樟子松針葉化學(xué)成分研究

張文治 韓松 王劍 付美玲 龐婧慧 白麗明

摘?要：該研究以采自黑龍江省齊齊哈爾市的樟子松（Pinus sylvestris） 針葉為對(duì)象，采用溶劑提取法對(duì)樟子松針葉中的化學(xué)成分進(jìn)行提取，應(yīng)用硅膠柱色譜、制備薄層色譜和高效液相色譜等現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)提取浸膏中的化學(xué)成分進(jìn)行分離和純化，運(yùn)用質(zhì)譜，核磁（1H-NMR和13C-NMR） 等波譜技術(shù)，鑒定了化合物結(jié)構(gòu)，并對(duì)提取浸膏的抑菌活性進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明：從樟子松針葉提取物中分離得到15個(gè)化合物，分別鑒定為松葉酸（1）、松葉酸甲酯（2）、18α-acetoxylabd-8（17）-en-15-oic acid（3）、4-eplimbricataloic acid（4）、15-乙基-18-松葉酸甲酯（5）、15-acetoxy-labda-8（17），13E-dien-18-al（6）、7β-羥基脫氫樅酸（7）、7α-羥基脫氫樅酸（8）、endo-peroxide（9）、α-杜松醇（10）、β-谷甾醇（11）、鄰苯二甲酸二丁酯（12）、7R，11R-phytol（13）、正二十四烷醇（14）、N-octacosan7β-ol（15）。其中，化合物9，13，14和15為首次從該屬植物中分離得到。抑菌活性結(jié)果表明，正己烷萃取浸膏在濃度為5～100 mg·mL-1時(shí)對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢菌的抑菌率分別為53%～71%和56%～70%，在濃度為50 mg·mL-1和100 mg·mL-1時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為51%和69%。該研究課題進(jìn)一步明確了樟子松針葉中的化學(xué)成分，為其活性測(cè)試及應(yīng)用研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：樟子松針葉， 化學(xué)成分， 抑菌活性， 松葉酸， 7-羥基脫氫樅酸， 杜松醇

中圖分類號(hào)：Q946.91

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）11-1496-09

Abstract：The chemical constituents of Pinus sylvestris needles collected from Qiqihar City in Heilongjiang Province were studied. The chemical components in the needles were extracted by solvent method. The use of column chromatography， prepared TLC， and HPLC technique led to the separation and purification of the chemical constituents in the extract. The structures for the isolated pure compounds were elucidated by analysis of spectroscopic of MS and NMR（1H-NMR and 13C-NMR）. The antibacterial activity of the extract was also scanned. The results were as follows：15 compounds were isolated and identified as pinifolic acid（1）， monomethyl pinifolate（2）， 18α-acetoxylabd-8（17）-en-15-oic acid（3）， 4-eplimbricataloic acid（4）， 15-ethyl-18-methyl pinifolate（5）， 15-acetoxy-labda-8（17）， 13E-dien-18-al（6）， 7β-hydroxydehydroabietic acid（7）， 7α-hydroxydehydroabietic acid（8）， endo-peroxide（9）， α-cadinol（10）， β-sitosterol（11）， dibutyl phthalate（12）， 7R，11R-phytol（13）， tetracosanol（14）， and N-octacosan7β-ol（15）. Compounds 9， 13， 14， and 15 were isolated from the genus Pinus for the first time. The result of antibacterial activity indicated that the inhibition rate of hexane extract to Escherichia coli and Bacillus subtilis was 53%-71% and 56%-70%， respectively， on the concentration range of 5-100 mg·mL-1. And the inhibition rate to Staphylococcus aureus was 51% and 69% on the concentration of 50 mg·mL-1 and 100 mg·mL-1， respectively. This research reported the isolated chemical constituents from Pinus sylvestris needles which will provide theoretical basis for the further investigation of active components and application of drugs.

