長鏈非編碼RNA-ROR在乳腺癌診斷中的潛在應(yīng)用研究

曹鳴菲，雷德財(cái)，宋曉玉，吳立春△

(1.簡陽市川空人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川簡陽 641400;2.四川省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610041)

長鏈非編碼RNA-ROR(lincRNA-ROR)首次是在多能干細(xì)胞誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)的，是一個(gè)新的上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換誘導(dǎo)因子，能誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生干細(xì)胞樣細(xì)胞并促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與乳腺癌呈正相關(guān)[1-2]。本研究擬通過q-PCR方法，觀察lincRNA-ROR在乳腺癌組織和外周血清中的表達(dá)差異，旨在為乳腺癌早期篩查、診斷治療及預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所有組織均來源于四川省腫瘤醫(yī)院2017年1月至2018年12月行手術(shù)治療患者術(shù)中切除的新鮮組織，收集其中配對的乳腺癌病理組織及其癌旁組織共計(jì)30對，樣本均來源于簡陽市川空人民醫(yī)院術(shù)前臨床診斷乳腺癌，術(shù)后病理確診為乳腺癌患者，患者平均年齡(48.23±5.18)歲，并留取其手術(shù)前后1周的外周血液。與此同時(shí)，收集同期150例疑似乳腺癌病例，術(shù)中冰凍切片病理報(bào)告和術(shù)后石蠟切片病理確認(rèn)為乳腺癌女性患者的有效新鮮血清，采血前均未進(jìn)行任何臨床治療，其中早期乳腺癌患者50例，150例疑似乳腺癌患者平均年齡(47.84±6.34)歲。另選擇體檢健康者150例，平均年齡為(47.22±5.47)歲；乳腺良性疾病患者50例，患者平均年齡(48.12±5.83)歲。

1.2試劑與儀器 美國ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀器，日本島津UV-2450紫外分光光度計(jì)，美國Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像儀，昕慧XH600電泳分析儀，羅氏Cobas e601電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀。PCR引物、焦碳酸二乙酯(EDPC，上海生工生物工程有限公司)，組織RNA提取試劑盒TRIZOl、PrimeScriptTMRTⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqⅡ擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)，外周血RNA提取試劑盒(Bioteke,北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1樣本處理 所有組織樣本手術(shù)切除后置于經(jīng)DEPC水處理的專用凍存管存放于-80 ℃冰箱備用；外周血液樣本分離血清上機(jī)檢測后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2總RNA提取及cDNA的合成 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用bioteke法和Trizol法分別提取外周血清中的總RNA，再采用大連寶生物試劑盒(PrimeScriptTMRTⅡ)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.3內(nèi)參選擇及引物設(shè)計(jì) 查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2]并設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。

1.3.4lincRNA-ROR表達(dá)水平的檢測 q-PCR檢測擴(kuò)增后SYBR?Gree的熒光水平，并采用2-ΔΔCt計(jì)算分析樣本中l(wèi)incRNA-ROR的相對表達(dá)量，20 μL反應(yīng)體系成分及用量見表2。

表2 20 μL反應(yīng)體系成分及用量

1.3.5CEA和CA153水平檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，運(yùn)用羅氏Cobas e601電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀及其原裝試劑檢測外周血清中CEA和CA153的水平。

2 結(jié) 果

2.1總RNA提取及純度鑒定 要求RNA吸光度(A)260/A280為1.8～2.0，電泳條帶28S與18S亮度之比大概為2∶1，電泳圖譜見圖1。

圖 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2lincRNA-ROR在乳腺癌組織中的表達(dá) 熔解曲線呈單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物純度佳，無二聚體形成，得到相應(yīng)Ct值，通過2-ΔΔCt方法計(jì)算得出：30例乳腺癌組織中的lincRNA-ROR表達(dá)水平顯著高于30例癌旁組織(2.46±0.99vs.0.83±0.37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.78，P<0.000 1)。見圖2。

2.3lincRNA-ROR在乳腺癌外周血清中的表達(dá) lincRNA-ROR在150例乳腺癌患者外周血清中的表達(dá)水平明顯高于150例體檢健康者(1.76±0.70vs. 1.04±0.46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。見圖3。

圖2 lincRNA-ROR在乳腺癌組織中的表達(dá)

圖3 lincRNA-ROR在外周血清中的表達(dá)

2.4lincRNA-ROR在乳腺良性疾病血清中的表達(dá) lincRNA-ROR在50例乳腺良性疾病和50例體檢健康者間的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.24±0.45vs. 1.12±0.37，P>0.05)。

2.5lincRNA-ROR對乳腺癌的早期診斷價(jià)值 選取50例早期乳腺癌患者(乳腺腫瘤直徑<3 cm，同側(cè)腋窩無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)作為病例組，從150例體檢健康者血清中選取50例作為對照組，并采用化學(xué)發(fā)光法檢測CA153和CEA表達(dá)水平，對血清中的lincRNA-ROR、CA153和CEA繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，lincRNA-ROR的曲線下面積(AUC)為0.758，明顯大于乳腺癌傳統(tǒng)標(biāo)志物CA153(AUC=0.663，P=0.011)和CEA(AUC=0.516，P=0.002)；lincRNA-ROR在乳腺癌診斷中的靈敏度和特異度分別為80.0%和73.3%，均高于CA153(靈敏度為73.3%，特異度為60.0%)和CEA(靈敏度為66.7%，特異度為50.0%)。通過對血清中的lincRNA-ROR、CA153以及CEA建立多元Logistic回歸模型，發(fā)現(xiàn)3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合分析后AUC為0.846，聯(lián)合診斷效能優(yōu)于3項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)使用。見圖4。

