PPARδ基因多態(tài)性與大動脈粥樣硬化型腦梗死關(guān)系

李鵬飛 常飛 劉麗媛 崔寶龍 何曉燕 周暢

[摘要]?目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體δ（PPARδ）基因多態(tài)性與大動脈粥樣硬化（LAA）型腦梗死的關(guān)系。

方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）檢測270例山東漢族LAA型腦梗死病人及236例同期健康體檢者（對照組）PPARδ基因rs9794和rs2267668位點的基因型，采用Logistic回歸模型分析PPARδ基因多態(tài)性與LAA型腦梗死的關(guān)系。

結(jié)果腦梗死組和對照組rs9794位點的GG/GC基因型頻率分別為30.37%（82/270）和44.07%（104/236），G等位基因頻率分別為17.59%（95/540）和24.15%（114/472），腦梗死組rs9794位點的GG/GC基因型及G等位基因頻率明顯低于對照組（OR=0.554，95%CI=0.384～0.798，P<0.05;OR=0.670，95%CI=0.494～0.910，P<0.05）;兩組rs2267668位點基因型及等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。多因素Logistic回歸分析顯示，PPARδ基因rs9794位點的GG/GC基因型是LAA型腦梗死的保護因素（OR=0.616，95%CI=0.407～0.932，P<0.05）;rs9794和rs2267668位點多態(tài)性與LAA型腦梗死病人血管狹窄部位無關(guān)（P>0.05）;不吸煙（OR=0.538，95%CI=0.348～0.832，P<0.05）、無高血壓史（OR=0.328，95%CI=0.181～0.595，P<0.05）、無糖尿病史（OR=0.528，95%CI=0.332～0.841，P<0.05）、無冠心病史（OR=0.418，95%CI=0.279～0.627，P<0.05）人群PPARδ基因rs9794位點GG/GC基因型者發(fā)生LAA型腦梗死的危險性明顯降低。

結(jié)論?PPARδ基因rs9794位點G等位基因降低了LAA型腦梗死的易感性，在腦梗死的發(fā)生發(fā)展中可能是保護因素;吸煙史、高血壓史、糖尿病史和冠心病史等傳統(tǒng)危險因素減弱了rs9794位點GG/GC基因型對腦梗死的保護作用。

[關(guān)鍵詞]?腦梗死;動脈粥樣硬化;過氧化物酶體增殖物激活受體;多態(tài)性，單核苷酸

[中圖分類號]?R743.33

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）01-0076-06

ASSOCIATION BETWEEN PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTOR Δ GENE POLYMORPHISM AND LARGE-ARTERY ATHEROSCLEROTIC CEREBRAL INFARCTION

LI Pengfei， CHANG Fei， LIU Liyuan， CUI Baolong， HE Xiaoyan， ZHOU Chang

（Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the association between peroxisome proliferator activated receptor δ （PPARδ） gene polymorphism and large-artery atherosclerotic （LAA） cerebral infarction.

MethodsA total of 270 Chinese Han patients in Shandong， China， who were diagnosed with LAA cerebral infarction （cerebral infarction group） and 236 healthy individuals who underwent physical examination during the same period （control group） were enrolled， and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was used to determine the genotypes of rs9794 and rs2267668 of the PPARδ gene. A logistic regression model analysis was used to investigate the association between PPARδ gene polymorphisms and LAA cerebral infarction.

ResultsCompared with the control group， the cerebral infarction group had significantly lower GG/GC genotype and G allele frequencies of rs9794 GG/GC genotype：30.37% （82/270） vs 44.07% （104/236）， （OR=0.554，95%CI=0.384-0.798，P<0.05）; G allele：17.59% （95/540） vs 24.15% （114/472）， （OR=0.670，95%CI=0.494-0.910，P<0.05）. There were no significant diffe-rences in the genotype and allele frequencies of rs2267668 between the two groups （P>0.05）. The multivariate logistic regression analysis showed that GG/GC genotype of rs9794 of the PPARδ gene was a protective factor against LAA cerebral infarction （OR=0.616，95%CI=0.407-0.932，P<0.05）. Polymorphisms of rs9794 and rs2267668 were not asso-ciated with the site of vascular stenosis in patients with LAA cerebral infarction. Among the people with GG/GC genotype of rs9794 of the PPARδ gene， the individuals who did not smoke （OR=0.538，95%CI=0.348-0.832，P<0.05） or had no history of hypertension （OR=0.328，95%CI=0.181-0.595，P<0.05）， diabetes （OR=0.528，95%CI=0.332-0.841，P<0.05）， or coronary heart disease （OR=0.418，95%CI=0.279-0.627，P<0.05） had a significant reduction in the risk of cerebral infarction.

