,12∶g，m：-”，判定該沙門菌為腸炎沙門菌。

2.2藥敏檢測結(jié)果 本次試驗標準菌株ATCC 25922質(zhì)控結(jié)果均在質(zhì)控范圍內(nèi)，試驗結(jié)果有效。21株腸炎沙門菌耐藥譜完全一致，結(jié)果判定參照美國臨床實驗室標準協(xié)會(CLSI)出版的藥敏試驗指南(2018版)[2]，試驗結(jié)果見表1。

表1 21株腸炎沙門菌15種抗菌藥物藥敏試驗結(jié)果

2.3脈沖場凝膠電泳結(jié)果 21株腸炎沙門菌經(jīng)過酶切、電泳后產(chǎn)生了12條片段條帶,見圖1，將指紋圖譜導(dǎo)入生物分析軟件Bionumerics，用UPGMA進行聚類分析并生成聚類分析圖，結(jié)果顯示21株腸炎沙門菌聚類分析相似度為100%，見圖2。

注：M為相對分子質(zhì)量標準菌株H9812，AB兩圖譜之間為H9812電泳條帶相對分子質(zhì)量指示；03～17號泳道為分離至患者的菌株，18～23號泳道為食品中分離到的菌株

圖1脈沖場凝膠電泳后生成的指紋圖譜

圖2 聚類分析圖

3 討 論

沙門菌是世界范圍內(nèi)食源性疾病主要的致病菌之一，其感染所致食物中毒發(fā)生數(shù)一直居細菌性食物中毒發(fā)生數(shù)的前2位[3]，其中與人類密切相關(guān)的有腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、德比沙門菌等10余種。我國發(fā)生的食物中毒中由沙門菌引起的占首位，其中腸炎沙門菌感染較為常見[4]，該病主要通過糞-口途徑傳播，亦可通過污染的肉類、禽蛋類等食物傳播。本次食物中毒事件源于綦江區(qū)某鎮(zhèn)某村村民封某的一起喪宴，由當?shù)亍耙粭l龍”餐飲服務(wù)公司承辦宴席，約480人次就餐，累計出現(xiàn)73例病例。實驗室人員對患者(糞便、肛拭)、剩余菜品、“一條龍”餐飲服務(wù)公司從業(yè)人員肛拭、市售制作菜品同一批次主要原材料(沒有開封的雞蛋干、烤鴨、蝦餃、怪味胡豆等)、自來水、井水等進行檢測。從患者糞便、肛拭中分離到15株腸炎沙門菌，從不同種類剩余菜品中分離到6株腸炎沙門菌；而從業(yè)人員肛拭、制作菜品同一批次主要原材料、自來水、井水未檢出沙門菌。食品和患者標本中同時檢出腸炎沙門菌，且兩者分離的菌株脈沖場凝膠電泳帶型一致，從基因上證明了病原的關(guān)聯(lián)性，證實本次食物中毒是食用受腸炎沙門菌污染的菜品所致。從業(yè)人員肛拭、制作菜品同一批次主要原材料、自來水、井水未檢出沙門菌，可以排除從業(yè)人員帶菌者污染和食品原材料被污染的可能性，所以食品加工環(huán)節(jié)暴露出極大的污染風險。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，“一條龍”餐飲服務(wù)公司無固定加工場所，餐飲制作多個工序為是露天作業(yè)，現(xiàn)場操作時生熟未分區(qū)，衛(wèi)生狀況差。多個塑料盆放在院內(nèi)地上作為清洗池，用于蔬菜、生肉類等食材和餐具的清洗加工；加工用水用10米左右塑料管從室內(nèi)自來水管接到塑料盆中，且塑料管出水口長期拖放在地面；大塊塑料布鋪放于地面存放各類食材、加工用具、餐具等；院內(nèi)散養(yǎng)了十幾只雞，地面上有淤泥和雞糞；以上各種原因極易導(dǎo)致加工用具、加工容器、餐具、食材、食品受到外界沙門菌污染。