Key words：Pinus sylvestris needles， chemical constituents， antibacterial activity， pinifolic acid， 7-hydroxydehydroabietic acid， cadinol

樟子松（Pinus sylvestris var.mongholica） 又稱海拉爾松，系松科松屬多年生高大常綠喬木，集中分布于我國(guó)東北及內(nèi)蒙古地區(qū)（中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1996）。其針葉部分主要含有單萜、倍半萜類揮發(fā)油（潘寧等，1992;由曉峰等，2010;薄采穎等，2010;劉敏莉等，2011）和二萜類成分（張蓉等，2006）。針葉油具有抗腫瘤（張蓉等，2006;Chen et al.，2014）、抗氧化（Ka et al.，2005;Jeong et al.，2009）、抗衰老（陳長(zhǎng)武等，2005）、抗炎（Karonen et al.，2004）、抑菌（曾維才等，2009）、抗甲型流感病毒（魏鳳香等，2008）、抗突變（孔志明等，1995）等生物活性;治療風(fēng)寒痹癥（陳英等，2012）、免疫力低下（董朱等，2018）、緩解高血壓（桑育黎等，2018）、改善心功能（李從陽(yáng)等，2006）等藥理作用，是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的中藥材。

為深入了解樟子松針葉的化學(xué)成分，進(jìn)一步探討該植物的藥理活性作用，本課題組對(duì)樟子松針葉正己烷萃取物的化學(xué)成分及抑菌活性進(jìn)行研究，從中分離得到15個(gè)單體化合物，分別鑒定為松葉酸（1）、松葉酸甲酯（2）、18α-acetoxylabd-8（17）-en-15-oic acid（3）、4-eplimbricataloic acid（4）、15-乙基-18-松葉酸甲酯（5）、15-acetoxy-labda-8（17），13E-dien-18-al（6）、7β-羥基脫氫樅酸（7）、7α-羥基脫氫樅酸（8）、endo-peroxide（9）、α-杜松醇（10）、β-谷甾醇（11）、鄰苯二甲酸二丁酯（12）、7R，11R-phytol（13）、正二十四烷醇（14）、N-octacosan7β-ol（15）。其中，化合物9，13，14和15為首次從該屬植物中分離得到。不同濃度正己烷萃取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性。本文報(bào)道樟子松針葉正己烷萃取物化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定及抑菌活性。

1?材料與方法

1.1 供試材料、試劑和儀器

1.1.1 供試材料?樟子松針葉，于2016 年 9 月采集于黑龍江省齊齊哈爾市，經(jīng)齊齊哈爾大學(xué)張樹軍教授鑒定為樟子松（Pinus sylvestris var. mongholica）針葉。

1.1.2 供試菌種?大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），供試菌種由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.3 供試試劑?胰蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、氯化鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），除高效液相色譜使用的溶劑為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）外，其他溶劑均為分析純（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器?Bruker AV-600核磁共振儀（美國(guó)Bruker公司）;Agilent 5988A質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）;Waters 2489高效液相色譜系統(tǒng)（Waters科技上海有限公司）;200～300目硅膠及薄層色譜板（青島海洋化工廠）;Yanako熔點(diǎn)儀（北京泰克儀器有限公司）;YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;SW-CJ-LED型超凈工作臺(tái)（上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）;MIR-253型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取和萃取?取干燥樟子松針葉11 kg，用無(wú)水乙醇浸泡3次，合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，得到浸膏304 g。將浸膏溶于水中形成混懸溶液，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次。分別合并各部位萃取液，減壓蒸餾回收溶劑，得到正己烷萃取物（85 g）、乙酸乙酯萃取物（82 g）和正丁醇萃取物（44 g）。

