舒血寧聯(lián)合磷酸肌酸鈉治療對(duì)心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用及對(duì)血管再生的影響

吳利杰 于收 馮韓章

摘要?目的：探究舒血寧聯(lián)合磷酸肌酸鈉對(duì)心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用及對(duì)血管再生的影響。方法：將60只建模成功的心肌梗死大鼠隨機(jī)分為模型組、磷酸肌酸鈉及聯(lián)合組，每組20只，另選20只SD大鼠僅于左冠狀動(dòng)脈前降支穿線而不結(jié)扎作為假手術(shù)組。磷酸肌酸鈉及聯(lián)合組分別腹腔注射磷酸肌酸鈉[0.2 g/（kg·d）]、磷酸肌酸鈉[0.2 g/（kg·d）]+舒血寧[10 mL/（kg·d）]，模型組及假手術(shù)組則注射等體積生理鹽水，各組均連續(xù)干預(yù)4周。檢測(cè)并比較各組大鼠心功能指標(biāo);觀察各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)變化;比較各組大鼠心肌組織微血管密度及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)情況。結(jié)果：模型組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）較假手術(shù)組升高，而磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組較模型組降低，且聯(lián)合組顯著低于磷酸肌酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;模型組大鼠左心室短軸收縮率（FS）及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），心肌組織CD31、VEGF蛋白A值及MVD較假手術(shù)組降低，而磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組較模型組升高，且聯(lián)合組顯著高于磷酸肌酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：舒血寧聯(lián)合磷酸肌酸鈉有效促進(jìn)心肌組織缺血區(qū)域血管新生，改善心肌梗死大鼠心肌病理損傷，恢復(fù)其心功能，療效顯著優(yōu)于單用磷酸肌酸鈉。

關(guān)鍵詞?心肌梗死;舒血寧;磷酸肌酸鈉;心肌保護(hù);心功能;血管再生;表達(dá)

Myocardial Protection of Shuxuening Combined with Sodium Phosphate in the Treatment of Myocardial Infarction in Rats and the Effect on Angiogenesis

Wu Lijie1， Yu Shou2， Feng Hanzhang1

（1 Xianyang Hospital of Yan′an University， Xianyang 712000， China; 2 Rizhao Hospital of Traditional Chinese Medicine， Rizhao 276800， China）

Abstract?Objective：To explore the myocardial protection of Shuxuening combined with sodium phosphate in the treatment of myocardial infarction in rats and the effect on angiogenesis.Methods：A total of 60 cases successfully modeling myocardial infarction rats were divided randomly into a model group， a sodium phosphate group and a combined group， with 20 cases in each group， and another 20 SD rats were only in the left anterior descending coronary artery threading without ligation and acted as sham-operation group.The sodium phosphate group and the combined group treated with intraperitoneal injection of sodium phosphate 0.2 g/（kg·d）， sodium phosphate 0.2 g/（kg·d）+ Shuxuening 10 mL/（kg·d）respectively.The model group and the sham-operation group were treated with intraperitoneal injection isovolumetric saline.Each group was treated for 4 weeks continuously.The rat cardiac function indexes in each group were detected and compared.The myocardial tissue pathology morphological changes were observed in each group.The myocardial tissue microvascular density and VEGF protein expression in each group were detected and compared.Results：The LVEDd， LVESd of rats in the model group were higher than those in the sham-operation group， while the sodium phosphate group and the combined group were lower than the model group， and the combined group was lower than the sodium phosphate group（P<0.05）; the FS， LVEF， IOD values of myocardial tissue CD31， VEGF protein and MVD in the model group were lower than those in the sham-operation group， while the sodium phosphate group and the combined group were higher than the model group， and the combined group was higher than the sodium phosphate group（P<0.05）.Conclusion：Shuxuening combined with sodium phosphate can promote the myocardial tissue ischemia region of angiogenesis effectively， improve the myocardial pathological damage of myocardial infarction rats， and restore the heart function.The effect is better than sodium phosphate alone significantly.