ConclusionThe G allele of rs9794 of the PPARδ gene reduces the susceptibility to LAA cerebral infarction and may be a protective factor in the development and progression of cerebral infarction. The risk factors including the histories of smoking， hypertension， diabetes， and coronary heart disease weaken the protective effect of GG/GC genotype of rs9794 against cerebral infarction.

[KEY WORDS]brain infarction; atherosclerosis; peroxisome?proliferator-activated receptors; polymorphism， single nucleotide

腦梗死是一種由環(huán)境因素、遺傳因素及二者相互作用引起的復(fù)雜多因素疾病，而大動脈粥樣硬化（LAA）型腦梗死是中國人群腦梗死的主要類型[1]。傳統(tǒng)危險環(huán)境因素主要包括吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常等。應(yīng)用家族聚集性研究、雙生子研究、家系的復(fù)合分離分析和遺傳模式分析等多種方法研究均顯示，腦梗死符合多基因遺傳模式[2]。近年來有關(guān)基因多態(tài)性對腦梗死的潛在影響已成為一個新的研究熱點。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，我國腦梗死病人顱內(nèi)、外血管狹窄的發(fā)生率存在差異[3]。動脈粥樣硬化是LAA型腦梗死的主要原因。研究認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種血管的炎癥性病理生理過程，其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一是轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（NF-κB），NF-κB在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[4]。過氧化物酶體增殖物激活受體δ（PPARδ）是一類核激素受體超家族的配體激活轉(zhuǎn)錄因子[5]，廣泛分布于人體各種組織。在人類血管內(nèi)皮細(xì)胞中，PPARδ具有減輕血管炎癥反應(yīng)的作用，其機制為通過阻斷NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞1、細(xì)胞間黏附分子1、單核細(xì)胞趨化蛋白1及生長調(diào)節(jié)致癌基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附及炎癥反應(yīng)[6]。14-3-3ε是內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡機制的重要組成部分，對于維持血管壁的穩(wěn)態(tài)極其重要，而PPARδ可通過上調(diào)人內(nèi)皮細(xì)胞14-3-3ε表達(dá)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[7]。近來已有研究表明，PPARδ基因rs9794位點能夠降低血膽固醇水平[8]，PPARδ基因rs2267668位點與中國漢族2型糖尿病易感性無關(guān)[9]。但是國內(nèi)外對上述基因位點多態(tài)性與LAA型腦梗死的關(guān)聯(lián)研究鮮有報道，故本研究對此進(jìn)行了探討。

1?資料和方法

1.1?研究對象

①腦梗死組：為2016年8月—2017年6月在我科住院治療的270例腦梗死病人，其診斷均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》中腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，均經(jīng)顱腦CT或顱腦MRI檢查證實。根據(jù)TOAST標(biāo)準(zhǔn)[11]，均為LAA型腦梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：小動脈閉塞性、心源性及其他原因腦梗死;并發(fā)嚴(yán)重外傷或感染性疾病;惡性腫瘤或自身免疫性疾病等。根據(jù)顱腦磁共振血管成像（MRA）或顱腦CT血管成像（CTA）確定的腦血管狹窄部位，分為顱內(nèi)組、顱外組、顱內(nèi)外組3個亞組。②對照組：為同期我院體檢中心的236例健康體檢者。本研究獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2?研究方法

1.2.1基本資料采集?通過臨床問卷調(diào)查及體格檢查采集所有研究對象的基本資料，如年齡、性別、身高、體質(zhì)量、吸煙史、飲酒史等，并計算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）和腰臀比。所有受試者禁食12 h，晨起常規(guī)采血檢測血糖、總膽固醇、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等生化指標(biāo)。

1.2.2危險因素定義?①高血壓：未口服藥物時收縮壓≥18.62 kPa和（或）舒張壓≥11.97 kPa，或使用降壓藥物;②糖尿?。嚎崭寡恰?.0 mmol/L和（或）餐后血糖≥11.1 mmol/L，或使用降糖藥物;③冠心?。航?jīng)心電圖或冠狀動脈檢查確診;④吸煙史：連續(xù)或累計吸煙6個月以上，數(shù)量每天≥10支;⑤飲酒史：飲酒時間≥5年，攝入乙醇量≥40 g/d;⑥家族史：受試對象一級親屬和（或）二級親屬至少有1例腦梗死病人。