1.2.2 分離純化?正己烷萃取物（85 g）經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行梯度洗脫（正己烷∶乙酸乙酯=100∶0～0∶100），經(jīng)薄層色譜監(jiān)測(cè)得到5個(gè)流分（Fr.1-5），F(xiàn)r.3經(jīng)硅膠柱色譜分離（正己烷∶乙酸乙酯=7∶3，4∶6，2∶8），得到3個(gè)流分（Fr.3.1-3.3），F(xiàn)r.3.2經(jīng)HPLC[Cosmosil 5C18 AR-II（10 mm ×?250 mm），水∶甲醇=5∶95，流速2 mL·min-1]得到化合物1（12.5 mg），化合物2（9.6 mg）和化合物3（9.4 mg），F(xiàn)r.2經(jīng)硅膠柱色譜分離（正己烷∶乙酸乙酯=8∶2，6∶4，4∶6，2∶8）得到化合物4（7.4 mg）、化合物5（7.8 mg）和化合物6（32.4 mg），F(xiàn)r.4經(jīng)硅膠柱色譜分離（正己烷∶乙酸乙酯=6∶4，4∶6，2∶8），得到3個(gè)流分（Fr.4.1-4.3），F(xiàn)r.4.2經(jīng)重結(jié)晶（乙酸乙酯）得到化合物7（12.4 mg）和化合物8（32.4 mg），F(xiàn)r.4.3經(jīng)HPLC[Cosmosil 5C18 AR-II（10 mm ×?250 mm），水∶甲醇=15∶85，流速2 mL·min-1]得到化合物9（23.6 mg），F(xiàn)r.1經(jīng)硅膠柱色譜分離（正己烷∶乙酸乙酯=1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，2∶8），得到5個(gè)流分（Fr.1.1-1.5），F(xiàn)r.1.2經(jīng)HPLC[Cosmosil 5C18 AR-II（10 mm × 250 mm），水∶甲醇=5∶95，流速2 mL·min-1]得到化合物10（23.6 mg），F(xiàn)r.1.3經(jīng)過(guò)重結(jié)晶（乙酸乙酯）得到化合物11（17.5 mg），F(xiàn)r.1.4經(jīng)過(guò)重結(jié)晶（乙酸乙酯）得到化合物12（7.4 mg），F(xiàn)r.1.5經(jīng)HPLC[Cosmosil 5C18 AR-II（10 mm × 250 mm），水∶甲醇=5∶95，流速2 mL·min-1]得到化合物13（15.2 mg），化合物14（12.3 mg）和化合物15（15.2 mg）。

1.2.3 抑菌活性實(shí)驗(yàn)?將正己烷萃取物以丙酮為溶劑，配制濃度分別為100、50、25、10、5 mg·mL-1溶液，用于抑菌活性測(cè)定。采用LB培養(yǎng)基，通過(guò)平板培養(yǎng)皿培養(yǎng)法，對(duì)上述不同濃度萃取物藥液進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，以丙酮作對(duì)照，每組3次平行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)對(duì)照組的菌落直徑長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底部的3/4時(shí)，用十字交叉法（於祥和陳婭芳，2018;鄭鋒等，2016）測(cè)量菌落直徑，并通過(guò)以下公式計(jì)算抑菌率。

菌落直徑（cm）=直徑平均數(shù)-0.4（菌餅的直徑）;

抑制率（%）=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100。

2?結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1?黃色無(wú)定型粉末（乙酸乙酯），mp=246 ～ 268 ℃， EI-MS m/z：336[M]+， 分子式為C20H32O4， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3）?δ：0.71（3H， s， H-20）， 0.98（3H， d， J= 6.6 HZ， H-16）， 1.15（3H， s， H-19）， 4.50（1H， br s， H-17a）， 4.82（1H， br s， H-17b）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.7（q， C-20）， 16.3（q， C-19）， 18.4（t， C-2）， 20.0（q， C-16）， 20.7（t， C-11）， 26.8（t， C-6）， 30.8（d， C-13）， 35.6（t， C-12）， 37.1（t， C-3）， 37.8（t， C-7）， 38.0（t， C-1）， 39.0（s， C-10）， 41.1（t， C-14）， 47.5（s， C-4）， 49.6（d， C-5）， 57.0（d， C-9）， 107.0（t， C-17）， 147.9（s， C-8）， 178.6（s， C-15）， 184.4（s， C-18）。與文獻(xiàn)（Carreras et al.，1998） 數(shù)據(jù)基本一致，因此，鑒定化合物1為松葉酸。