Key Words?Myocardial infarction; Shuxuening; Sodium phosphate; Myocardial protection; Cardiac function; Angiogenesis; Expression

中圖分類號(hào)：R283文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.015

心肌梗死是目前死亡率較高的心血管疾病之一，其主典型癥狀是心肌組織缺血性壞死，是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上所發(fā)生的冠狀動(dòng)脈血供受阻或中斷，心肌組織持續(xù)嚴(yán)重缺血繼而導(dǎo)致心肌組織大面積梗死，嚴(yán)重者甚至造成心力衰竭，危及生命健康[1]。磷酸肌酸鈉是一種典型的心肌能量代謝藥物，具有顯著的心肌保護(hù)作用，且楊順茂[2]研究報(bào)道，其可有效減輕心肌梗死患者缺血再灌注損傷，降低不良心臟事件的發(fā)生。舒血寧是中藥銀杏葉的有效提取成分，李娜等[3]研究報(bào)道，其可促進(jìn)血管擴(kuò)張、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善冠脈微循環(huán)，保護(hù)心肌組織，并已逐步用于心血管疾病的臨床治療，但目前有關(guān)其聯(lián)合西藥對(duì)心肌梗死的臨床研究報(bào)道尚不多見，且有關(guān)其心肌保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探究舒血寧聯(lián)合磷酸肌酸鈉治療心肌梗死大鼠，其對(duì)心功能、心肌組織病理學(xué)損傷及心肌組織血管再生的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物

選取雄性、清潔級(jí)、健康SD大鼠80只，6周齡，體質(zhì)量250～300 g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（軍）2007-007號(hào)。飼養(yǎng)條件：延安大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每籠5只，溫度（25±2）℃，濕度（55±2）%，光照明暗時(shí)間比為12 h/12 h，自由獲取食物和水。本實(shí)驗(yàn)操作遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求，倫理審批號(hào)：20191823。

1.1.2?藥物?舒血寧注射液（通化谷紅制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z22026295，批號(hào)：130103）;注射用磷酸肌酸鈉（北京朋來制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20056412，批號(hào)：20111221）。

1.1.3?試劑與儀器

主要試劑：SP免疫組織化學(xué)試劑盒（南京建成生物有限公司，批號(hào)：20120901）;兔抗鼠CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號(hào)：20121102）等。

主要儀器：石蠟切片機(jī)（沈陽益得電子有限公司，型號(hào)：CUT4062），組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：YD-A），多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司，型號(hào)：Image Pro Plus 6.0）等。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將雄性健康SD大鼠以乙醚麻醉，于左側(cè)第4肋間處剪開皮膚，分離肌肉，暴露胸腔，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，隨后，逐層縫合，所有操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行，構(gòu)建心肌梗死大鼠模型[4]。術(shù)后24 h經(jīng)心電圖檢測(cè)確診存在心肌梗死，排除由于手術(shù)操作或者建模后其他不適等因素所致的死亡大鼠及未建模成功大鼠;另隨機(jī)選取20只大鼠作假手術(shù)處理，僅于左冠狀動(dòng)脈前降支穿線而不結(jié)扎，作為假手術(shù)組。將建模成功的60只急性心肌梗死（AMI）大鼠隨機(jī)分為模型組、磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組，每組20只。

1.2.2?給藥方法

磷酸肌酸鈉組腹腔注射磷酸肌酸鈉0.2 g/（kg·d），聯(lián)合組腹腔注射磷酸肌酸鈉0.2 g/（kg·d），舒血寧注射液，10 mL/（kg·d）;模型組及假手術(shù)組則灌胃等體積生理鹽水，各組均連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

心功能指標(biāo)檢測(cè)：末次干預(yù)結(jié)束后，將各組大鼠均以戊巴比妥鈉注射麻醉，經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，以為胸骨旁短軸切面測(cè)量并記錄大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），計(jì)算左心室短軸收縮率（FS）及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。據(jù)同一平面短軸切面獲取，各切面記錄2個(gè)圖像[5]。

