基于宏基因組學(xué)的三峽庫區(qū)重慶主城段水體浮游微生物群落的組成和功能分析

羅 芳，魯倫慧，李 哲，付 川，閆 彬

（1.重慶三峽學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 404100；2.中國科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714；3.中國科學(xué)院水庫水環(huán)境重點實驗室，重慶 400714）

微生物在水生生態(tài)系統(tǒng)中種類繁多且密度大，影響著淡水生態(tài)系統(tǒng)功能的發(fā)揮和人類健康[1]。因此，淡水生態(tài)系統(tǒng)中的微生物成為研究的熱點，主要研究內(nèi)容包括浮游微生物群落組成結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子之間的相互作用關(guān)系等。三峽大壩的建設(shè)改變了大壩上下游河流的水文和水生生態(tài)[2]，水環(huán)境的物理、化學(xué)和生物特性均發(fā)生了一定程度的變化[3]。水環(huán)境改變會影響水庫系統(tǒng)中的水生微生物，尤其是對環(huán)境因子變化敏感的浮游細菌[4]。浮游生物對環(huán)境刺激表現(xiàn)出復(fù)雜和敏感的反應(yīng)，可以作為生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化的指標(biāo)[5]。

三峽庫區(qū)是一種特殊水庫生態(tài)系統(tǒng)[6]，人為擾動及三峽工程運行對庫區(qū)環(huán)境均有直接影響。三峽庫區(qū)重慶主城段是經(jīng)濟和人口增長迅速的區(qū)域之一[7]，研究該區(qū)域的浮游微生物群落組成結(jié)構(gòu)及功能，可以進一步理解水體浮游微對修建三峽大壩環(huán)境變化的響應(yīng)，及其水庫系統(tǒng)中發(fā)揮的生物地球化學(xué)循環(huán)作用[3]。

宏基因組這一概念在1998年第一次提出，它是指生境中微生物群落總的基因組信息[8]。傳統(tǒng)的微生物獨立培養(yǎng)只能獲得1%的微生物[9]，宏基因組學(xué)避開了微生物分離培養(yǎng)，直接從微生物群落獲得基因組信息[10]。宏基因組學(xué)的誕生推動了對浮游細菌結(jié)構(gòu)[11]、海洋環(huán)境中原核生物[12-13]和真核生物[14-15]群落組成、河流和湖泊生態(tài)系統(tǒng)浮游生物群落[16-17]的研究。目前，學(xué)者們利用16S擴增子測序技術(shù)[4]和宏基因組測序技術(shù)[18]揭示了浮游細菌在三峽水庫生態(tài)系統(tǒng)的多樣性。然而關(guān)于三峽水庫浮游微生物群落基因組研究，包括基因和功能的研究明顯不足。

本研究主要采用HiSeq 4000（Illumina，美國）高通量測序技術(shù)對三峽庫區(qū)重慶主城三處水域環(huán)境樣本浮游微生物（主要針對浮游細菌和浮游植物）進行分析，以獲取微生物群落物種分類信息（組成結(jié)構(gòu)）、功能基因信息（基因組成）以及基因功能（COG function，KEGG pathway），為理解其地球化學(xué)循環(huán)機制奠定基礎(chǔ)。同時通過對重慶主城段三處斷面水域水環(huán)境不同理化因子的比較分析，為水體水環(huán)境保護提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣品采集

2015年5月12日于春季水華前期在三峽庫區(qū)重慶主城段共設(shè)置3個斷面，分別位于重慶市上游的朱沱、下游的木洞，以及嘉陵江支流的北碚。朱沱鎮(zhèn)地處長江上游北岸，位于重慶市永川南端。朱沱斷面（105°51′26″E，29°01′27″N）屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均溫度為17.7 ℃。木洞斷面（106°32′01″E，29°25′18″N） 位于巴南區(qū)北部，北臨長江。北碚斷面（106°21′09″E，29°54′25″N）屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，多年平均溫度為18.2 ℃。各斷面按重慶主城上游（長江干流）、重慶主城下游（長江干流）及嘉陵江支流劃分。在各斷面沿河道中泓線設(shè)置3個采樣點（圖1），每個采樣點取10 L水，采集表層（0.5 m深度）水體并分析其水質(zhì)情況?，F(xiàn)場將每個斷面3個采樣點的5 L表層水樣充分混合，取1 L 水通過1.2 μm 濾膜（Whatman，美國）后再由0.22 μm 混合纖維素酯濾膜（Millipore，美國）過濾，濾膜放置液氮罐內(nèi)保存運輸，運回實驗室后放置于-80 ℃超低溫冰箱，進行樣品DNA 的提取。剩余水樣放置于冷藏保溫箱運回實驗室后，立即開展理化指標(biāo)的測試。