化合物2?白色粉末（乙酸乙酯），mp=216～218 ℃， EI-MS m/z：350[M]+， 分子式為C21H34O4， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.98（3H， d， J= 7.1 Hz， H-16）， 1.14（3H， s， H-19）， 2.72（3H， s， H-20）， 3.66（3H， s， H-21）， 4.49（1H， br s，?H-17a）， 4.82（1H， br s， H-17b）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.7（q， C-20）， 16.6（q， C-19）， 18.5（t， C-2）， 19.9（q， C-16）， 20.8（t， C-11）， 26.8（t， C-6）， 31.0（d， C-13）， 35.8（t， C-12）， 37.0（t， C-7）， 37.9（t， C-1）， 38.1（t， C-3）， 39.1（s， C-10）， 41.6（t， C-14）， 47.8（s， C-4）， 49.9（d， C-5）， 51.9（q， C-21）， 57.1（d， C-9）， 106.9（t， C-17）， 148.0（s， C-8）， 179.35（s， C-15）， 179.4（s， C-18）。與文獻(xiàn)（Zinkel et al.，1985）報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2為monomethyl pinifolate。

化合物3?白色無(wú)定形粉末（乙酸乙酯），mp=217 ～ 219 ℃， EI-MS m/z：364[M]+， 分子式為C22H36O4， 1H-NMR（600 MHz， CDC13） δ：0.72（3H， s， H-20）， 0.88（3H， s， H-19）， 0.97（3H， J= 6.3 Hz， H-16）， 2.04（3H， s， H-22）， 3.71（1H， d， J= 10.9 Hz， H-18a）， 3.82（1H， d， J= 10.9 Hz， H-18b）， 4.49（1H， br s， H-17a）， 4.82（1H， br s， H-17b）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.9（q， C-20）， 17.5（q， C-19）， 18.5（t， C-2）， 19.9（q， C-16）， 21.0（q， C-22）， 21.1（t， C-11）， 24.3（t， C-6）， 30.9（d， C-13）， 35.8（t， C-12）， 35.9（t， C-3）， 36.9（s， C-4）， 38.0（t， C-7）， 38.5（t， C-1）， 39.6（s， C-10）， 41.4（t， C-14）， 49.5（d， C-5）， 57.2（d， C-9）， 73.0（t， C-18）， 106.7（t， C-17）， 148.1（s， C-8）， 171.3（s， C-21）， 179.2（s， C-15）。與文獻(xiàn)（Francesca et al.，1999）報(bào)道的基本一致，因此，鑒定化合物3為18α-acetoxylabd-8（17）-en-15-oic acid。

化合物4?黃色無(wú)定型粉末（乙酸乙酯），mp=224 ～ 226 ℃， EI-MS m/z：320[M]+， 分子式為C20H32O3， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.71（3H， s， H-20）， 0.98（3H， d， J= 6.6 HZ， H-16）， 1.14（3H， s， H-19）， 4.49（1H， br s， H-17a）， 4.83（1H， br s， H-17b）， 9.76（1H， s， H-15）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.7（q， C-20）， 16.4（q， C-19）， 18.4（t， C-2）， 20.18（t， C-11）， 20.2（q， C-16）， 26.8（t， C-6）， 28.9（d， C-13）， 36.0（t， C-12）， 37.1（t， C-7）， 37.15（t， C-3）， 38.0（t， C-1）， 39.0（s， C-10）， 47.5（s， C-4）， 49.6（d， C-5）， 50.9（t， C-14）， 57.1（d， C-9）， 107.0（t， C-17）， 147.9（s， C-8）， 183.9（s， C-18）， 203.1（d， C-15）。與文獻(xiàn)（Zinkel et al.，1985）數(shù)據(jù)基本一致，因此，鑒定化合物4為4-eplimbricataloic acid。