圖4 lincRNA-ROR對乳腺癌的早期診斷效能

2.6lincRNA-ROR與乳腺癌實(shí)體腫瘤的相關(guān)性 通過對30例乳腺癌患者手術(shù)前和手術(shù)后1周的外周血清中l(wèi)incRNA-ROR的表達(dá)水平予以檢測，檢測結(jié)果表明，術(shù)后lincRNA-ROR的表達(dá)水平(0.90±0.35)明顯低于術(shù)前(1.82±0.68)，差異有統(tǒng)計(jì)意義(t=6.58，P<0.001)。見圖5。

圖5 lincRNA-ROR與乳腺癌實(shí)體腫瘤的相關(guān)性

3 討 論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)進(jìn)程[3-4]，傳統(tǒng)乳腺腫瘤標(biāo)志物缺乏足夠的靈敏度和特異度，2007年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)不再推薦其作為早期乳腺癌的診斷和術(shù)后隨訪觀察指標(biāo)[5]。新近研究顯示，lincRNA-ROR 在胃癌[6]、肝癌[7]、食道癌[8]、胰腺癌[9]、結(jié)腸癌[10]、膀胱癌[11]、鼻咽癌[12]、乳腺癌[2]中發(fā)揮著致癌作用，而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌作用[13-14]。HOU等[2]研究發(fā)現(xiàn)，lincRNA-ROR表達(dá)水平與乳腺癌呈正相關(guān)，當(dāng)沉默lincRNA-ROR時(shí)則抑制乳腺腫瘤形成和轉(zhuǎn)移，并通過miR-205/miR-145等實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等癌癥進(jìn)程的調(diào)控。MA等[15]研究成果顯示，lincRNA-ROR在三陰乳腺癌的組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，同時(shí)lincRNA-ROR作為miR-145的內(nèi)源性競爭性RNA上調(diào)MUC1基因的相對表達(dá)量來影響E鈣蛋白的細(xì)胞膜定位，并通過lincRNA-ROR/miR-145信號通路促進(jìn)三陰乳腺癌腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16-17]。應(yīng)用AUC評價(jià)試驗(yàn)診斷價(jià)值是現(xiàn)行公認(rèn)的理想方法[18]，本研究通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)lincRNA-ROR相對于CEA和CA153具有更高的靈敏度和特異度，并且lincRNA-ROR、CEA和CA153聯(lián)合檢測效能得以顯著提高(AUC=0.846)，這表明血清中的lincRNA-ROR可能為乳腺癌診斷的一個(gè)潛在分子標(biāo)志物。

近年來大量臨床藥物研究表明，高表達(dá)lincRNA-ROR可促進(jìn)波形蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白的表達(dá)，抑制上皮黏蛋白的mRNA及其蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致對5-氟尿嘧啶、紫杉醇、他莫昔芬、吉西他濱等藥物耐受，是乳腺癌化療、激素治療泛耐藥的一個(gè)分子標(biāo)志物[19-21]。而體內(nèi)外研究結(jié)果顯示,葡萄素通過LincRNA-ROR/miR-145/ARF6信號通路使乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Snail、波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9下調(diào)和上皮鈣黏附素表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而發(fā)揮出抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，為臨床乳腺癌的治療提供了新的思路和依據(jù)[22]。前期有研究發(fā)現(xiàn)，lincRNA-ROR與乳腺癌患者的年齡、TNM分期、HER2、Ki67、部位(左側(cè)、右側(cè)、雙側(cè))無關(guān)[23]。后期也有研究證實(shí)，linc-ROR rs4801078位點(diǎn)的等位基因與血液中Linc-ROR水平密切相關(guān)[24-25]，linc-ROR rs4801078 TT (OR=1.791,95%CI:1.195～2.683)基因型可以增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；Linc-ROR rs4801078、懷孕次數(shù)、絕經(jīng)狀態(tài)三者之間的交互作用亦可以增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[26]。

本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),lincRNA-ROR在乳腺癌患者術(shù)后顯著降低，同時(shí)在乳腺纖維瘤、乳腺增生等乳腺良性疾病患者血清中無明顯變化，這提示血清中l(wèi)incRNA-ROR表達(dá)水平可動(dòng)態(tài)反應(yīng)乳腺癌患者體內(nèi)腫瘤表達(dá)情況，通過對乳腺癌患者外周血清中l(wèi)incRNA-ROR的表達(dá)水平監(jiān)測，可以實(shí)現(xiàn)對乳腺癌患者手術(shù)效果評價(jià)和腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)控，進(jìn)而更準(zhǔn)確地預(yù)測乳腺癌治療效果，為臨床制訂乳腺癌診治策略的個(gè)體化及其預(yù)后隨訪的精準(zhǔn)化提供強(qiáng)有力的指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

LincRNA-ROR在乳腺癌患者組織和外周血液中表達(dá)上調(diào)，并具有良好的靈敏度和特異度，可作為乳腺癌早期篩查、診斷及預(yù)后判斷的一個(gè)新型分子標(biāo)志物和治療的潛在靶標(biāo)，但其在乳腺癌診治的臨床實(shí)用價(jià)值尚待進(jìn)一步研究。