圖1 三峽庫區(qū)重慶主城段采樣斷面分布圖Fig.1 The distribution of sampling sites in the Chongqing urban section of Three Gorges Reservoir

1.2 水體基本理化指標(biāo)測定

現(xiàn)場測試分析的指標(biāo)包括：pH 值、電導(dǎo)率（Cond）、溶解氧（dissolved oxygen，DO）、水溫（T）、氣溫、大氣壓和總堿度（total alkalinity，TA）。其中pH 值、電導(dǎo)率、DO 值、水溫由YSI ProODO 測定，現(xiàn)場氣溫、大氣壓由手持式數(shù)字大氣壓測定，TA 由GDYS-103SI 總堿度測定儀測定。水體的有機碳（total organic carbon，TOC）、總碳（total carbon，TC）、水溶性有機碳（water-soluble orgnic carbon，WSOC） 由 vario TOC 分析儀 （elementar，GER）測定。硝態(tài)氮（N-NO3）、亞硝態(tài)氮（N-NO2）、氨氮（N-NH4）、總磷（total phosphorus，TP）、溶解性正磷酸鹽（soluble orthophosphates，SRP）、總氮（total nitrogen，TN）、葉綠素a（Chl a）（估算水體浮游植物生物量水平與營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)），測定方法參考文獻[19]。

1.3 宏基因組測序

1.3.1 全基因組測序分析

總DNA 的提取使用D5525-01Water DNA Kit（Omega，美國），提取方法參見試劑盒使用說明書。將提取的DNA 樣本送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行質(zhì)檢。DNA完整性檢測使用1%瓊脂糖凝膠電泳；DNA 純度檢測使用Nanodrop2000（賽默飛世爾科技，美國）；DNA 的濃度檢測使用TBS-380。送檢的DNA 樣本經(jīng)檢測滿足：有明顯主帶，且清晰完整，無降解；OD260/280在1.7～2.2之間（為1.89～1.90）。將檢測合格的DNA樣品構(gòu)建短輸入（500 bp）文庫，使用HiSeq 4000平臺（Illumina，美國）進行測序。有效數(shù)據(jù)（Clean Data）的獲取方法：使用Seqprep（https://github.com/jstjohn/SeqPrep），對序列3′ 端和5′ 端進行質(zhì)量剪切，獲得不含N堿基的較長序列片斷（reads）；使用Sickle（https://github.com/najoshi/sickle）保留的高質(zhì)量的雙末端和單端reads，即舍去剪切后的部分reads（長度＜50 bp以及平均質(zhì)量值＜20）。

1.3.2 基因拼接和預(yù)測

使用軟件SOAPdenovo （http://soap.genomics.org.cn/, Version 1.06），對高質(zhì)量的reads 進行拼接和組裝，然后根據(jù)長度為k的核苷酸序列（kmer）之間的重疊關(guān)系，構(gòu)建德布魯因圖（De-Brujin graphs），獲取重疊群（contigs），把reads 映射（mapping）到contig，根據(jù)reads 之間的雙末端（pair-end）關(guān)系把contigs 拼接成多個contig 的連接物（scaffolds）。將kmer 值設(shè)定為 39～47，在scaffolds的gap處，將scaffolds打斷成新的contigs，優(yōu)選contig（長度≥500 bp）。contig 的 ORF 預(yù)測使用 MetaGene（http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/）。并將其基因序列（核酸長度≥100 bp）翻譯為氨基酸序列。

