獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室熒光RT-PCR質(zhì)量控制

摘要：近年，隨著實(shí)驗(yàn)室熒光RT-PCR檢測方法的推廣應(yīng)用，很多基層地區(qū)的獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和檢測機(jī)構(gòu)并不能控制整體的檢測質(zhì)量，影響最終的檢測結(jié)果。該文主要結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，重點(diǎn)分析獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室熒光RT-PCR檢測的質(zhì)量控制措施，希望通過該次研究對(duì)提高病原微生物實(shí)驗(yàn)室診斷準(zhǔn)確性、精確性有一定幫助。

關(guān)鍵詞：獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室;熒光RT-PCR檢測法;質(zhì)量控制措施

中圖分類號(hào)：S851.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.16.043

0 引言

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室熒光RT-PCR又被稱為反轉(zhuǎn)路聚合酶鏈反應(yīng)，該種檢測技術(shù)主要是將RNA的反轉(zhuǎn)錄技術(shù)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)有效結(jié)合，具有檢測精確度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多種病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷。熒光RT-PCR檢測是一項(xiàng)技術(shù)要求很高的工作，在操作中，極微量的污染物污染藥品都會(huì)導(dǎo)致假陽性假陰性的產(chǎn)生，最終影響檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室布局不合理、人員培訓(xùn)不到位、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理意識(shí)薄弱等問題也會(huì)影響檢測結(jié)果。因此，需要加強(qiáng)管理，降低各種影響因素。

1 實(shí)驗(yàn)室人員管理

熒光RT-PCR檢測法是一種成熟的病原微生物檢測方法，被廣泛應(yīng)用于多種病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷。在具體操作中，實(shí)驗(yàn)室人員的熟練程度和責(zé)任心直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于該種檢測技術(shù)的靈敏度很高，在操作中一定要保證細(xì)致化，避免因?yàn)椴患?xì)致的操作導(dǎo)致反應(yīng)體系比例不一致，甚至造成病料交叉污染。在工作開展中，對(duì)于檢測中出現(xiàn)的問題，要求檢測人員從自身尋找原因。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部應(yīng)該實(shí)行考核上崗和定期培訓(xùn)制度，只有獲得相應(yīng)考核資格證書的人員，才能進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室開展檢測。在操作中，檢驗(yàn)人員要嚴(yán)格按照相關(guān)質(zhì)量規(guī)程體系，分步驟操作，明確最佳的檢測方法，注重實(shí)驗(yàn)中的每一個(gè)細(xì)節(jié)質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該定期對(duì)相應(yīng)的技術(shù)人員進(jìn)行質(zhì)量考核，組織同級(jí)別的或更高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室開展對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以此提升實(shí)驗(yàn)室檢測人員的專業(yè)能力和責(zé)任心。

2 儀器設(shè)備管理

熒光RT-PCR檢測法應(yīng)用中通常會(huì)涉及多種儀器和藥品，常用儀器主要包括熒光RT-PCR擴(kuò)增儀、生物安全柜、離心管、離心機(jī)、核算提取儀、移液器等，針對(duì)這些儀器設(shè)備，在操作中一定要嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)程，定期的維護(hù)和檢查。必要時(shí)還應(yīng)該對(duì)相應(yīng)的稱量儀器設(shè)備進(jìn)行校對(duì)，保證其稱量的準(zhǔn)確性。對(duì)于檢測中使用頻率較高的熒光RT-PCR擴(kuò)增儀，應(yīng)該在制造廠商的配合下，每半年校對(duì)1次，并做好校對(duì)儀器設(shè)備的標(biāo)志工作[1]。核酸產(chǎn)物在上機(jī)前，應(yīng)該做好封膜處理，避免內(nèi)容物反應(yīng)或者蒸發(fā)液泄漏污染儀器。

3 藥品器材管理

檢測工作開展中，各項(xiàng)藥品和試劑的質(zhì)量直接影響最終的檢測結(jié)果，因此在各項(xiàng)試劑和藥品購買中，必須保證購進(jìn)途徑的官方統(tǒng)一，避免選擇假冒偽劣或過期的試劑。器械設(shè)備在使用前，都需要進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和衛(wèi)生消毒，一次性設(shè)備在使用后應(yīng)該進(jìn)行嚴(yán)格的無害化處理。實(shí)驗(yàn)室配置好的試劑，應(yīng)該使用無菌的容器分裝，或者在使用前對(duì)容器進(jìn)行高壓滅菌處理。此外，PCR試劑反應(yīng)液應(yīng)該與樣品以及PCR產(chǎn)物分開保存，不能將其放置在同一個(gè)保存容器中，需要低溫保存，經(jīng)常使用的試劑，可以分裝儲(chǔ)存，避免反復(fù)融凍影響試劑質(zhì)量。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部應(yīng)該配置專用的工作服裝、工作鞋帽和辦公用品。為保障不同功能區(qū)域的清潔衛(wèi)生，個(gè)體的防護(hù)設(shè)備和用品不能混合使用，需要構(gòu)建物品使用管理制度。