化合物5?黃色無(wú)定型粉末（乙酸乙酯），mp=209 ～ 211 ℃， EI-MS m/z：378[M]+， 分子式為C23H38O4， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：1.26（3H， d， J= 7.1 Hz， H-22）， 3.66（3H， s， H-23）， 4.13（2H， t， J= 7.1 Hz， H-21）， 4.49（1H， br s， H-17a）， 4.81（1H， br s， H-17b）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.3（q， C-22）， 14.7（q， C-20）， 16.6（q， C-19）， 18.5（t， C-2）， 20.0（q， C-16）， 20.8（t， C-11）， 26.8（t， C-6）， 31.0（d， C-13）， 35.8（t， C-12）， 37.0（t， C-3）， 37.1（t， C-7）， 38.1（t， C-1）， 39.1（s， C-10）， 41.7（t， C-14）， 47.8（s， C-4）， 49.9（d， C-5）， 51.9（q， C-23）， 57.1（d， C-9）， 60.1（t， C-21）， 106.9（t， C-17）， 148.0（s， C-8）， 173.3（s， C-15）， 179.4（s， C-18）。與文獻(xiàn)（張蓉等，2006）數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物5為15-乙基-18-松葉酸甲酯。

化合物6?淡黃色無(wú)定型粉末（乙酸乙酯），mp=233 ～ 234 ℃， EI-MS m/z：346[M]+， 分子式為C22H34O3， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.70（3H， s， H-20）， 0.97（3H， d， J= 6.6 HZ， H-16）， 1.04（3H， s， H-19）， 4.59（1H， br s， H-17a）， 4.86（1H， br s， H-17b）， 9.24（1H， s， H-18）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.2（q， C-19）， 14.7（q， C-20）， 16.5（q， C-16）， 17.7（t， C-2）， 21.1（q， C-22）， 21.1（t， C-11）， 26.7（t， C-6）， 32.3（t， C-3）， 37.5（t， C-7）， 37.8（t， C-12）， 38.2（t， C-1）， 38.4（s， C-10）， 47.6（d， C-5）， 49.9（s， C-4）， 56.2（d， C-9）， 61.4（t， C-15）， 107.4（t， C-17）， 118.2（d， C-14）， 142.6（s， C-13）， 147.2（s， C-8）， 171.1（s， C-21）， 206.4（d， C-18）。與文獻(xiàn)（張蓉等，2006）數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物6為15-acetoxy-labda-8（17），13E-dien-18-al。

化合物7?無(wú)色針晶（乙酸乙酯），mp=105 ～ 107 ℃， EI-MS m/z：316[M]+， 分子式為C20H28O3， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：1.23（2 × 3H， d， J=6.9 Hz， H-16/17）， 1.29（2 × 3H， s， H-19/20）， 2.88（1H， m， H-15）， 4.91（1H， dd， J=7.5， 2.0 Hz， H-7）， 7.10（1H， dd， J=8.2， 1.5 Hz， H-12）， 7.16（1H， d， J=8.2 Hz， H-11）， 7.38（1H， d， J=1.5 Hz， H-14）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：15.7（q， C-19）， 17.8（t， C-2）， 23.3（q， C-16）， 23.5（q， C-17）， 24.9（q， C-20）， 32.2（t， C-6）， 33.1（d， C-15）， 35.7（t， C-3）， 37.0（s， C-10）， 37.4（t， C-1）， 42.8（d， C-5）， 46.5（s， C-4）， 70.1（d， C-7）， 123.6（d， C-11）， 124.6（d， C-12）， 125.3（d， C-14）， 136.8（s， C-8）， 146.0（s， C-13）， 146.4（s， C-9）， 183.3（s， C-18） 。與文獻(xiàn)（蘆毅和華燕，2011）數(shù)據(jù)基本一致，因此，鑒定化合物7為7β-羥基脫氫樅酸。