1.3.3 非冗余基因集的構(gòu)建與基因注釋

CD-HIT軟件（http://www.bioinformatics.org/cdhit/）將所有樣品預(yù)測出來的基因序列按照95%一致性、90%覆蓋率進行聚類，選取各類中長度最長的序列進行非冗余基因集的構(gòu)建。使用SOAPaligner 軟件 （http://soap.genomics.org.cn/），按照95%一致性將每個樣品中經(jīng)優(yōu)化的reads 與非冗余基因集對比，然后統(tǒng)計樣品中的基因豐度信息。

選用 BLASTP（BLAST Version 2.2.28+，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）軟件將得到的樣品中的基因集序列分別與非冗余蛋白質(zhì)的氨基酸序列（Amino acid sequence of non-redundant protein，NR）、同源聚類基因群（homologous cluster gene group，eggNOG）和京都基因和基因組（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 數(shù)據(jù)庫進行比對，即可分別獲得物種、COG 功能和KEGG 功能注釋。比對參數(shù)e-value 均設(shè)置為 1×10-5。

2 結(jié)果

2.1 水環(huán)境基本參數(shù)

各水域斷面的水環(huán)境理化參數(shù)值見表1。采樣當(dāng)天，水溫（T）在各水域斷面變化很小。Cond，TP，TN，TC，Chl a在各采樣點間變化較大。與朱沱、木洞采樣點的理化參數(shù)值相比，北碚水域水環(huán)境中Cond，N-NO2，TN，Chl a含量最高，Chl a含量為2.09 μg/L，pH值，TP，TC，TOC以及DOC含量最小，pH 小于7，呈酸性。朱沱水體SRP、N-NO3和TC均是三者中最高的。木洞點位水體TP含量為0.092 mg/L，但是Chl a 含量卻是最小的。朱沱和木洞水體的大部分理化因子數(shù)據(jù)比較接近，可能是由于都位于長江干流段，有機質(zhì)含量較高，水體環(huán)境比較類似。

參考《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838—2002）對三峽庫區(qū)重慶段（北碚、朱沱、木洞三個斷面）的TP、TN和DO進行評價。在3個斷面水體中，TP含量為0.023～0.092 mg/L，只有北碚水體符合Ⅱ類標(biāo)準(zhǔn)，朱沱、木洞水體TP 含量均小于0.1 mg/L，符合Ⅳ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；TN 含量均大于1.5 mg/L，符合Ⅴ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。TP 和TN 的濃度遠遠超過國際公認的水體富營養(yǎng)化TN、TP含量的閾值 （TP 和 TN 濃度分別為 0.02 mg/L 和 0.2 mg/L）時，從營養(yǎng)鹽單因子考慮，超過藻類瘋長的“水華”現(xiàn)象的水體富營養(yǎng)化初始濃度限值[20]，是春季水華的主要成因。DO 含量為7.84～8.01 mg/L，符合Ⅰ類水標(biāo)準(zhǔn)。可以初步判斷，水體氮污染比較嚴(yán)重，TN，TP 是影響重慶段水體水質(zhì)的主要因素。

表1 各斷面的理化因子數(shù)據(jù)Tab.1 Summary of the physiochemical characteristics for each of the sample sites

2.2 三峽庫區(qū)重慶主城段水體浮游微生物基因集

宏基因組學(xué)測序共產(chǎn)生1.23 億條原始讀長（每個樣品0.39 億～0.45 億），3 組樣品（北碚、朱沱和木洞）的原始序列長度分別為5.82 Gb，6.07 Gb和6.75 Gb。單個樣品經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控后的Clean reads的序列長度占原始序列長度的93%左右。浮游微生物宏基因組共獲得230 740條組裝序列（contigs），單個樣品contigs 總序列長度分別為86.03 Mb，80.16 Mb 和 62.99 Mb （N50 為 944～1 046 bp）。這些組裝序列共產(chǎn)生398 263個（每個樣品11.23萬～14.69 萬個）開放閱讀框序列（ORFs），ORFs 在3 組樣品中的長度分別為76.76 Mb，72.76 Mb 和57.24 Mb（每個樣品平均長度509.81～522.96 bp），每個樣品的最長ORF 序列長度為13.59 kb 左右，最短ORF 序列為100 bp。去冗余前所有樣品的基因數(shù)為39.83萬條（每個樣品11.23萬～14.69萬條），所有基因的總序列長度為0.21 Gb。非冗余基因集基因數(shù)為28.46萬條，非冗余基因集基因的總序列長度為0.15 Gb，平均序列長度為536.47 bp。