1.2.3血液DNA提取?采集研究對象肘靜脈血2 mL，加入含有已二胺四乙酸二鈉的真空采血管中，充分混勻防止凝集。于當(dāng)日使用血液DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司提供）提取血液白細(xì)胞中的DNA。

1.2.4PPARδ基因多態(tài)性分析?兩位點均采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）進(jìn)行分析，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系25.0 μL，內(nèi)含有模板DNA 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，兩個位點褪火條件分別為67 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35次循環(huán)。取擴增產(chǎn)物5 μL，采用瓊脂糖凝膠電泳成像，檢查PCR產(chǎn)物特異性。

1.2.5基因型鑒定?酶切反應(yīng)體系25.0 μL：PCR擴增產(chǎn)物4.0 μL，限制性內(nèi)切酶（rs9794位點內(nèi)切酶PshAⅠ和rs2267668位點內(nèi)切酶HPY188Ⅰ，美國NEB公司）1.0 μL，10×NE Buffer 2.5 μL，雙蒸

水17.5 μL。反應(yīng)條件如下：rs9794、rs2267668位點分別為65、37 ℃置于恒溫金屬浴1 h。取酶切產(chǎn)物10 μL，GelRed染色，在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳（100 V、40 min），使用凝膠成像分析儀觀察并照相。同時取10%受試者的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，驗證PCR擴增及酶切結(jié)果。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布者以[AKx-D]±s表示，兩組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析;計量資料不符合正態(tài)分布者以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，多組之間比較采用Kruskal-Wallls H檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用多項Logistic回歸分析檢驗各因素與腦梗死的關(guān)系。以P<0.05為差異有顯著性。

2?結(jié)??果

2.1?兩組基本臨床資料比較

兩組冠心病史、高血壓史、2型糖尿病史、吸煙史、飲酒史、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、LDL-C及HDL-C比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.462～35.685，t=2.885～6.933，H=5.534，P<0.05），而年齡、性別、家族史、TG、膽固醇、纖維蛋白原、BMI及腰臀比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。腦梗死病人顱內(nèi)、顱外和顱內(nèi)外血管狹窄的發(fā)生率分別為33.70%、24.07%和42.22%。腦梗死組3個亞組間基本臨床資料比較，顱內(nèi)組和顱內(nèi)外組空腹血糖、舒張壓高于顱外組（H=7.745，F(xiàn)=3.492，P<0.05），其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.2?兩組基因型和等位基因頻率的比較

PPARδ基因兩個位點的酶切電泳基因分型見圖1。腦梗死組、對照組及腦梗死各亞組PPARδ基因兩個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，在青島地區(qū)具有人群代表性。腦梗死組rs9794位點的GG/CG基因型頻率及G等位基因頻率明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=0.554，95%CI=0.384～0.798，P<0.05;OR=0.670，95%CI=0.494～0.910，P<0.05），兩組rs2267668位點基因型及等位基因頻率比較差異無顯著意義（OR=0.767，95%CI=0.534～1.102，P>0.05;OR=0.896，95%CI=0.661～1.217，P>0.05）。見表4、5。多項Logistic回歸分析的結(jié)果顯示，高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、收縮壓以及LDL-C是LAA型腦梗死的危險因素，而HDL-C和

rs9794位點GG/GC基因型是LAA型腦梗死的保護因素。見表6。

2.3?PPARδ基因多態(tài)性與腦梗死血管狹窄部位的關(guān)系

PPARδ基因兩個位點的基因型及等位基因頻率在腦梗死組3個亞組間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表7、8。

2.4PPARδ基因rs9794位點多態(tài)性分層分析

對差異有統(tǒng)計學(xué)意義的rs9794位點進(jìn)一步進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，不吸煙（OR=0.538，95%CI=0.348～0.832，P<0.05）、無高血壓史（OR=0.328，95%CI=0.181～0.595，P<0.05）、無糖尿病史（OR=0.528，95%CI=0.332～0.841，P<0.05）、無冠心病史（OR=0.418，95%CI=0.279～0.627，P<0.05）人群PPARδ基因rs9794位點GG/GC基因型者發(fā)生腦梗死的危險性明顯降低。而在有吸煙史（OR=0.630，95%CI=0.318～1.260，P>0.05）、高血壓史（OR=0.782，95%CI=0.464～1.317，P>0.05）、糖尿病史（OR=0.639，95%CI=0.331～1.235，P>0.05）、冠心病史（OR=2.844，95%CI=0.997～8.111，P>0.05）情況下，rs9794位點GG/GC基因型對腦梗死無明顯保護作用。

