凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥病蝦與健康蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌群比較分析

蔣葛 沈輝 萬(wàn)夕和 喬毅 黎慧 王李寶 史文軍

摘要：為研究急性肝胰腺壞死綜合征（Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNs）病原對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響，獲取更多的AHPNs防治基礎(chǔ)資料，采用PcR-RFTJP方法比較了江蘇地區(qū)患AHPNs病蝦和健康對(duì)蝦腸道微生物群落。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)階段病蝦腸道中均只有弧菌屬細(xì)菌;對(duì)照的健康對(duì)蝦中，幼蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬、食酸菌屬和固氮螺菌屬細(xì)菌;養(yǎng)殖中期對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為發(fā)光桿菌屬、弧菌屬和希瓦氏菌屬細(xì)菌;養(yǎng)殖后期對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬、紅桿菌屬、萊茵海默氏菌屬細(xì)菌。研究結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦患AHPNs后腸道微生物群落明顯不同于健康對(duì)蝦，腸道菌群多樣性遭到破壞，弧菌為腸道內(nèi)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，不同生長(zhǎng)階段健康對(duì)蝦的腸道優(yōu)勢(shì)菌存在差異。本研究探究了AhPNs病原對(duì)于凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響，并為認(rèn)識(shí)和防控AHPNs提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥：凡納濱對(duì)蝦：腸道微生態(tài)

中圖分類(lèi)號(hào)：s945.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-4440（2019）01-0142-07

急性肝胰腺壞死綜合征（Acute hepatopancreaticnecrosis syndrome，AHPNS）是近年來(lái)影響凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一種重要疾病。2009年該病在中國(guó)海南省發(fā)生，越南、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、菲律賓相繼暴發(fā)該病。2011年以來(lái)，AHPNS在中國(guó)廣東、廣西、福建、江蘇等對(duì)蝦主產(chǎn)區(qū)蔓延，造成凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)量銳減：泰國(guó)、越南、墨西哥等凡納濱對(duì)蝦主產(chǎn)國(guó)的對(duì)蝦產(chǎn)量也因該病的發(fā)生而受到嚴(yán)重影響。

凡納濱對(duì)蝦發(fā)生AHPNS后體色發(fā)白，蝦殼變軟，攝食明顯減少，活力減弱，行動(dòng)遲緩。對(duì)蝦感染前期肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發(fā)紅，異常肥大：感染后期肝胰腺明顯萎縮，空腸空胃。苗種感染10d就可發(fā)病死亡，發(fā)病3 d內(nèi)死亡率可達(dá)100%。有研究結(jié)果顯示，一類(lèi)攜帶有特定致病基因PirA和PirB的弧菌屬細(xì)菌是該病發(fā)生的病原，其中主要是副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus）。病原弧菌含有的PiM和PirB基因會(huì)產(chǎn)生一種獨(dú)特的二元毒素，使靶細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變，導(dǎo)致感染對(duì)象死亡。Pi-ra和PirB位于一段69 kb大小的隱藏質(zhì)粒“pVAl”上，該質(zhì)粒含有轉(zhuǎn)座子基因，能發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是AHPNS近年來(lái)傳播較快的主要原因。目前，尚未見(jiàn)AHPNS有效治愈的報(bào)道。

腸道菌群在維持對(duì)蝦健康中發(fā)揮著重要作用，對(duì)對(duì)蝦的生長(zhǎng)與免疫具有重要影響。對(duì)蝦腸道菌群不僅可以分泌蝦體所需的營(yíng)養(yǎng)素，而且可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥抵抗病原微生物的侵襲，通過(guò)分析腸道菌群，可了解凡納濱對(duì)蝦的健康狀況。目前相關(guān)研究?jī)H限于正常對(duì)蝦腸道菌群，且僅見(jiàn)于飼料添加劑、微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群的影響方面，關(guān)于特定病原對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響報(bào)道較少。本研究通過(guò)健康對(duì)蝦與AHPNS病蝦的腸道細(xì)菌群落比較，研究AHPNS病蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，可以從腸道微生態(tài)調(diào)控的角度為該病的防控提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)對(duì)蝦3份疑似AHPNS病蝦樣品（BSl～BS3）來(lái)源于江蘇省如東市3處出現(xiàn)大規(guī)模-對(duì)蝦暴死的養(yǎng)殖場(chǎng)，表現(xiàn)為肝胰腺萎縮，空腸空胃，瀕死癥狀。對(duì)照樣品來(lái)自相同養(yǎng)殖場(chǎng)同批正常對(duì)蝦（表1），樣品采集后冷藏，24h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。每份樣品取6只對(duì)蝦個(gè)體，測(cè)量體長(zhǎng)并計(jì)算均值：無(wú)菌操作分離對(duì)蝦腸道，清除內(nèi)容物，取6只對(duì)蝦的腸道混合為一個(gè)樣品，滅菌生理鹽水沖洗內(nèi)表面后置于離心管中，研磨成勻漿，80℃冷凍備用。