2.3 基于宏基因組測序的物種與功能注釋

2.3.1 物種分類學(xué)注釋

根據(jù)宏基因組序列分析，共得到5域6界78門139 綱 314 目 571 科 1 727 屬 6 771 種 。 在 域 水 平上（表2），3組樣品水體微生物類別中相對豐度最大的均是細菌（Bacteria）和病毒（Virus），真核生物（Eukaryota）和古生菌（Archaea）含量較低。所有樣品門分類學(xué)水平上的物種豐度條形圖見圖2。將各樣品物種在不同分類中相對豐度小于0.1%的門類合并到“Others”組，一共注釋到8 個門類?？梢钥闯龇啪€菌門、變形菌門和擬桿菌門在北碚、朱沱、木洞水體相對豐度均較高，依次為44.39%，24.22% 和 9.32%； 36.28%， 26.59% 和 17.85%；44.45%，28.09%和11.43%。藍細菌門在北碚水體含量略高于擬桿菌門，為9.71%，而在朱沱和木洞水體含量僅為0.51%和0.49%。

表2 所測樣品在域水平上物種的相對豐度Tab.2 The relative percent contribution of planktonic mi crobe community at the domain level for the different sample

圖2 所有水域環(huán)境樣本浮游微生物門分類水平物種分類條形圖Fig.2 The relative percent contribution of planktonic microbe community at the phyla level for the different sample

將基因集與NR數(shù)據(jù)庫進行比對，選取屬水平上豐度前50 的屬繪制熱譜圖（圖3）。norank（屬未定）在北碚、朱沱和木洞斷面含量分別高達49.47%，41.72%和47.62%。除norank（屬未定）外，含量較為豐富的為藍細菌門中的顫藻屬和微鞘藻屬，未分類放線菌門的菌屬（Actinobacte-ria_unclassified）、沉積巖桿菌屬 （Ilumatobacter）、?-變形菌門的Limnohabitans菌屬，土壤桿菌屬（Sediminibacterium）、乳酸球菌屬 （Lactococcus）、噬冷菌屬（Algoriphagus）和黃桿菌屬（Flavobacterium）。值得注意的是，微鞘藻屬和顫藻屬只出現(xiàn)在北碚斷面的嘉陵江表層水體，其余兩處幾乎沒有。

圖3 屬水平上不同斷面浮游微生物群落的熱譜圖（相對含量前50個屬類別）Fig.3 Heatmap based on relative abundances of the top 50 genera of planktonic microbial communities among the different cross sections

2.3.2 COG功能注釋

將基因產(chǎn)物與eggNOG 數(shù)據(jù)庫①http://eggnog.embl.de/（evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups）對比獲得對應(yīng)的直系同源序列聚類（COG），得到所有樣本COG功能分類統(tǒng)計圖（圖4）。在3組樣品宏基因組序列中注釋到未知功能（Function unknown，S）的基因序列最多，北碚斷面水域環(huán)境樣本浮游微生物基因序列數(shù)目已經(jīng)接近8×105。其次為注釋到氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝功能（Amino acid transport and metabolism，E）的基因序列，在每個樣品中所占的比例分別為11.34%，11.10% 和11.63%。然后為注釋到翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成功能（Translation, ribosomal structure and biogenesis，J）的基因序列，分別占總體的8.68%，8.27%和8.72%。注釋到能量生成和轉(zhuǎn)化功能（Energy production and conversion，C）的基因序列數(shù)排在第四位，基因序列的相對豐度在北碚、朱沱和木洞斷面水域分別為8.42%，8.23%和8.72%，與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成功能相對豐度比較接近。