脈沖場凝膠電泳技術(shù)是基于DNA結(jié)構(gòu)研究的一種細菌分子分型方法，其原理是在瓊脂糖凝膠上外加正交的交變脈沖電場，方向、時間、電流大小交替變換，從而將相對分子質(zhì)量不同大小的DNA分子分開，分離到的DNA片段較大，譜型穩(wěn)定，分辨率高、重復(fù)性好，因而成為腸炎沙門菌流行病學(xué)調(diào)查及溯源工作中非常有效的手段[5-6]。在利用脈沖場凝膠電泳方法對腸炎沙門菌分型的時候有多種內(nèi)切酶可以選擇，限制性內(nèi)切酶的選擇非常重要，多選用XbaⅠ、SpeⅠ等，XbaⅠ的區(qū)分能力最好[7]。本次事件中21株腸炎沙門菌通過XbaⅠ酶切，應(yīng)用脈沖場凝膠電泳技術(shù)進行分子分型，經(jīng)電泳產(chǎn)生12條30～700 kb的條帶，指紋圖譜經(jīng)生物分析軟件Bionumerics分析，聚類分析相似度為100%。根據(jù)菌株同源性判斷標準，從基因組的DNA水平，提示21株腸炎沙門菌為同一克隆菌株，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查表明該起事件是餐飲從業(yè)人員在加工食品環(huán)節(jié)中受到腸炎沙門菌污染所致。

抗菌藥物的使用是治療沙門菌感染的有效辦法，但隨著抗菌藥物的不合理使用，沙門菌屬耐藥問題越來越嚴重。尤其是在20世紀90年代首次出現(xiàn)沙門菌多重耐藥菌株104型(DT104)[8]，使沙門菌對抗菌藥物耐藥成為全球共同關(guān)注的問題。引起本次事件的腸炎沙門菌經(jīng)過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)該菌對青霉素類的氨芐西林、β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林/舒巴坦、頭孢類的頭孢唑啉、喹諾酮類的萘啶酸、氨基糖苷類的慶大霉素、大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素與阿奇霉素耐藥，存在多重耐藥現(xiàn)象。近年國內(nèi)外流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，對喹諾酮敏感性下降或耐藥的沙門菌比例呈上升趨勢，尤其是非傷寒沙門菌屬更為明顯[9]。目前，氟喹諾酮類藥物和頭孢類藥物作為臨床治療沙門菌感染的一線治療藥物，本次事件中的腸炎沙門菌對喹諾酮類萘啶酸耐藥表現(xiàn)提示，喹諾酮類藥物對沙門菌感染的治療有可能失效。在一些國家已報道了對氟喹諾酮類藥物敏感性降低的沙門菌分離株的出現(xiàn)[10-11]，甚至同時對3代頭孢菌素、環(huán)丙沙星和阿奇霉素耐藥的沙門菌菌株在2014年被報道[12]。

在我國農(nóng)村普遍存在家中辦宴席現(xiàn)象，其中大部分為流水席，這種宴席一般承接人數(shù)較多，為此產(chǎn)生了一種承辦宴席的服務(wù)行業(yè)，俗稱“一條龍”。 “一條龍”餐飲服務(wù)一般從業(yè)人員較少，但要承擔上百人甚至幾百人的餐飲服務(wù)，在餐飲制作過程中多個工序為露天作業(yè)，很多不具備制作大型宴席的條件。在從業(yè)服務(wù)人員少、食品安全意識淡薄、宴席得不到衛(wèi)生部門的監(jiān)管等情況下難以保障食品安全。本起事件有6名餐飲從業(yè)人員，僅公司負責人1人持有健康證明，餐飲服務(wù)公司亦無食品安全管理制度、廚師食品安全的培訓(xùn)記錄等資料。為預(yù)防此類公共衛(wèi)生事件的發(fā)生，衛(wèi)生行政部門應(yīng)加強這一領(lǐng)域的監(jiān)管工作，制訂承辦家庭宴席食品衛(wèi)生管理辦法，加強對農(nóng)村宴席、流水席的衛(wèi)生管理，加大食物中毒防治知識的宣傳教育力度。醫(yī)療部門在治療細菌性腹瀉中應(yīng)合理使用抗菌藥物，加強細菌的耐藥監(jiān)測，遏制細菌的耐藥發(fā)展趨勢，降低細菌的耐藥水平，防止更多、更廣譜的耐藥菌出現(xiàn)。同時，加強溯源網(wǎng)絡(luò)實驗室建設(shè)以保證溯源試驗的時效性，使分子溯源技術(shù)在暴發(fā)疫情、食物中毒等突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置中更及時發(fā)揮作用。