PRA法檢測hsp65和groES在非結(jié)核分枝桿菌肺病診斷中的價(jià)值

章 潔，郭秋萍

(廣元市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川廣元 628001)

我國非結(jié)核分枝桿菌肺病的發(fā)病率逐年上升，而結(jié)核病的比例卻逐年下降[1]。Meta分析顯示，我國以鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合體肺病最為常見[2]。如今，根據(jù)抗酸桿菌涂片的結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室診斷可在24 h內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果[3]。然而，涂片對(duì)結(jié)核分枝桿菌不是非常特異，并且每毫升痰需要103～104個(gè)菌[4]。SAIFI等[5]通過PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析(PRA)法對(duì)分枝桿菌擴(kuò)增hsp65基因后使用BstEⅡ消化發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌只能產(chǎn)生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非結(jié)核分枝桿菌則產(chǎn)生多種片段。ARAVINDHAN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的groES基因擴(kuò)增后用BstNⅠ消化產(chǎn)生片段不同。本研究采用PRA法對(duì)hsp65和groES進(jìn)行檢測，以評(píng)估其對(duì)非結(jié)核分枝桿菌肺病的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年2月本院收治的非結(jié)核分枝桿菌肺病患者30例作為肺病組，男18例，女12例，平均年齡(41±16)歲。選擇結(jié)核病患者30例作為結(jié)核組，男14例，女16例，平均年齡(39±18)歲；其中HIV/AIDS合并結(jié)核病患者13例，非HIV/AIDS合并結(jié)核病患者17例；肺結(jié)核病11例，肺外結(jié)核病19例。病理科按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，30例非結(jié)核分枝桿菌肺病患者和結(jié)核病患者均確診[7-8]。選擇非結(jié)核分枝桿菌病感染患者30例作為感染組，男15例，女15例，平均年齡(37±13)歲；經(jīng)皮膚試驗(yàn)陽性但無非結(jié)核分枝桿菌入侵組織和器官的現(xiàn)象。另選擇2017年6月至2018年2月本院體檢健康者30例作為健康對(duì)照組，男15例，女15例，平均年齡(45±14)歲。4組研究者年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有均衡可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1痰液中DNA的提取 收集肺病組、結(jié)核組和健康體檢組受試者清晨痰液樣本各5 mL，采用支氣管鏡采樣。使用最終1%濃度的NaOH通過Nacl-NaOH方法隔天對(duì)樣本凈化15 min。去污后，所有標(biāo)本均為用磷酸鹽緩沖液中和，并以4 000×g離心15 min。將離心后得到的沉淀物重新懸浮于2 mL LJ培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜后(培養(yǎng)2次均為同一致病菌且抗酸桿菌涂片陽性度為++以上)，使用廈門慧嘉生物科技有限公司的Amresco基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)：K368-50RXN)進(jìn)行DNA的抽取。

1.2.2PCR試驗(yàn) PCR的最終體積為25 μL，由5 μL DNA，200 μmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)，每種引物25 pmol，1.5 mmol/L MgCl2,1.25 U Taq DNA聚合酶(眾紅生物，貨號(hào)：ZHR1007M)組成，加入10×PCR緩沖液后將反應(yīng)混合物在94 ℃下初始變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s和72 ℃ 60 s)。最終延伸在72 ℃下進(jìn)行10 min。PCR引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3DNA酶消化 采用BstE Ⅱ(NEB，貨號(hào)：R0162L)對(duì)hsp65基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，BstN Ⅰ(NEB，貨號(hào)：R0168L)對(duì)groES基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化。將消化的產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳上，100 V下進(jìn)行2 h。擴(kuò)增hsp65基因后使用BstEⅡ消化發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌只能產(chǎn)生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非結(jié)核分枝桿菌則產(chǎn)生多種片段(245 bp/220 bp,245 bp/120 bp/100 bp,325 bp/120 bp)[5]。擴(kuò)增groES基因后使用BstN Ⅰ消化發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌能產(chǎn)生多種片段(550 bp/50 bp,470 bp/80 bp/50 bp,310 bp/140 bp/50 bp)，而非結(jié)核分枝桿菌則只能產(chǎn)生500 bp/100 bp的片段[6]?；诖?，使用Image J軟件對(duì)瓊脂糖凝膠成像圖中的條帶進(jìn)行灰度值分析。條帶數(shù)據(jù)化后，將[(325 bp+220 bp+100 bp)/80 bp]定義為非結(jié)核分枝桿菌hsp65相對(duì)分子質(zhì)量，將(50 bp/100 bp)定義為非結(jié)核分枝桿菌groES相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.14組受試者痰液中hsp65和groES的相對(duì)分子質(zhì)量 肺病組患者痰液中hsp65和groES的相對(duì)分子質(zhì)量明顯高于結(jié)核組、感染組及健康對(duì)照組(P<0.05)。健康對(duì)照組中hsp65和groES的相對(duì)分子質(zhì)量明顯低于感染組、結(jié)核組(P<0.05)。感染組患者痰液中hsp65和groES的相對(duì)分子質(zhì)量明顯高于結(jié)核組(P<0.05)。見表2。