2.3.3 KEGG功能注釋

KEGG數(shù)據(jù)庫是一個整合基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。本研究以KEGG途徑數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，在對3組樣品一共99 472條基因序列進行代謝通路分析時，有54 340條基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中。統(tǒng)計被注釋的基因發(fā)現(xiàn)，只得到了3 505個K編號。再對注釋到的216個通路分析可得3組樣品注釋序列較多的代謝通路為ABC 轉(zhuǎn)運（ko02010）、嘧啶代謝（ko00240）和嘌呤代謝（ko0230），其中嘌呤代謝通路相對豐度最大，分別為北碚4.95%、朱沱5.10%和木洞5.01%。將注釋得到的代謝通路中與碳、氮、硫循環(huán)相關(guān)的部分代謝路徑繪制成一個熱圖，見圖5。3 個斷面水體中的浮游微生物參與碳元素循環(huán)相關(guān)的甲烷代謝（ko00680）、原核生物的碳固定（ko00720）、三羧酸循環(huán)（ko00020）的代謝路徑較多。微生物參與氮素循環(huán)相關(guān)的氮代謝（ko00910）途徑在朱沱和木洞兩處斷面水體樣本的相對豐度分別為1.13%和1.14%，略低于北碚斷面（1.23%）。與硫循環(huán)相關(guān)的代謝（ko00920）在北碚、朱沱、木洞3個斷面水體樣本中相對豐度偏小，分別為0.41%、0.45%和0.42%。

圖5 基于碳、氮、硫代謝的不同斷面水體KEGG 路徑熱譜圖Fig.5 Heatmap showing the differences among three sampling sections based on the KEGG pathway in carbon, nitrogen and sulphur metabolism

2.4 三峽庫區(qū)重慶段水體浮游微生物組成分析

2.4.1 多樣本物種、功能和基因數(shù)目比較

用Venn 圖來統(tǒng)計3 組樣品的浮游微生物群落的物種、功能和基因數(shù)目的組成情況（圖6）。從圖中可以看出3組樣品共有基因數(shù)高達170 606條，朱沱和木洞水體樣本共有的基因數(shù)目最多，達到211 902 條。北碚、朱沱和木洞水體樣本獨有的基因數(shù)分別為18 724 條、5 583 條和4 165 條，相比之下北碚水體浮游微生物獨有的基因數(shù)最多。對于屬水平上的物種數(shù)目，三組樣本共有的屬達到1 599 個，而木洞獨有2 個屬，根據(jù)統(tǒng)計得到的組間成分表，獲得這兩個屬是紫球藻屬（Porphyridium）和噬菌體屬（Tunalikevirus）。3組樣本中共有的COG 功能數(shù)目和KEGG功能數(shù)目分別為8 125個和207個，獨有的KEGG 功能數(shù)目較少。

圖6 多樣本比較Venn圖Fig.6 Venn diagram of multi-sample comparison

值得關(guān)注的是北碚水體的藍細菌門（Cyanobacteria），屬于原核生物，其相對豐度為9.71%，這一值明顯高于朱沱水體的0.51%和木洞水體的0.49%，但其絕對含量，仍需相關(guān)的定量手段來加以佐證。另外“Others”這一類別的物種相對豐度占比較小，說明在門分類水平上所選取物種可以很好地反映整體樣品的豐度。此外，在淡水生態(tài)系統(tǒng)扮演初級生產(chǎn)者角色的浮游植物，即浮游藻類，在物質(zhì)、能量等方面發(fā)揮著極大的作用[21]。對于真核藻類，在研究區(qū)域的表層水體中，僅發(fā)現(xiàn)了少量的硅藻門（Bacillariophyta），分別占北碚、朱沱和木洞水體總物種的0.02%，0.01%和0.01%。

