糖腎寧對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型Rho/ROCK通路的影響

徐嘉一 高彥彬 鄒大威 王曉磊 王濤 師一民 吳冰杰

摘要?目的：基于Rho/ROCK信號(hào)通路研究中藥糖腎寧對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型的影響。方法：高糖培養(yǎng)足細(xì)胞，以不同藥物分組干預(yù)足細(xì)胞24 h，用羅丹明染色的鬼筆環(huán)肽法檢測足細(xì)胞骨架，細(xì)胞免疫熒光檢測足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin，Western Blotting檢測RhoA、ROCK1、Nephrin蛋白的表達(dá)。比較不同藥物或藥物濃度對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型的影響。結(jié)果：糖腎寧可改善足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，下調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中異常升高的RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)，上調(diào)Nephrin表達(dá)。結(jié)論：中藥糖腎寧可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型RhoA/ROCK1信號(hào)通路，減輕足細(xì)胞骨架重構(gòu)，改善足細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞?中藥;糖腎寧;高糖;足細(xì)胞損傷;Rho/ROCK通路;實(shí)驗(yàn)研究;足細(xì)胞標(biāo)志蛋白;糖尿病腎病

Effects of Tangshenning on High Glucose-Induced Podocyte Injury Based on Rho/ROCK Pathway

Xu Jiayi1，2， Gao Yanbin1，2， Zou Dawei1，2， Wang Xiaolei1，2， Wang Tao1，2， Shi Yimin1，2， Wu Bingjie1，2

（1 School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China; 2 Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research， Beijing 100069， China）

Abstract?Objective：To investigate the mechanism of traditional Chinese medicine Tangshenning on high glucose-induced podocyte injury based on Rho/ROCK signal pathway.Methods：Podocytes were cultured in high glucose.The podocytes were treated with different drugs for 24 h.The podocyte cytoskeleton was detected by rhodamine-stained phalloidin.The podocyte marker protein Nephrin was detected by immunofluorescence.Western blotting was used to detect RhoA， ROCK1 and Nephrin protein.Results：Tangshenning could improve the podocyte cytoskeleton， decreased expression of RhoA and ROCK1 protein， and increased expression of high glucose-induced Nephrin expression in high glucose-induced podocyte injury model.Conclusion：Traditional Chinese medicine Tangshenning can reduce the expression of RhoA/ROCK1 signaling pathway-related protein in high glucose cultured podocytes， reduce podocyte cytoskeletal remodeling， increase the expression of high glucose-induced Nephrin protein， and improve high glucose-induced podocyte injury.

Key Words?Traditional Chinese medicine;Tangshenning; High glucose; Podocyte; Rho/ROCK signal pathway;Experimental study; Podocyte marker protein; Diabetic Nephropathy

中圖分類號(hào)：R242;R587.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.014

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是終末期腎病的最常見致病因素，在糖尿病患者中的發(fā)生率高達(dá)30%～40%，是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病致死的主要因素。DN臨床特征是進(jìn)行性增加的蛋白尿，而足細(xì)胞功能障礙和形態(tài)學(xué)變化均可能導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障功能受損，加重腎小球損傷，導(dǎo)致DN中蛋白尿的產(chǎn)生，足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病腎小球損傷很關(guān)鍵的早期病理標(biāo)記[1-3]。足細(xì)胞屬于終末分化的細(xì)胞，由胞體、主突和足突構(gòu)成。足細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基膜一起構(gòu)成腎小球血液濾過屏障，故糖尿病腎病中足突的融合和消失、足細(xì)胞骨架蛋白的缺失、足細(xì)胞數(shù)量改變及裂孔隔膜蛋白異常都將導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，進(jìn)一步加劇腎損傷[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排，使足細(xì)胞足突回縮、融合和消失，足細(xì)胞脫落，導(dǎo)致足細(xì)胞形態(tài)和功能改變，加劇腎小球損傷和蛋白尿的產(chǎn)生。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)中藥糖腎寧在改善糖尿病腎病蛋白尿方面有非常顯著的療效[8]，而Rho/ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)作為治療糖尿病腎病的關(guān)鍵通路，在改善足細(xì)胞損傷和蛋白尿方面至關(guān)重要[9]。本研究將通過Rho/ROCK通路，進(jìn)一步探討糖腎寧改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細(xì)胞與動(dòng)物?小鼠腎小球足細(xì)胞株購自北納創(chuàng)聯(lián)生物公司（批號(hào)：BNCC337685）;8周齡SPF級SD大鼠，雄性，30只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（京）2016-0006。倫理編號(hào)：AEEI-2017-039。

1.1.2?藥物?糖腎寧（成分：黃芪、金櫻子、大黃、川芎等，購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司），纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H20040217）。

1.1.3?試劑與儀器?DMEM低糖培養(yǎng)基（Gibco，10567014）;0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco，25200056）;胎牛血清（依科賽，F(xiàn)SP500）;Nephrin抗體（Novus）;RhoA抗體（proteintech）;ROCK1抗體（proteintech）;羅丹明-鬼筆環(huán)肽（AAT）;甘露醇（Sigma）、葡萄糖（Sigma）。電泳儀和濕轉(zhuǎn)裝置（Bio-Rad，美國）;凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（VILBER LOURMAT，法國）;正置熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國）;多功能基因蛋白檢測儀（SpectraMax iD3，奧地利）。