觀察大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)：心功能檢測(cè)結(jié)束后，斷頭法處死所有大鼠，開胸，采取心臟，生理鹽水沖洗血液，采集基底部梗死邊緣區(qū)心肌組織，置于福爾馬林溶液中固定24 h，常規(guī)制作石蠟切片，厚度4 μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色[6]觀察大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)。

免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠心肌組織微血管密度及VEGF蛋白表達(dá)情況：心肌組織石蠟組織切片制作同上，經(jīng)二甲苯脫蠟，水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，石蠟切片復(fù)溫，滴加一抗（CD31、VEGF抗體，工作濃度1∶100），4 ℃下孵育過夜;滴加二抗：廣譜通用型非生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min;光學(xué)顯微鏡滴下DAB顯色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下判定染色結(jié)果，陽性著色為心肌細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)棕黃色。高倍鏡下統(tǒng)計(jì)心肌梗死邊緣區(qū)CD31陽性細(xì)胞表達(dá)情況，計(jì)算單位面積內(nèi)CD31陽性微血管數(shù)量，隨機(jī)選取5個(gè)視野求平均值即為微血管密度（MVD）;CD31陽性微血管計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)蝹€(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、微小血管均予計(jì)數(shù)，帶有較厚肌層區(qū)域的血管均不計(jì)數(shù);另以Image-Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)心肌組織CD31、VEGF蛋白陽性表達(dá)吸光度值（A），A越大則陽性表達(dá)率越高[7]。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布，則采用配對(duì)樣本比較的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?各組大鼠心功能指標(biāo)比較

模型組大鼠LVEDd、LVESd較假手術(shù)組升高，而磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組較模型組降低，且聯(lián)合組顯著低于磷酸肌酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;模型組大鼠FS、LVEF較假手術(shù)組降低，而磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組較模型組升高，且聯(lián)合組顯著高于磷酸肌酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2?各組心肌組織病理學(xué)形態(tài)觀察

HE染色顯示，假手術(shù)組心肌組織排列整齊;模型組心肌組織染色不均，且排列紊亂，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且細(xì)胞間隙增大，偶見少量肌溶灶，梗死區(qū)心肌透壁性壞死，蒼白色;磷酸肌酸組及聯(lián)合組上述病理變化均有不同程度的改善。見圖1。

2.3?各組心肌組織CD31、VEGF蛋白表達(dá)情況及MVD比較

免疫組織化學(xué)染色顯示，模型組大鼠心肌組織CD31、VEGF吸光度較假手術(shù)組降低，且磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組較模型組升高，且聯(lián)合組顯著高于磷酸肌酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2，表2。模型組大鼠心肌組織MVD較假手術(shù)組降低，且磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組較模型組升高，且聯(lián)合組顯著高于磷酸肌酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3?討論

目前對(duì)于心肌梗死的常規(guī)治療方式主要是通過抗血小板聚集、早期溶栓、冠狀動(dòng)脈介入治療等開通閉塞血管，改善心肌灌注，最大程度挽救瀕死心肌[8]。磷酸肌酸鈉作為一種外運(yùn)行磷酸肌酸的高效能物質(zhì)，具有顯著的心肌細(xì)胞代謝、心肌細(xì)胞功能保護(hù)作用，已廣泛用于臨床心血管疾病的治療，如充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等[9]。

