淫羊藿素對LPS誘導原代星形膠質(zhì)細胞COX-2和iNOS基因表達影響

張文娣 張梅 白金月 徐蒙莉 劉慧 陳文芳

[摘要]?目的?探討淫羊藿素（ICT）對脂多糖（LPS）誘導的原代星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的抑制作用及雌激素受體（ER）阻斷劑ICI182，780對其影響。

方法常規(guī)培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，將其分為對照組、LPS組、ICT+LPS組、ICI182，780+ICT+LPS組、ICI182，780組。對照組給予1 g/L二甲基亞砜處理，其余各組在有或無ICT預處理條件下，先加入1 μmol/L的ICI182，780作用1 h，然后加入10 μmol/L的ICT預保護1 h，繼以1 mg/L的LPS作用細胞6 h。應用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測各組環(huán)氧化酶2（COX-2）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表達。

結(jié)果與對照組比較，LPS組COX-2和iNOS基因的表達明顯上調(diào)（F=18.19、394.80，q=8.89、41.74，P<0.01）;ICT預保護能明顯降低由LPS誘導的COX-2和iNOS基因表達的上調(diào)（q=7.44、13.83，P<0.01），此作用可以被ER特異性阻斷劑ICI182，780所阻斷（q=6.80、8.80，P<0.01）;ICI182，780組二者表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

結(jié)論ICT能夠抑制LPS誘導的原代星形膠質(zhì)細胞COX-2和iNOS基因的表達，其抗炎機制與ER途徑的激活有關。

[關鍵詞]?淫羊藿素;脂多糖類;星形細胞;環(huán)氧化酶2;一氧化氮合酶

[中圖分類號]?R338.2;R592

[文獻標志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）01-0032-04

EFFECT OF ICARITIN ON LIPOPOLYSACCHARIDE-INDUCED GENE EXPRESSION OF CYCLOOXYGENASE-2 AND INDU-CIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE IN PRIMARY CULTURED ASTROCYTES

ZHANG Wendi， ZHANG Mei， BAI Jinyue， XU Mengli， LIU Hui， CHEN Wenfang

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， Cnina）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of icaritin （ICT） on lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory response in primary cultured astrocytes and the influence of the estrogen receptor （ER） antagonist ICI182，780.

Methods

Primary cultured astrocytes were obtained with conventional methods and then divided into control group， LPS group， ICT+LPS group， ICI182，780+ICT+LPS group， and ICI182，780 group. The control group was treated with 1 g/L dimethyl sulfoxide; the other groups were treated with 1 μmol/L ICI182，780 for 1 h， followed by 10 μmol/L ICT for pre-protection for 1 hour and 1 mg/L LPS for 6 h， with or without ICT pretreatment. Quantitative real-time PCR was used to measure the gene expression of cycloo-xygenase 2 （COX-2） and inducible nitric oxide synthase （iNOS）.

ResultsCompared with the control group， the LPS group had significantly upregulated mRNA expression of COX-2 and iNOS （F=18.19 and 394.80，q=8.89 and 41.74，P<0.01）. ICT pretreatment significantly inhibited the upregulated mRNA expression of COX-2 and iNOS induced by LPS （q=7.44 and 13.83，P<0.01）， which was blocked by the specific ER antagonist ICI182，780 （q=6.80 and 8.80，P<0.01）. There was no significant difference in the mRNA expression of COX-2 and iNOS between the ICI182，780 group and the control group （P>0.05）.

ConclusionICT can inhibit LPS-induced mRNA expression of COX-2 and iNOS in primary cultured astrocytes， and its anti-inflammatory mechanism might be associated with the activation of the ER pathway.

[KEY WORDS]icaritin; lipopolysaccharides; astrocytes; cyclooxygenase 2; nitric oxide synthase

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣、體積最大的膠質(zhì)細胞[1]，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、支持營養(yǎng)神經(jīng)元、參與免疫應答等方面起著重要作用[2]。星形膠質(zhì)細胞適度激活后可釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用[3]。但過度激活的星形膠質(zhì)細胞會釋放大量的神經(jīng)炎性因子如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-a）和一氧化氮（NO）等[4-5]，引起神經(jīng)系統(tǒng)炎性病變、突觸功能障礙及神經(jīng)元死亡，進而引發(fā)相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、阿爾茨海默病[6]。因此，抑制活化星形膠質(zhì)細胞炎性因子的過度釋放，找到對抗炎癥反應的潛在靶標，對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療具有重要意義。近年來中藥治療神經(jīng)炎癥反應的研究取得了一定的進展，淫羊藿素（ICT）作為傳統(tǒng)補益中藥淫羊藿苷的水解衍生物，能夠發(fā)揮雌激素樣的神經(jīng)保護和抗炎作用[7]。已有研究證實，在體外細胞水平ICT具有抗炎作用，能夠抑制脂多糖（LPS）誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、NO和前列腺素E2（PGE2）;在整體動物水平，ICT能夠降低LPS誘導的C57BL/6J小鼠炎癥模型血清中TNF-α和PGE2的水平及嗜中性粒細胞CD11b的表達[8-9]。此外，ICT能夠通過雌激素依賴的信號途徑對抗β淀粉樣蛋白誘導的原代大鼠神經(jīng)元毒性反應[10]。那么，ICT能否通過雌激素受體（ER）抑制星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應，目前尚不清楚。本研究應用LPS制備原代星形膠質(zhì)細胞的炎癥模型，觀察ICT對LPS誘導的COX-2和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因表達的影響以及ER特異性阻斷劑的阻斷效應，以期為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關疾病的治療提供新靶點。