2.2肺病組與結(jié)核組患者痰液中hsp65和groES的診斷效能 繪制30例非結(jié)核分枝桿菌肺病患者與30例結(jié)核病患者的ROC曲線，見圖1。hsp65的ROC曲線下面積為0.92(95%CI：0.851 4～0.986 4)，以hsp65=2.83為陽性臨界值，其診斷靈敏度為93%，特異度為80%。groES的ROC曲線下面積為0.91(95%CI：0.830 4～0.987 4)，以groES=2.67為陽性臨界值，其診斷靈敏度為77%，特異度為90%。見表3。

表2 4組受試者痰液中hsp65和groES的相對(duì)分子質(zhì)量

注：與結(jié)核組、感染組及健康對(duì)照組比較，▲P<0.05；與感染組及結(jié)核組比較，*P<0.05；與結(jié)核組比較：△P<0.05

圖 肺病組與結(jié)核組患者痰液中hsp65和groES的ROC曲線

檢測變量靈敏度(%)特異度(%)臨界值曲線下面積P95%CIHsp6593802.830.92<0.000 10.851 4～0.986 4groES77902.670.91<0.000 10.830 4～0.987 4

2.3肺病組與感染組患者痰液中hsp65和groES的診斷效能 繪制30例非結(jié)核分枝桿菌肺病患者與30例非結(jié)核分枝桿菌感染患者的ROC曲線，見圖2。hsp65的ROC曲線下面積為0.73(95%CI：0.609 3～0.859 5)，以hsp65=3.17為陽性臨界值，其診斷靈敏度為77%，特異度為63%；groES的ROC曲線下面積為0.72(95%CI：0.580 1～0.862 1)，以groES=2.96為陽性臨界值，其診斷靈敏度為77%，特異度為96%。見表4。

2.4肺病組與健康對(duì)照組痰液中hsp65和groES的診斷效能 繪制30例非結(jié)核分枝桿菌肺病患者與30例體檢健康者的ROC曲線，見圖3。hsp65的ROC曲線下面積為0.90(95%CI：0.831 3～0.982 1)，以hsp65=2.27為陽性臨界值，其診斷靈敏度為93%，特異度為83%。groES的ROC曲線下面積為0.89(95%CI：0.815 7～0.979 8)，以groES=1.96為陽性臨界值，其診斷靈敏度為76%，特異度為87%。見表5。

圖2 肺病組與感染組患者痰液中hsp65和groES的ROC曲線

檢測變量靈敏度(%)特異度(%)臨界值曲線下面積P95%CIHsp6577633.190.730.001 80.609 3～0.859 5groES63962.960.720.003 30.580 1～0.862 1

圖3 肺病組與健康對(duì)照組痰液中hsp65和groES的ROC曲線

檢測變量靈敏度(%)特異度(%)臨界值曲線下面積P95%CIHsp6593832.270.90<0.000 10.831 3～0.982 1groES76871.960.89<0.000 10.815 7～0.979 8