近年來中醫(yī)藥在心血管疾病治療方面取得一定的進(jìn)展，中醫(yī)學(xué)理論將心肌梗死歸屬于“喘癥、厥心痛、胸痹”等范疇，其病位在于心、血脈，《素問·痹論篇》中記載：“寒邪凝滯脈中致氣血壅阻滯寒，氣機(jī)不暢則發(fā)為疼痛;寒邪凝滯脈外使脈絡(luò)拘攣蜷縮，氣血不榮則為疼痛”。故其主要病機(jī)為氣虛、血瘀、寒凝等，瘀血阻絡(luò)、心氣虛乏，瘀血阻滯，則脈絡(luò)不通，故應(yīng)以活血化瘀通絡(luò)為主要治療原則[10]。舒血寧注射液是臨床常用的活血通絡(luò)中成藥制劑，其是中藥銀杏葉的提取制劑[11]，且《本草綱目》中記載曰：“銀杏葉可補(bǔ)氣養(yǎng)心、潤(rùn)肺益腎、健腦醒神、延年益壽”。張建平等[12]研究報(bào)道，舒血寧注射液具有活血祛瘀、通脈舒絡(luò)，通脈止痛，益氣健腦等功效，對(duì)缺血性中風(fēng)患者療效顯著。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，舒血寧是一種天然的特異性的血小板活化因子拮抗劑，其主要藥理成分包括黃酮苷類以及銀杏內(nèi)酯，可有效阻斷血小板活化因子受體，抑制血小板活化，繼而降低血液黏度，改善患者血液流變狀態(tài)，抑制微血栓的形成;還具有抗氧化、清除氧自由基的作用，可有效改善組織氧化應(yīng)激損傷，對(duì)缺血區(qū)域心肌組織具有顯著的保護(hù)效應(yīng)[13-15]。本研究中HE染色顯示磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組大鼠心肌組織病理損傷較模型組顯著改善;此外，研究報(bào)道，黃酮苷類物質(zhì)可有效恢復(fù)冠脈血流量;抑制心肌組織磷酸肌酸激酶的釋放，減慢患者心率，降低心肌能耗，縮小心肌梗死面積，抗心肌缺血效應(yīng)顯著[16]。本研究中磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組LVEDd、LVESd較模型組降低，F(xiàn)S、LVEF較模型組升高，且聯(lián)合組及磷酸肌酸鈉組LVEDd、LVESd、FS、LVEF均差異顯著。提示舒血寧聯(lián)合磷酸肌酸鈉可有效延緩心肌梗死大鼠心室重構(gòu)，改善心功能，且療效顯著優(yōu)于磷酸肌酸鈉單用。

目前利用血管再生是治療缺血性心臟病的新方案，也是心腦血管疾病領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)[17]。中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，“氣血相通，行氣通脈、補(bǔ)氣活血，脈者血之府也”。因此行氣活血之中藥均可促進(jìn)血管再生。張慶勇等[18]研究報(bào)道，人參皂苷Rg1可通過促進(jìn)急性心肌梗死大鼠缺血心肌組織血管新生，重新恢復(fù)血液供應(yīng)，挽救瀕死心肌并抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血心肌，繼而有效恢復(fù)急性心肌梗死大鼠心功能。微血管密度是目前可直接反映側(cè)支血管形成的最可靠指標(biāo)，有效評(píng)估缺血心肌冠脈側(cè)支血管新生情況[19];VEGF是典型的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，也是血管新生不可或缺的關(guān)鍵分子[20]。本研究結(jié)果顯示，磷酸肌酸鈉組及聯(lián)合組大鼠心肌組織CD31、VEGF吸光度值及MVD較模型組升高，且聯(lián)合組顯著高于磷酸肌酸鈉組，提示舒血寧聯(lián)合磷酸肌酸鈉改善心肌梗死大鼠心功能的作用機(jī)制與其有效上調(diào)心肌組織VEGF蛋白表達(dá)，升高微血管密度，促進(jìn)心肌組織血管新生密切相關(guān)。

綜上所述，舒血寧聯(lián)合磷酸肌酸鈉有效促進(jìn)心肌組織缺血區(qū)域血管新生，改善心肌梗死大鼠心肌病理損傷，恢復(fù)其心功能，療效顯著優(yōu)于磷酸肌酸鈉單用，但有關(guān)其具體分子作用機(jī)制以及最佳用藥劑量仍需開展進(jìn)一步系統(tǒng)研究確認(rèn)。

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（2019-09-05收稿?責(zé)任編輯：楊覺雄）