2.4.2 樣本的非度量多維標(biāo)度（NMDS）分析

使用布雷-柯蒂斯（Bray-Curtis）距離計算樣本兩兩間的距離，分析樣本間的物種或功能豐度的分布差異。將樣本間的物種或功能距離矩陣用熱圖（圖7）表示，分別可得樣本間物種組成矩陣[圖7 （a）]、基因矩陣[圖7 （b）]、COG 功能的矩陣[圖7 （c）]和 KEGG 功能矩陣熱圖[圖7 （d）]。結(jié)果顯示：朱沱和木洞水體在物種、基因、COG功能上的差異是最小的，北碚和朱沱水體之間差異最大。在KEGG功能上，北碚和朱沱水體的差異最大，朱沱和木洞水體具有相似性。NMDS排序圖在朱沱和木洞的物種組成相似性與浮游微生物在門和屬分類水平上的聚類圖具有一致性。

圖7 樣本的非度量多維標(biāo)度排序圖Fig.7 Non-metric multidimensional scaling (NMDS)ordination diagram of samples

2.5 三峽庫區(qū)重慶段理化因子與浮游微生物類群間的關(guān)系

選取門分類水平上豐度靠前的12 個物種和環(huán)境水文因子進行Pearson 相關(guān)性分析（表3）。由表3 可知，放線菌門與大部分環(huán)境因子呈現(xiàn)高度相關(guān)性。其中與N-NO2和N-NH4顯著正相關(guān)（r=1，P＜0.05），與N-NO3呈顯著負相關(guān)（r=-1，P＜0.05），與DOC 呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01）。綠彎菌門（Chloroflexi）與pH 值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。藍細菌門與T呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與TC呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01）。異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）與DO呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）與Chl a呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。變形菌門與TP呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

表3 浮游微生物優(yōu)勢門與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)性分析相關(guān)系數(shù)表Tab.3 Pearson correlationship analysis on dominant phyla of planktonic microbial communities with environmental factors

3 討論

3.1 三峽庫區(qū)重慶段水體浮游微生物優(yōu)勢菌屬群落結(jié)構(gòu)分析

通過研究屬水平上的物種豐度（圖3）發(fā)現(xiàn)，在朱沱斷面，擬桿菌門的黃桿菌屬和β-變形菌門的Limnohabitans菌屬相對豐度最高。已有研究發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬在灃河和鄱陽湖微生物群落中大量存在，黃桿菌屬主要靠分解有機物生存，且具有溶藻活性[21]。此外，黃桿菌屬的某些菌種具有致病作用，主要表現(xiàn)為對魚的致病作用，需要重視對該菌屬的防護[22]。已有研究表明Limnohabitans菌屬在水體浮游細菌群落中扮演著重要的角色，因為它們在藻類衍生的基質(zhì)上有很高的基質(zhì)吸收和生長速率[23]。在北碚斷面水體發(fā)現(xiàn)大量的顫藻屬和微鞘藻屬，它們都屬于藍細菌門。高營養(yǎng)濃度導(dǎo)致北碚斷面水體Chl a 偏高，這與在該斷面水體中藍細菌的生物量較高具有一致性。三峽庫區(qū)重慶段水體的浮游微生物物種豐度分布遵循生態(tài)學(xué)最古老、最普遍的規(guī)律之一，即水體中稀有物種占多數(shù)，常見物種占少數(shù)[24]。