化合物8?無(wú)定形粉末（乙酸乙酯），mp=107 ～ 110 ℃， EI-MS m/z：316[M]+， 分子式為C20H28O3， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：1.16（3H， s， H-20）， 1.23（2 × 3H， d， J=7.0 Hz， H-16/17）， 1.26（3H， s， H-19）， 2.87（1H， m， H-15）， 4.53（1H， br s， H-7）， 7.13（1H， dd， J=8.2， 1.8 Hz， H-12）， 7.18（1H， d， J=1.8 Hz， H-14）， 7.19（1H， d， J=8.2 Hz， H-11）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：16.6（q， C-19）， 18.6（t， C-2）， 23.9（q， C-17）， 24.1（q， C-16）， 24.2（q， C-20）， 30.9（t， C-6）， 33.5（d， C-15）， 36.3（t， C-3）， 37.4（s， C-10）， 37.7（t， C-1）， 39.8（d， C-5）， 47.0（s， C-4）， 68.3（d， C-7）， 124.2（d， C-12）， 126.7（d， C-11）， 128.3（d， C-14）， 135.6（s， C-8）， 146.6（s， C-9）， 146.7（s， C-13）， 182.8（s， C-18）。與文獻(xiàn)（張蓉等，2006）基本一致，因此，鑒定化合物8為7α-羥基脫氫樅酸。

化合物9?黃色油狀物，EI-MS m/z：334[M]+， 分子式為C20H30O4， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.58（3H， s， H-19）， 0.99-2.49（15H， m）， 1.04-1.13（2 × 3H， d， J= 7.0 Hz， H-16/H-17）， 1.16（3H， s， H-18）， 2.51（1H， qd， J= 7.0 Hz， H-15）， 4.60（1H， br s， H-12）5.84（1H， s， H-14）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：15.1（q， C-16）， 16.3（q， C-17）， 17.0（CH2）， 20.1（q， C-20）， 20.4（q， C-19）， 21.6（CH2）， 25.0（CH2）， 31.0（CH）， 32.1（CH2）， 36.2（CH2）， 36.6（CH2）， 36.8（CH）， 43.2（CH）， 48.8（C）， 50.0（C）， 74.6（s， C-8）， 76.9（d， C-12）， 124.6（d， C-14）， 149.1（s， C-13）， 184.2（s， C-18）。與文獻(xiàn)（Ayer & Macaulay，1987）基本一致，因此，鑒定化合物9為endo-peroxide。

化合物10?黃色油狀物，EI-MS m/z：222[M]+， 分子式為C15H26O， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.77（3H， d， J= 6.9 Hz， H-14）， 0.92（3H， d， J= 7.2 Hz， H-13）， 1.05（1H， m， H-7）， 1.11（3H， s， H-15）， 1.22（1H， m， H-9）， 1.24（1H， m， H-1）， 1.41（1H， m， H-9）， 1.59（2H， m， H-2）， 1.67（3H， s， H-11）， 1.72（1H， m， H-6）， 1.79（1H， m， H-10）， 1.98（2H， m， H-3）， 2.00（2H， m， H-9）， 2.18（1H， m， H-12）， 5.50（1H， br s， H-5）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：15.8（q， C-14）， 21.0（q， C-15）， 21.7（q， C-13）， 22.0（t， C-2）， 22.8（t， C-8）， 23.2（d， C-11）， 29.9（d， C-6）， 30.7（t， C-3）， 37.2（q， C-12）， 42.0（t， C-9）， 46.1（d， C-7）， 50.8（d， C-1）， 72.1（s， C-10）， 122.1（d， C-5）， 133.8（s， C-4）。與文獻(xiàn)（Bottini et al.，1987;Tanaka et al.，1997）基本一致，因此，鑒定化合物10為α-杜松醇。