4 檢測質(zhì)量控制

熒光RT-PCR檢測工作開展中，要求動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完善的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)程，并明確檢測中的注意事項(xiàng)，要求檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按照操作規(guī)程的要求和相關(guān)規(guī)定內(nèi)容，準(zhǔn)確采樣，準(zhǔn)確稱量，準(zhǔn)確制樣，妥善保存核酸提取物，然后開展擴(kuò)增操作、產(chǎn)物檢測。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的檢測方法應(yīng)該按照國際標(biāo)準(zhǔn)、國家標(biāo)準(zhǔn)、區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的方式選擇。需要實(shí)驗(yàn)室自制標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，要進(jìn)行嚴(yán)格的檢測檢驗(yàn)，確保合格后才能使用。此外，在檢測中所采用的各種方法都應(yīng)該受到質(zhì)量管理控制。

5 環(huán)境管理

5.1功能劃分

在實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部應(yīng)該將其劃分為試劑儲(chǔ)存區(qū)域、準(zhǔn)備區(qū)域、樣品處理區(qū)域、基因擴(kuò)增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)域。如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)置配置熒光PCR儀，則擴(kuò)增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)域可以合并。各個(gè)功能區(qū)域間應(yīng)該按照上述順序進(jìn)行妥善的劃分，并保證整個(gè)操作單向流動(dòng)，形成一個(gè)單向的保護(hù)屏障，避免不同區(qū)域之間的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生相互干擾，造成樣品污染，影響最終的檢測結(jié)果。

5.2室內(nèi)環(huán)境控制

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)前后，需要使用紫外線燈對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行嚴(yán)格的照射消毒，每次照射消毒時(shí)間不得低于30min，能有效破壞殘留在檢測環(huán)境中的RNA。紫外線消毒結(jié)束后，選擇使用10%次氯酸鈉溶液或1%過氧乙酸溶液，對(duì)整個(gè)地面和工作臺(tái)面進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和衛(wèi)生消毒。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的樣本和擴(kuò)增產(chǎn)物是氣溶膠的主要污染源，因此要保證實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常性的換氣消毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所使用的一次性設(shè)備，應(yīng)該嚴(yán)格的無害化處理，各種廢棄的反應(yīng)試管和槍頭應(yīng)該放置于1mo1/L稀鹽酸中浸泡處理[2]，泡時(shí)間不能低于6h。各種廢棄物必須進(jìn)行高壓滅菌處理，按照醫(yī)療垃圾進(jìn)行無害化處理，防止對(duì)周圍環(huán)境造成污染。

6 檢測過程質(zhì)量控制

6.1核酸提取

熒光RT-PCR檢測工作開展中，RNA的提取質(zhì)量直接決定著檢測結(jié)果的正確性和靈敏度。在實(shí)驗(yàn)操作中一定要嚴(yán)格按照試劑盒的相關(guān)要求，在二級(jí)生物安全柜內(nèi)操作，每一步驟應(yīng)該認(rèn)真仔細(xì)，避免各項(xiàng)試劑被污染，避免樣本之間相互交叉污染。在開關(guān)EP管時(shí)，要注意手的任何部位都不能觸及試管口和內(nèi)部。樣品添加時(shí)應(yīng)該進(jìn)行陰性對(duì)照添加，首先加樣，然后再添加低濃度的樣品，最后添加陽性對(duì)照。不能手動(dòng)混勻樣品或者使用移液器混合樣品，要使用指定的儀器震蕩混合。

6.2擴(kuò)增

在擴(kuò)增操作中，檢測人員必須按照儀器設(shè)備的使用規(guī)程進(jìn)行上機(jī)操作，保障各個(gè)試管平衡擺放。對(duì)于PCR管加蓋平蓋或者光膜時(shí)，不能用手直接觸碰，更不能使用記號(hào)筆標(biāo)記[3]。通常大多數(shù)儀器設(shè)備都會(huì)自動(dòng)扣除本底給出擴(kuò)增曲線，對(duì)于個(gè)別因?yàn)楦鞣N原因?qū)е碌氖д?，在判定中?yīng)該將其排除。

7 結(jié)束語

RT-PCR檢測方法對(duì)技術(shù)人員的要求較高，任何一個(gè)細(xì)小的疏忽都有可能造成假陽性和假陰性，導(dǎo)致檢測結(jié)果不能反映真實(shí)的病毒感染情況，因此在實(shí)驗(yàn)室診斷中，特殊檢測人員在檢測中不斷加強(qiáng)自身專業(yè)素質(zhì)提升，在操作中認(rèn)真細(xì)致，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)程開展實(shí)驗(yàn)，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、精確性。

參考文獻(xiàn)

[1]劉賀.熒光RT-PCR準(zhǔn)確性的影響因素及控制策略[J].中國動(dòng)物檢疫，2013，30（11）：26-28.

[2]劉賀.獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室RT-PCR的質(zhì)量控制[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（10）：115-117.

[3]蘭玲，王濤.熒光RT-PCR與普通RT-PCR檢測技術(shù)的比較[J].新疆畜牧業(yè)，2012（3）：34-35.

作者簡介：黃美芝（1983-），女，壯族，獸醫(yī)師，本科，主要從事實(shí)驗(yàn)室檢測方面的工作。