四川兔病毒性出血癥2型的分子生物學診斷

陳斌 ，周明忠*，王澤洲，丁夢蝶，張毅，李麗，陳冬，岳建國

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省成都市動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041）

兔病毒性出血癥2 型（RHD2），又稱兔瘟2型，是由兔出血癥病毒2型（RHDV2）引起的危害家兔和野兔的一種高度傳染性、急性致死性疫病。RHDV2 是一種新型的兔出血癥病毒（RHDV）毒株，主要危害15 日齡以上的家兔和野兔，引起的臨床癥狀與經(jīng)典兔病毒性出血癥（RHD）相似，但毒株特性差異較大，經(jīng)典RHDV 疫苗幾乎不能預防家兔感染。RHD2于2010年4月在法國首次報道［1］，隨后在葡萄牙、意大利、西班牙等歐洲國家傳播，并進一步傳播到美洲和大洋洲［2］。RHD2 是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定通報疫病，在我國屬于二類動物疫病，病兔的死亡率為5%～70%。

1 發(fā)病情況

2020 年4 月，四川省成都市金堂縣兩個兔場出現(xiàn)家兔異常死亡。兔場A 發(fā)病前存欄家兔2 500余只，死亡1 000余只，發(fā)病后緊急接種兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌二聯(lián)蜂膠滅活疫苗。兔場B 發(fā)病前存欄家兔1 000余只，死亡500多只，發(fā)病后緊急接種兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗（VP60 株）。在接種疫苗后兩兔場的發(fā)病及死亡情況均未好轉。

2 臨床癥狀和剖檢病變

兩兔場病死兔的臨床癥狀和剖檢病變均相似。臨床癥狀主要表現(xiàn)為厭食、反應遲鈍、嗜睡、拉?。S便顏色呈黃色），有的出現(xiàn)癥狀后1～2 h即死亡；剖檢可見全身實質器官出血、淤血、腫大，肝臟、脾臟邊緣梗死等。

3 實驗室診斷

綜合發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變以及兔病毒性出血癥疫苗免疫無效，懷疑兩兔場為RHDV2感染。從兩兔場分別采集2 只病死家兔的肝臟、脾臟等臟器進行實驗室檢測。

3.1 病毒RNA 提取 用無菌剪刀分別剪取每只病死兔的肝和脾等臟器，混合，加入1 mL 滅菌PBS（pH7.2）和研磨介質，在組織破碎儀中進行勻漿，取出后8 000 r/min 離心2 min，取上清用于RNA 提取。使用核酸提取試劑盒（磁珠法）和核酸自動提取儀進行核酸提取。

3.2 RT-PCR 擴增 參考2018 版OIE《陸生動物衛(wèi)生法典》，使用OIE 推薦的RHDV2 特異性引物進行VP60 基因片段擴增，上游引物序列為5′-GAATGTGCTTGAGTTYTGGTA-3′，下游引物序列為5′-CAAGTCCCAGTCCRATRAA-3′，擴增產(chǎn)物長度約794 bp［3］。RT-PCR擴增反應體系：10 μL 2×1 step buffer、0.8 μL Enzyme mix、上下游引物各0.5 μL（20 μmol）、2 μL RNA、6.2 μL RNase Free H2O，反應總體積為20 μL。RT-PCR反應采用一步法，反應條件：50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃50 s，35 個循環(huán)；72 ℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3.3 序列分析 RT-PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳確認有目的條帶后送上海生工進行測序。將測序結果輸入Blast中進行序列比對，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載部分RHDV2 和經(jīng)典RHDV 毒株序列，采用Larsergene 軟件MegAlign 進行核苷酸同源性分析，用MEGA6 軟件Neighbor-Joining 法進行遺傳變異分析。

4 結果

4.1 RT-PCR 擴增 電泳結果（圖1）顯示，從兩兔場病死兔的組織混合樣品中均擴增出約800 bp的特異性條帶，與預期大?。?94 bp）一致。

圖1 兔出血癥病毒2型（RHDV2）的RT-PCR電泳結果

4.2 序列分析 經(jīng)測序和Blast 比對，結果顯示來自兩個發(fā)病兔場的2 條序列均與RHDV2 參考毒株的VP60 部分序列高度同源，其中同源性最高的是荷蘭RHDV2 分離株RHDV2-NL2016（GenBank登錄號MN061492.1），分別為98.01%和97.95%。MegAlign 分析結果（圖2）顯示2 條序列的核苷酸同源性為99.1%，與RHDV2 毒株VP60基因片段的核苷酸序列同源性為94.1%～98.3%，與經(jīng)典RHDV 毒株VP60 基因片段的核苷酸序列同源性為79.0%～80.0%。遺傳進化分析結果（圖3）也顯示2條序列與RHDV2毒株在同一分支上，親緣關系較近，而與經(jīng)典RHDV 毒株的親緣關系則較遠。綜合上述結果，確定兩發(fā)病兔場的病死兔均為RHDV2感染，并將兔場A和兔場B家兔組織病料中的RHDV2 毒株分別命名為SCADCJT01和SCADC-JT02。

5 討論

兔瘟2 型與經(jīng)典兔瘟的臨床癥狀相似，從發(fā)病情況和癥狀上難以區(qū)分，需要進行實驗室鑒別診斷。對于兔瘟病毒2 型的檢測，目前國內尚無相關的商品化試劑盒。本次檢測使用的是OIE《陸生動物衛(wèi)生法典》推薦的RHDV2 特異性引物，該對引物能夠從病死兔組織樣品中擴增出特異性條帶，說明其適用于本次RHD2 疫情的分子流行病學調查。

兔瘟2 型主要在歐洲國家流行，此次是我國首次官方確診RHD2 疫情［4］。四川為內陸省份，兩發(fā)病兔場又位于遠離市中心的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，人員流動較少，且兩場均有引種史，分析此次RHDV2感染可能與引種有關。此外，兩發(fā)病兔場位于同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)，來自兩場的2 條VP60 部分序列的同源性高達99.1%，表明兩發(fā)病兔場可能有相同的病原源頭。

圖2 VP60基因部分核苷酸序列的同源性分析結果

圖3 VP60基因部分核苷酸序列的遺傳進化樹

兔瘟2 型曾在澳大利亞迅速傳播和流行，表現(xiàn)出比經(jīng)典兔瘟更強的傳播力與致病性，并且逐漸取代了經(jīng)典兔瘟［5］。養(yǎng)兔業(yè)是四川省畜牧業(yè)的重要組成部分，經(jīng)典兔瘟疫苗不能對兔瘟2 型進行有效保護，兔瘟2型一旦流行，將會對全省養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，因此對該病必須給予高度重視。為防止病原擴散，對兩兔場所有剩余存欄兔立即進行了撲殺和集中無害化處理，對飼養(yǎng)相關用具、飼料、墊料、糞污等嚴格限制移動，并進行徹底的清理、消毒、清洗和再消毒。同時，對兩兔場的飼養(yǎng)區(qū)、生活區(qū)及周圍環(huán)境進行了徹底消毒，并限制兩兔場周邊3 km 范圍內所有家兔的移動和交易。此外，應加強全省兔瘟2 型的流行病學調查，積極開展排查和監(jiān)測工作，并加快相關疫苗研制，切實為兔瘟2 型的防控提供保障。