化合物11?白色晶體（乙酸乙酯），mp=139 ～ 142 ℃， EI-MS m/z：414[M]+， 分子式為C29H50O， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.68（3H， s， H-18）， 0.82（3H， d， J= 7.0 Hz， H-27）， 0.83（3H， d， J= 7.0 Hz， H-26）， 0.84（3H， d， J= 7.0 Hz， H-29）， 0.93（3H， d， J= 6.8 Hz， H-21）， 1.01（3H， s， H-19）， 3.54（1H， m， H-3）， 5.35（1H， br d， J= 3.6 Hz， H-6）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：11.9（q， C-29）， 12.0（q， C-19）， 18.8（q， C-21）， 19.0（q， C-26）， 19.4（q， C-18）， 19.8（t， C-1）， 21.1（t， C-2）， 23.1（q， C-27）， 24.3（d， C-14）， 26.1（t， C-15）， 28.2（t， C-11）， 29.2（t， C-12）， 30.5（t， C-28）， 31.7（t， C-16）， 31.9（t， C-22）， 34.0（d， C-25）， 36.2（d， C-24）， 36.5（d， C-23）， 37.3（d， C-20）， 39.8（d， C-17）， 42.3（s， C-13）， 42.32（s， C-10）， 45.8（t， C-7）， 50.1（d， C-8）， 56.1（d， C-9）， 56.8（t， C-4）， 71.8（d， C-3）， 121.7（d， C-6）， 140.8（s， C-5）。與文獻(xiàn)（康淑荷等，2008;張博等，2009）基本一致，因此，鑒定化合物11為β-谷甾醇。

化合物12?黃色油狀物，EI-MS m/z：278[M]+， 分子式為C16H22O4， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.70（3H， d， J=6.8 Hz， H-4′）， 1.19（2H， m， H-3′）， 1.45（2H， m， H-2′）， 4.06（2H， m， H-1′）， 7.25（1H， d， J=7.2 Hz， H-4）， 7.47（1H， d， J=7.2 Hz， H-3）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：12.7（q， C-4′）， 18.3（t， C-3′）， 29.7（t， C-2′）， 64.3（t， C-1′）， 127.9（d， C-3）， 130.0（d， C-4）， 131.6（s， C-2）， 166.4（s， C-1）。與文獻(xiàn)（Hoang et al.，2008）基本一致，因此，鑒定化合物12為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物13?淡黃色油狀物，EI-MS m/z：296[M]+， 分子式為C20H40O， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.84（3H， d， J=6.8 Hz， H-19）， 0.86（3H， J=6.5 Hz， H-18）， 0.88（2 × 3H， d， J=6.5 Hz， H-16/H-17）， 1.25（8H， m， H-6， 8， 10， 12）， 1.14（2H， m， H-14）， 1.28（4H， m， H-9， 13）， 1.37（2H， m， H-7， 11）， 1.39（2H， m， H-5）， 1.53（1H， m， H-15）， 1.67（3H， s， H-20）， 2.00（2H， m， H-4）， 4.16（2H， m， H-1）， 5.41（1H， m， H-2）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：16.2（q， C-16）， 19.7（q， C-17）， 19.8（q， C-18）， 22.7（q， C-19）， 23.7（q， C-20）， 24.5（t， C-9）， 24.8（t， C-13）， 25.1（t， C-5）， 28.0（d， C-15）， 32.7（d， C-7）， 32.8（d， C-11）， 36.7（t， C-6）， 37.3（t， C-12）， 37.4（t， C-10）， 37.42（t， C-8）， 39.4（t， C-14）， 39.9（t， C-4）， 59.5（t， C-1）， 123.1（d， C-2）， 140.4（s， C-3）。與文獻(xiàn)（Brown et al.，2003）基本一致，因此，鑒定化合物13為7R，11R-phytol。