1.1.2主要試劑Taq DNA聚合酶、dNTPs、DLl00DNA marker、PMDl9-T克隆試劑盒和限制性?xún)?nèi)切酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。DNA提取試劑盒（3S DNA Isolation Kit V2.2）、DNA膠回收試劑盒為上海博彩生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

研究發(fā)現(xiàn)，AHPNS病蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu)單一，弧菌屬細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。有研究結(jié)果表明，白斑綜合征病毒（WhKe叩ot syndrome virus，WSSV）僅僅使得腸道菌群中各種屬細(xì)菌的數(shù)目和比例發(fā)生了改變，腸道菌群多樣性并未發(fā)生明顯變化，而AHPNS病原菌相較于WSSV，對(duì)于對(duì)蝦腸道菌群的影響更大，其造成腸道菌群結(jié)構(gòu)崩潰，印證了AHPNS引發(fā)高死亡率的特點(diǎn)。PiWAB基因編碼的二元蛋白毒素可插入感染對(duì)象的細(xì)胞膜上形成穿?？锥?，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的改變，使靶細(xì)胞損傷甚至死亡。本研究中病蝦腸道近乎透明，腸道細(xì)窄，韌性消失，無(wú)內(nèi)容物。AHPNS病原菌的毒力極強(qiáng)，進(jìn)入對(duì)蝦腸道后，分泌毒素，對(duì)蝦腸道細(xì)胞不斷壞死脫落，腸道細(xì)菌可能隨著壞死的腸黏膜和糞便一起排出體外，病蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)被完全破壞。腸道菌群對(duì)于對(duì)蝦的生長(zhǎng)和抗病具有重要作用，堪稱(chēng)是對(duì)蝦的另類(lèi)“器官”，若腸道菌群結(jié)構(gòu)被完全破壞，則對(duì)蝦的消化和抗病能力受到顯著影響。

蝦類(lèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)與其所處的生長(zhǎng)階段、生長(zhǎng)環(huán)境以及健康狀況有關(guān)。吳金鳳等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病對(duì)蝦腸道菌群多樣性顯著降低，孫振麗等通過(guò)高通量測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群與池塘底泥及水體菌群關(guān)系密切。水生動(dòng)物通過(guò)攝食將環(huán)境微生物和藻類(lèi)攝入腸道，某些細(xì)菌被排出體外，部分細(xì)菌定殖于腸道。對(duì)蝦養(yǎng)殖水體以及自然水體中的主要優(yōu)勢(shì)菌群為a-變形細(xì)菌綱和y-變形細(xì)菌綱細(xì)菌，凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)細(xì)菌，主要包含弧菌屬、假單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬等細(xì)菌。本研究中健康對(duì)蝦ZCl、ZC2樣品為20日齡和50日齡的對(duì)蝦群體，腸道菌群受水體菌群影響，優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬、發(fā)光桿菌屬、紅桿菌屬細(xì)菌，歸屬于a-變形細(xì)菌綱和y-變形細(xì)菌綱。對(duì)蝦腸道菌群的組成是動(dòng)態(tài)變化的，不同生長(zhǎng)階段對(duì)蝦腸道菌群的組成也有較大的區(qū)別。蝦卵、糠蝦與幼蝦階段的蝦體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為紅環(huán)菌科、柄桿菌目、伯克氏菌目、黃桿菌目、腸桿菌科、假單胞菌科細(xì)菌，弧菌屬細(xì)菌為劣勢(shì)菌。這與本研究的研究結(jié)果相近，ZC3樣品為幼蝦，腸道中優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬、食酸菌屬、短波單胞菌屬和固氮螺菌屬細(xì)菌。在分類(lèi)地位上，食酸菌屬歸屬于伯克氏菌目，固氮螺菌屬歸屬于紅環(huán)菌科，短波單胞菌屬則歸屬柄桿菌目。浮霉菌屬細(xì)菌是腸道優(yōu)勢(shì)菌群，吳定心首次發(fā)現(xiàn)浮霉菌綱（Planctomycetacia）細(xì)菌為凡納濱對(duì)蝦腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌，并認(rèn)為厭氧氨氧化細(xì)菌來(lái)自該綱，對(duì)氮循環(huán)起到一定作用?；【鷮倥c發(fā)光桿菌屬是條件致病菌，當(dāng)凡納濱對(duì)蝦受到氨氮等環(huán)境因子以及其他病原脅迫時(shí)，可能發(fā)生繼發(fā)性感染，發(fā)生多種病原毒力疊加。

本研究采用PCR-RFLP法研究了急性肝胰腺壞死綜合癥對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康凡納濱對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬、紅桿菌屬、萊茵海默氏菌屬、發(fā)光桿菌屬、弧菌屬等細(xì)菌，而凡納濱對(duì)蝦發(fā)生AHPNs后腸道菌群結(jié)構(gòu)單一，腸道中弧菌屬細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。