1?材料與方法

1.1?材料及其來源

ICT購于上海同田生物公司;DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;LPS和ICI182，780由美國Sigma公司提供;TRIzol購自美國Life Technologies公司;PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司;SYBR Green購自美國Takara公司;新生SD大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2?細胞培養(yǎng)及分組

顯微鏡下分離新生SD大鼠中腦，將其置于含有高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，去除腦膜和血管，分別用1 000、200、10 μL槍頭輕輕吹打，使腦組織呈離散狀態(tài)，收集細胞懸液至大離心管中，離心，棄上清，加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，將細胞接種到培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中差速黏附處理30 min，更換新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，待細胞長滿瓶底時，置于37 ℃搖床中以210 r/min振蕩16～18 h，更換新鮮培養(yǎng)液，用胰酶消化法收集細胞進行實驗。將原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞分為對照組（A組）、LPS組（B組）、ICT+LPS組（C組）、ICI182，780+ICT+LPS組（D組）以及ICI182，780組（E組）。對照組給予1 g/L的二甲基亞砜處理;LPS組加入1 mg/L的LPS作用6 h;ICT+LPS組在加LPS前先用10 μmol/L的ICT預保護1 h;ICI182，780組和ICI182，780+ICT+LPS組均加入1 μmol/L的ICI182，780作用細胞1 h，然后ICI182，780+ICT+LPS組加入ICT預保護1 h，再加入LPS作用6 h。

1.3實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測COX-2和iNOS mRNA水平

采用Trizol法提取總RNA，取2 μg總RNA加入1 μL錨定的寡聚（dT）18引物和DEPC水，使總體積達到13 μL，55 ℃變性10 min;加入7 μL的反應體系（內(nèi)含逆轉(zhuǎn)錄酶RT 0.5 μL、RNase抑制劑0.5 μL、緩沖液4.0 μL、dNTP 2.0 μL），55 ℃作用30 min，繼以85 ℃作用5 min逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量檢測COX-2、iNOS和GAPDH的基因表達[11]。大鼠原代星形膠質(zhì)細胞擴增引物及其序列見表1。采用2-△△CT法計算基因相對表達量。

1.4?統(tǒng)計學處理

實驗所得計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，應用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Tukey法進行兩兩比較。以P<0.05為差異有顯著性。

2?結(jié)??果

與對照組相比，LPS組COX-2和iNOS基因表達明顯上調(diào)（F=18.19、394.80，q=8.89、41.74，P<0.01）;ICT+LPS組COX-2和iNOS基因表達水平較LPS組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（q=7.44、13.83，P<0.01）;而ICT的抗炎作用可以被ICI182，780所阻斷，ICI182，780+ICT+LPS組COX-2和iNOS基因表達較ICT+LPS組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（q=6.80、8.80，P<0.01）;ICI182，780組二者表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3?討??論

研究表明，星形膠質(zhì)細胞通過合成和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子以及細胞因子，參與神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應[12]。在腦缺血、損傷或感染等病理情況下，星形膠質(zhì)細胞被激活，激活后的星形膠質(zhì)細胞釋放大量的炎性因子（如TNF-α、IL-6、NO、PGE2等），這些炎性因子作用于鄰近的細胞引起炎癥反應，造成神經(jīng)元損傷[13-14]。因此，有效抑制星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應，減少炎性因子的釋放，將對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病以及炎癥相關病變起到有效的治療作用[15]。

淫羊藿是傳統(tǒng)的中藥材，具有補腎壯陽、強筋骨等作用[16]。ICT是淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷的衍生物，能發(fā)揮類雌激素樣的神經(jīng)保護和抗炎作用[17]。本課題組在前期工作中已經(jīng)證實，ICT能夠?qū)筂PP+誘導的MES23.5細胞損傷[11]。LPS作為革蘭陰性菌細胞壁的組成成分，具有很強的致炎作用，可以與細胞膜上的Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，通過NF-κB與MAPKs信號通路介導原代星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應[18-19]。本實驗應用LPS制備原代星形膠質(zhì)細胞的炎癥模型，結(jié)果顯示，應用1 mg/L的LPS處理原代星形膠質(zhì)細胞，能夠顯著提高COX-2和iNOS的基因表達。COX-2在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，是前列腺素合成的關鍵限速酶，可以催化細胞產(chǎn)生前列腺素，參與炎癥反應[20]。iNOS能夠催化產(chǎn)生促炎因子NO[4]。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展及雌激素在臨床上的廣泛應用[21]，對ER介導的信號轉(zhuǎn)導途徑及其作用的研究日趨活躍[22]。雌激素可通過核受體ERα和ERβ介導的基因組途徑，發(fā)揮多種生理作用[23]。有研究顯示，ICT能夠促進乳癌MCF-7細胞增殖，進一步的機制研究揭示ICT對MCF-7、T47D乳癌細胞的促增殖作用與ER有關[24]。在神經(jīng)系統(tǒng)，ICT能夠通過雌激素依賴的信號途徑對抗β淀粉樣蛋白誘導的原代大鼠神經(jīng)元的毒性反應[10]。但在原代星形膠

質(zhì)細胞，ICT是否通過ER發(fā)揮其抗炎作用，目前尚

未見報道。本實驗研究結(jié)果顯示，用10 μmol/L的ICT預保護原代星形膠質(zhì)細胞，能夠明顯抑制LPS誘導的COX-2和iNOS基因表達上調(diào)，提示ICT對原代星形膠質(zhì)細胞具有明顯的抗炎作用;而進一步的實驗結(jié)果也顯示，應用核受體ER特異性阻斷劑ICI182，780能夠阻斷ICT的抗炎作用，表明ER參與了ICT的抗炎作用。

綜上所述，ICT能夠抑制LPS誘導的原代星形膠質(zhì)細胞COX-2和iNOS基因的表達，其抗炎機制與ER信號途徑的激活有關。

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