化合物14?白色粉末（乙酸乙酯），mp=75 ～ 77 ℃， EI-MS m/z：340[M]+， 分子式為C24H50O， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.88（3H， d， J=6.8 Hz， H-24）為末端甲基氫信號(hào)， 1.30～1.62（CH2）， 3.64（2H， m， H-1） 為與氧相連的氫質(zhì)子信號(hào);13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.1為末端甲基碳信號(hào)， 22.7～33.2（22 × CH2）， 63.1為與氧相連的碳信號(hào)。與文獻(xiàn)（張倩等，2004）基本一致，因此，鑒定化合物14為正二十四烷醇。

化合物15?白色晶體（乙酸乙酯），mp=74 ～ 75 ℃， EI-MS m/z：410[M]+， 分子式為C28H58O， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δ：0.95（3H， d， J= 6.8 Hz， H-28）， 0.98（3H， d， J= 6.8 Hz， H-1）， 1.34（34H， m， 17 × CH2）， 1.51（8H， m， 4 × CH2）， 1.70（4H， m， 2 × CH2）， 2.14（2H， m， H-8）， 2.36（2H， m， H-6）， 3.66（1H， br m， H-7α）; 13C-NMR（150 MHz， CDCl3） δ：14.1（C-1， C-28）， 22.7（CH2）， 25.7（CH2）， 29.3（CH2）， 29.4（CH2）， 29.6（5 × CH2）， 29.7（13 × CH2）， 31.9（2 × CH2）， 37.5（CH2）， 72.0（d， C-7）。與文獻(xiàn)（Jameel et al.，2014）基本一致，因此，鑒定化合物15為N-octacosan7β-ol。

2.2 抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度正己烷萃取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，正己烷萃取物對(duì)上述三種病原菌均顯示不同程度的抑制效果，其中，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，正己烷萃取物對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制率均大于50%，濃度在50 mg·mL-1和100 mg·mL-1時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率分別是51%和69%，濃度范圍在5～25 mg·mL-1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑菌作用。

3?討論與結(jié)論

樟子松作為一種松屬植物，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其針葉的研究報(bào)道主要集中于揮發(fā)油和精油的GC-MS分析，主要采取水蒸氣蒸餾法，針葉油藥理作用研究主要集中于抗腫瘤（張蓉等，2006; Chen et al.，2014）、抗氧化（Ka et al.，2005;Jeong et al.，2009）、抗炎（Karonen et al.，2004）、抑菌（曾維才等，2009）和抗病毒（魏鳳香等，2008）等方面，除了張蓉課題組報(bào)道了松針中化學(xué)成分的分離，此外，對(duì)松針中單體化合物的分離及抗細(xì)菌作用研究卻少有報(bào)道。本研究采用溶劑提取法，以無(wú)水乙醇為溶劑，對(duì)樟子松針葉中的化學(xué)成分進(jìn)行提取，并對(duì)提取浸膏進(jìn)行了梯度萃取，得到不同極性的正己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。采用柱色譜、薄層色譜和高效液相色譜對(duì)正己烷萃取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，運(yùn)用核磁、質(zhì)譜等波譜技術(shù)，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。抑菌活性實(shí)驗(yàn)研究表明，正己烷萃取物在濃度為5、10、25、50、100 mg·mL-1時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑制率分別為53%、58%、63%、69%和71%;對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率分別為56%、60%、62%、68%和70%;在濃度為50 mg·mL-1和100 mg·mL-1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率分別為51%和69%。

本研究結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)正己烷萃取物化學(xué)成分的分離和純化，并經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)鑒定得到15個(gè)化合物，其中有4個(gè)化合物為首次從該屬植物中分離得到。樟子松針葉正己烷萃取物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用，本研究結(jié)果可為樟子松針葉作為植物源藥物的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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