3.2 三峽庫區(qū)重慶主城段水環(huán)境浮游微生物的功能分析

在COG注釋（圖4）中，絕大多數(shù)的基因序列歸類于代謝類下的氨基酸轉(zhuǎn)運，代謝亞類和能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化亞類，信息存儲及處理類的翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成亞類。根據(jù)KEGG 路徑熱圖（圖5）分析，在北碚斷面水體樣本中的浮游微生物參與能量代謝相關(guān)的光合作用途徑多于另外兩處斷面水體，這與得到的北碚斷面表層水體Chl a含量明顯高于另外兩處斷面水體的結(jié)果具有一致性。統(tǒng)計可得，北碚斷面水體基因注釋到與參與氮循環(huán)相關(guān)代謝途徑的數(shù)目高于另外兩處斷面水體，且所得到北碚斷面水體硝酸鹽還原酶高于另外兩處斷面水體，這與表1中北碚斷面水體亞硝酸鹽氮含量高于另外兩處斷面水體的結(jié)果相符。此外，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫得到注釋序列最多的代謝通路與膜運輸和核苷酸代謝路徑有關(guān)。通過NMDS排序圖（圖7）可知朱沱和木洞水體中浮游微生物具有的COG功能和KEGG功能類別是相似的。KEGG路徑的熱圖中包含的芳香族化合物多環(huán)芳烴的降解，可能涉及微生物降解過程。有研究表明，黃桿菌屬能以低分子量多環(huán)芳烴作為唯一碳源和能源，降解和礦化多環(huán)芳烴[25]。KEGG路徑熱圖中包含甲烷代謝和硫代謝路徑，本研究還未能分辨參與的甲烷代謝過程為產(chǎn)甲烷過程、甲烷氧化過程還是同時包括這兩個過程，如若探討甲烷微生物過程機制，需對相應(yīng)的功能基因做進一步分析。KEGG 路徑熱圖中涉及了氮代謝過程，參與硝化、反硝化的菌種的確定和功能分析是接下來需要進一步分析的內(nèi)容。KEGG熱圖中的原核生物碳固定路徑以及光合作用路徑相對豐度較高，可能是藍藻參與反應(yīng)。

3.3 環(huán)境因子對三峽庫區(qū)重慶主城段水環(huán)境浮游微生物群落的影響

為了確定水體理化因子對浮游微生物（主要是浮游細菌）群落組成的影響，本研究進行了Pearson 相關(guān)性分析 （表3）。T，TC，DOC 是影響三峽庫區(qū)重慶段浮游微生物群落的主要環(huán)境因子。因為微生物都有一個利于生存的最適溫度，溫度往往是潛在的限制性因素[26-27]。在相關(guān)性分析結(jié)果中，藍細菌門與溫度具有明顯的相關(guān)性，這與之前的研究[28]相符。在確定對藍細菌門生長的影響因素時應(yīng)結(jié)合理化及水文學(xué)等參數(shù)綜合考慮。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)芽單胞菌門與Chl a 呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），Chl a與浮游植物的生物量關(guān)系密切[29]。這可能是由于浮游植物的某物種抑制了芽單胞菌門的生長。

4 結(jié)論

（1）基于宏基因組學(xué)技術(shù)對重慶段進行分析，得到的物種注釋表明：在門水平上，重慶段水體（北碚、朱沱和木洞）四大優(yōu)勢菌門為放線菌門、變形菌門、藍細菌門和擬桿菌門。古菌的優(yōu)勢類群為廣古菌門。在屬水平上，除屬未定的微生物以外，北碚水體的顫藻屬和微鞘藻含量最高；朱沱水體含量最高的是變形菌門的Limnohabitans菌屬；木洞水體含量最高的為Limnohabitans菌屬，其次為沉積巖桿菌屬。COG功能注釋表明：3個采樣點水體的微生物解釋得最多的功能就是氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝。

（2）Pearson 相關(guān)分析結(jié)果表明：浮游微生物群落豐度與環(huán)境因子有著很強的關(guān)聯(lián)性，其中T，TC和DOC的影響程度最大。

（3）在本研究中，水體的營養(yǎng)狀態(tài)均是通過Chl a，TN和TP、浮游植物群落結(jié)構(gòu)進行單因子評價。從Chl a 單因子評價，研究水體均屬于貧營養(yǎng)狀態(tài)。從TN和TP的指標(biāo)來看，各調(diào)查水域均處于中營養(yǎng)至重富營養(yǎng)狀態(tài)。如果從浮游植物群落進行評價，比如硅藻門，可以初步判斷調(diào)查水體水質(zhì)屬于中營養(yǎng)型，因為中營養(yǎng)型湖泊通常是甲藻、隱藻、硅藻占優(yōu)勢[30]。但是考慮到水庫生態(tài)系統(tǒng)本身的復(fù)雜性和野外環(huán)境的不確定因素等，還需要通過結(jié)合三峽水庫重慶段水體的評價標(biāo)準(zhǔn)來評價水體的貧富營養(yǎng)狀態(tài)。