1.2?方法

1.2.1?含藥血清的制備?選取SPF級SD雄性大鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分空白組和糖腎寧組，糖腎寧組予中藥糖腎寧[20 g/（kg·d）]，空白組予生理鹽水，灌胃1次/d（2.25 mL/250 g），連續(xù)灌7 d。末次灌胃1 h后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，將采集的血液放在4 ℃中靜置過夜，以3 000 r/min，離心15 min，收集上清液，56 ℃水浴30 min滅活，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾除菌后，分裝，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?細(xì)胞培養(yǎng)?取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓回縮后，立即用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5 mL于培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2 33 ℃培養(yǎng)箱中增殖，每2 d換液，待細(xì)胞貼壁長至鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右，1∶3傳代。取第4～5代細(xì)胞，放置在5%CO2 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d后，足細(xì)胞分化成熟，將分化成熟的足細(xì)胞在無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h，進(jìn)行不同分組的干預(yù)24 h。實(shí)驗(yàn)分組為：正常組（NG，L-DMEM培養(yǎng)基+10%空白鼠血清）;甘露醇組（MG，L-DMEM培養(yǎng)基+24.5 mmol/L甘露醇+10%空白鼠血清）;模型組（HG，30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+10%空白鼠血清）;糖腎寧低濃度組（LT，30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+0.4%含藥血清+9.6%空白鼠血清）;糖腎寧中濃度組（MT，30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+2%含藥血清+8%空白鼠血清）;糖腎寧高濃度組（HT，30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+10%含藥血清）;纈沙坦組（XST，30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基+1 μmol/L纈沙坦+10%空白鼠血清）。

1.2.3?檢測方法

1.2.3.1?羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架?按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)足細(xì)胞24 h，吸棄舊培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛溶液，常溫固定20 min，再加入PBS溶液稀釋的0.1%rtonX-100孵育10 min，分別加入100 μg/mL的羅丹明-鬼筆環(huán)肽工作液，錫紙覆蓋，常溫孵育1 h，再往每孔中滴加適量DAPI染液，孵育5 min，用抗熒光淬滅封片劑封于載玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3.2?細(xì)胞免疫熒光檢測?按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)足細(xì)胞24 h，用4%多聚甲醛溶液，室溫下固定15 min，再加入PBS溶液稀釋的0.5%Triton X-100，室溫孵育20 min后，向各孔中加入適量的10%正常山羊血清，常溫孵育30 min;吸水紙吸棄封閉山羊血清，不洗，加入稀釋好的一抗，放入濕盒，4 ℃孵育過夜，次日將一抗棄掉，滴加稀釋好的熒光二抗，放入濕盒，于37 ℃孵育1 h后，往各孔中滴加DAPI工作液，避光孵育10 min，用抗熒光淬滅封片劑封于載玻片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.3.3?Western Blot檢測?取分組干預(yù)后的細(xì)胞，加入適量的裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱10 min變性。吸取20 μg蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)膜至0.45 μm PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，第2天TBST洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫震蕩1 h，TBST洗膜后加入現(xiàn)配置的ECL發(fā)光液，凝膠化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，分析各蛋白表達(dá)水平。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?糖腎寧對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響?共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞骨架顯示：NG組細(xì)胞骨架沿細(xì)胞長軸呈線性分布，骨架結(jié)構(gòu)整齊清晰，足突明顯，熒光強(qiáng)度明亮。MG組與NG組相似。而HG組細(xì)胞皺縮，骨架結(jié)構(gòu)斷裂，排列紊亂，熒光強(qiáng)度較NG組表達(dá)明顯暗淡。而LT、MT、HT組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)均明顯改善，熒光強(qiáng)度介于NG組和HG組之間，尤其HT組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)清晰，熒光強(qiáng)度較亮，足突明顯，而XST組細(xì)胞骨架熒光強(qiáng)度亮，骨架結(jié)構(gòu)清楚，但足突不明顯。見圖1。

2.2?糖腎寧對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型Rho/ROCK信號(hào)通路的影響?Western blot結(jié)果顯示，MG組RhoA蛋白表達(dá)較NG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HG組RhoA蛋白表達(dá)較NG組明顯升高（*P<0.05），而LT、MT、HT組和XST組RhoA蛋白表達(dá)較HG組明顯降低（△P<0.05），且LT、MT、HT組呈劑量依賴性下調(diào)異常升高的RhoA蛋白表達(dá)。MG組ROCK1蛋白表達(dá)與NG組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HG組ROCK1蛋白表達(dá)較NG組明顯升高（*P<0.05），而LT、MT、HT組和XST組ROCK1蛋白表達(dá)較HG組顯著降低（△P<0.05），且LT、MT、HT組呈劑量依賴性下調(diào)異常升高的ROCK1蛋白表達(dá)。見圖2。