3?討??論

PPARδ基因位于染色體6P21.1-P21.2區(qū)域，共含有9個外顯子，編碼442個氨基酸[12]。研究表明，PPARδ激動劑可通過調(diào)控不同組織中脂質(zhì)代謝、降低血脂水平，使肥胖和糖尿病動物模型的LDL和TG水平趨于正常[13]。IWASHITAA等[14]報道，PPARδ基因敲除小鼠局部腦缺血導(dǎo)致的腦梗死面積較野生型小鼠大，表明PPARδ在腦缺血早期具有保護中樞神經(jīng)的作用。YIN等[15]研究表明，PPARδ在缺血性損傷中可以發(fā)揮腦動脈血管保護作用。BENETTIE等[16]研究表明，PPARδ激動劑對諸如心肌梗死、腦梗死等疾病也產(chǎn)生有益作用。還有研究顯示，PPARδ基因rs9794位點GG/GC基因型與血液中炎癥標(biāo)志物C-反應(yīng)蛋白濃度降低有關(guān)[17]。LI等[18]研究表明，PPARδ基因rs974位點GG/GC基因型及G等位基因可能是原發(fā)性高血壓的保護因素。但是目前尚缺乏PPARδ基因多態(tài)性與LAA型腦梗死的關(guān)聯(lián)研究。

本文結(jié)果顯示，腦梗死組PPARδ基因rs9794位點GG/GC基因型及G等位基因頻率明顯低于對照組，表明攜帶G等位基因能夠明顯降低LAA型腦梗死的發(fā)生風(fēng)險。推測PPARδ基因rs9794多態(tài)性對腦梗死的保護作用可能涉及其抗動脈粥樣硬化作用，但這還需進(jìn)一步研究證實。

大動脈閉塞性疾病是世界范圍內(nèi)缺血性腦梗死的重要原因，但其閉塞部位在不同地區(qū)、人種之間存在明顯差異，顱外血管狹窄引起的腦梗死在白色人種中更常見，而在亞洲人、黑人和西班牙裔腦梗死病人中顱內(nèi)血管狹窄更常見[19]。在中國人群中，腦梗死病人顱內(nèi)、外動脈狹窄的發(fā)生率分別為33%～67%和9.0%～24.1%[20]。本文結(jié)果顯示，LAA型腦梗死病人顱內(nèi)狹窄的發(fā)生率（33.7%）高于顱外狹窄發(fā)生率（24.1%），與以上研究結(jié)果相一致。另外，本研究還對PPARδ基因多態(tài)性與LAA型腦梗死病人腦血管狹窄部位的關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示PPARδ基因多態(tài)性與腦血管狹窄部位無關(guān)。

本研究還進(jìn)一步探討了環(huán)境因素和PPARδ基因rs9794位點GG/GC基因型相互作用對LAA型腦梗死的影響，結(jié)果顯示，不吸煙、無高血壓史、無糖尿病史、無冠心病史人群PPARδ基因rs9794位點GG/GC基因型者發(fā)生腦梗死的危險性明顯降低。表明吸煙、高血壓史、糖尿病史和冠心病史減弱了rs9794位點GG/GC基因型對腦梗死的保護作用。吸煙、糖尿病、高血壓等傳統(tǒng)危險環(huán)境因素均是通過介導(dǎo)血管壁的炎癥反應(yīng)加速動脈粥樣硬化的進(jìn)展，進(jìn)而最終導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生發(fā)展[21]。PPARδ基因可以通過參與調(diào)節(jié)NF-κB核轉(zhuǎn)位、抑制血管炎癥反應(yīng)，發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化作用[4，6]。PPARδ基因rs9794位點GG/GC基因型和吸煙、高血壓、糖尿病等傳統(tǒng)危險環(huán)境因素可能在共同參與動脈粥樣硬化這一病理過程中產(chǎn)生了拮抗作用。因本研究結(jié)果受樣本量、地區(qū)、人種等多因素的影響，所以有必要開展大樣本量和不同種族、地區(qū)的研究，以進(jìn)一步明確PPARδ基因多態(tài)性對中國人群腦梗死的影響。

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