3 討 論

世界各地醫(yī)院均報(bào)道過與被污染的器械有關(guān)的非結(jié)核分枝桿菌感染暴發(fā)[9]。皮膚和免疫抑制患者的非結(jié)核分枝桿菌很容易向肺部或淋巴結(jié)系統(tǒng)擴(kuò)散[10]。自20世紀(jì)80年代以來，非結(jié)核分枝桿菌疾病模式和流行病學(xué)已發(fā)生變化，并逐漸出現(xiàn)在未被認(rèn)識(shí)的人群中[11]。 非結(jié)核分枝桿菌越來越被認(rèn)為是重要的人類病原體，由于艾滋病和其他免疫缺陷疾病，非結(jié)核分枝桿菌引起的疾病流行正在上升，且物種逐漸多樣化[12]。非結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體成員的區(qū)別在于它們不是專性病原體[13]。雖然抗酸桿菌涂片能夠在24 h內(nèi)診斷出結(jié)核分枝桿菌，但是涂片對(duì)結(jié)核分枝桿菌不是非常特異，并且每毫升痰需要103～104個(gè)菌[3-4]。另一方面，隨著全世界非結(jié)核分枝桿菌感染頻率的增加，臨床醫(yī)生對(duì)非結(jié)核分枝桿菌疾病的認(rèn)識(shí)提高，導(dǎo)致對(duì)非結(jié)核分枝桿菌感染的診斷有更多要求[14]。已有研究報(bào)道使用PRA法可以區(qū)分4種M.chelonae、M.fortuitum、M.kansasii和M.scrofluaceum，它們是臨床上最重要的非結(jié)核分枝桿菌[15]。盡管目前發(fā)現(xiàn)有154種非結(jié)核分枝桿菌，但是除了這4種非結(jié)核分枝桿菌，其他非結(jié)核分枝桿菌在臨床上并不常見或致病性低。由于PRA法診斷的快速性、便捷性和普遍性，本研究忽略PRA法檢測到其他非結(jié)核分枝桿菌的DNA片段。基于此，本研究發(fā)現(xiàn)，PRA法檢測hsp65和groES在非結(jié)核分枝桿菌病診斷中的臨界值分別為2.27和1.96，且具有較好的效果。

編碼10×103(GroES)和60×103(GroEL)熱休克蛋白的groESL操縱子在細(xì)菌中普遍存在并且在進(jìn)化上保守[16]。分枝桿菌的Hsp65(GroEL2)基因因其在物種鑒定中的實(shí)用性而得到充分證明[17]。 Hsp10(groES)基因(Rv3418c)因具有高度保守的氨基酸序列，已鑒定出免疫顯性物種特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞表位并已用于免疫診斷[18]。本研究中使用了439和600 bp的靶DNA序列，發(fā)現(xiàn)肺病組患者痰液中hsp65和groES相對(duì)分子質(zhì)量明顯高于結(jié)核組、感染組及健康對(duì)照組(P<0.05)。439 bp 的hsp65基因和600 bp的groES基因標(biāo)記是特異性的[19]，具有更廣譜的檢測，可從所有分枝桿菌(包括非結(jié)核和非致病)物種中擴(kuò)增，擴(kuò)增hsp65基因后使用BstEⅡ消化發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌只能產(chǎn)生245 bp/120 bp/80 bp的片段，而非結(jié)核分枝桿菌則產(chǎn)生多種片段(245 bp/220 bp,245 bp/120 bp/100 bp,325 bp/120 bp)[5]。擴(kuò)增groES基因后使用BstN Ⅰ消化發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌能產(chǎn)生多種片段(550 bp/50 bp,470 bp/80 bp/50 bp,310 bp/140 bp/50 bp)，而非結(jié)核分枝桿菌則只能產(chǎn)生(500 bp/100 bp)[6]。肺病組與結(jié)核組的hsp65和groES的靈敏度分別為93%和77%，特異度分別為80%和90%；肺病組與感染組的hsp65和groES的靈敏度分別為77%和63%，特異度分別為63%和96%；肺病組與健康對(duì)照組的hsp65和groES的靈敏度分別為93%和76%，特異度分別為83%和87%。

4 結(jié) 論

PRA法檢測hsp65和groES在非結(jié)核分枝桿菌肺病診斷中具有較好的效果。