2.3?糖腎寧對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型Nephrin蛋白表達(dá)的影響?Western blot結(jié)果顯示，MG組Nephrin蛋白表達(dá)與NG組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HG組Nephrin蛋白表達(dá)較NG組明顯降低（*P<0.05），而LT、MT、HT組和XST組Nephrin蛋白表達(dá)較HG組明顯升高（△P<0.05），且LT、MT、HT組呈劑量依賴性上調(diào)Nephrin表達(dá)。如圖3，細(xì)胞免疫熒光顯示，足細(xì)胞Nephrin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈顆?；蚓€裝分布，NG組和MG組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HG組Nephrin蛋白表達(dá)量少，LT、MT、HT組Nephrin蛋白表達(dá)較HG組有明顯改善，其中HT組的熒光強(qiáng)度改善最為顯著，XST組Nephrin蛋白表達(dá)較HG組有明顯改善，蛋白表達(dá)趨勢與Western blot結(jié)果一致。見圖3。

3?討論

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎病是“消渴病”遷延日久，病久入絡(luò)，繼發(fā)于腎的腎絡(luò)受損疾病，故稱為“消渴病腎病”，國內(nèi)學(xué)者多認(rèn)為本病是以氣陰兩虛為本，痰濕、瘀血、濁毒等為標(biāo)的虛實(shí)夾雜之證。高彥彬教授認(rèn)為腎絡(luò)病變是貫穿糖尿病腎病始終的病理基礎(chǔ)，病變早期，腎氣不固，腎絡(luò)瘀滯;病變中期，陰損及陽，脾腎虛衰，腎絡(luò)瘀阻;病變晚期，腎絡(luò)瘀結(jié)，腎體勞衰。針對DN早期腎氣不固、腎絡(luò)瘀滯的病機(jī)特點(diǎn)，采用益氣固腎，化瘀通絡(luò)法獲得較好療效。臨床研究表明糖腎寧可降低早期糖尿病腎病患者血糖、血脂水平，改善血液流變學(xué)，抑制血小板聚集，降低早期DN患者異常升高的肌酐清除率，顯著減少微量蛋白尿，改善腎功能[8]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)糖腎寧可上調(diào)糖尿病大鼠降低的足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白Nephrin，下調(diào)異常升高的足細(xì)胞骨架蛋白Desmin的表達(dá)，減少糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷，降低蛋白尿，保護(hù)腎功能[10]。

足細(xì)胞即腎小球上皮細(xì)胞，相鄰足細(xì)胞的足突互相交叉呈指嵌狀形成的裂孔隔膜，與腎小球基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞組成腎小球?yàn)V過屏障。足細(xì)胞屬于終末分化的細(xì)胞，在成人腎小球中進(jìn)行細(xì)胞分裂的能力有限，足細(xì)胞肥大、足突融合、足細(xì)胞數(shù)量和密度降低、足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和足細(xì)胞凋亡等細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常均會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，使足細(xì)胞功能喪失，濾過膜通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障受損，發(fā)生蛋白尿。因此，足細(xì)胞損傷被認(rèn)為是各種腎小球疾病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[11-14]。而足細(xì)胞具有復(fù)雜的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，足細(xì)胞損傷與足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定密切相關(guān)，細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對裂孔隔膜和腎小球?yàn)V過屏障至關(guān)重要，足細(xì)胞骨架失調(diào)將直接影響足突，導(dǎo)致足細(xì)胞足突回縮、融合、消失[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組足細(xì)胞足突消失，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)回縮、斷裂，排列紊亂，Nephrin蛋白表達(dá)顯著降低，而糖腎寧可改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重構(gòu)，上調(diào)Nephrin蛋白表達(dá)，改善足細(xì)胞損傷。

RhoA GTP酶屬于Ras超家族，是一類小GTP酶，可通過結(jié)合GDP和GTP起到分子開關(guān)的作用，Rho與GTP結(jié)合后，可激活下游Rho相關(guān)激酶（ROCK1）發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化。ROCK1是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，起到調(diào)節(jié)肌動(dòng)球蛋白細(xì)胞骨架的作用。RhoA激活后，將活化ROCK1，并介導(dǎo)其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)，增強(qiáng)肌動(dòng)-肌球蛋白收縮，通過控制肌動(dòng)蛋白絲穩(wěn)定、肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)和肌動(dòng)蛋白纖維組裝，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)[16-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)水平明顯升高，中藥糖腎寧可下調(diào)異常升高的RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)水平，提示糖腎寧可通過抑制RhoA/ROCK1信號(hào)通路蛋白表達(dá)，穩(wěn)定足細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)，改善足細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究證實(shí)高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞Rho/ROCK信號(hào)通路激活，進(jìn)而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白收縮，以及細(xì)胞骨架重構(gòu)，最終導(dǎo)致足細(xì)胞足突融合、消失等足細(xì)胞損傷。中藥糖腎寧可下調(diào)異常升高的RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)，穩(wěn)定足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，上調(diào)Nephrin蛋白表達(dá)，減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。我們認(rèn)為糖腎寧減輕足細(xì)胞損傷的作用可能與抑制Rho/ROCK通路，減輕細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步開展深入研究。

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（2019-06-28收稿?責(zé)任編輯：王楊）