牛呼吸道合胞體病毒流行病學的研究

馬莉莉，倪宏波

牛呼吸道合胞體病毒流行病學的研究

馬莉莉，倪宏波?

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163319）

牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）是一種有包膜單股負鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科中肺病毒屬病毒成員。自從20世紀70年代初BRSV被確認為是牛犢中引起呼吸道疾病的主要原因。眾多免疫學和分子生物學方法的出現(xiàn)方便BRSV的研究。盡管如此，流行病學、分子流行病學和病毒的進化等許多方面仍然沒有完全了解。自然感染過程的復雜使診斷更難，急需更好的治療預防措施控制疾病。了解BRSV才能夠建立感染機制，才能防止病毒和疾病的傳播。本文綜述了有關BRSV流行病學和分子流行病學的重要信息，并突出了病毒進化在病毒傳播中的重要性。

牛呼吸道合胞病毒；全球分布；基因型；演化

1 簡介

牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是主要在犢牛中引起一種急性呼吸道綜合征的病原體，由于高的發(fā)病率、死亡率和治療成本，導致BRSV感染生產(chǎn)損失和經(jīng)濟損失[1]。BRSV是一種有包膜、非分段、負鏈的RNA，副黏液病毒科，肺病毒亞科，肺病毒屬成員。病毒體含有三種表面糖蛋白（糖蛋白[G]、融合蛋白[F]和小疏水蛋白[SH]）。包膜由核蛋白（N）、磷蛋白（P）組成的螺旋形核衣殼，病毒RNA依賴性聚合酶蛋白（L）的M蛋白和稱作M2-1轉錄抗終止因子，基因組RNA（約15 000個核苷酸）也編碼RNA調控蛋白M2-2和兩個非結構蛋白，NS1和NS2[2]。

BRSV和人類呼吸道合胞病毒（HRSV）密切相關，兩種病毒之間的流行病學有相似之處也有差異[3]。兩種病毒之間的相似性為揭示BSRV可致病性提供便利的研究機制，近年來對于全球流行病學和BRSV分子流行病學了解已顯著提高，研究BRSV流行病學和分子流行病學的各個方面，以及病毒進化之間的關系。

2 流行病學

BRSV感染在世界傳播廣泛，牛最易感染，綿羊也可被感染，傳染率通常相當高，可以在畜群之間進行病毒傳播。牛群之間局部擴散和空氣傳播對畜群間傳播并不是非常重要，畜群的直接傳輸通常會導致感染新動物，而間接傳輸是由人群攜帶進行傳播，BRSV通常在冬季暴發(fā)，血清感染的陽性率在不同區(qū)域良莠不齊[4]。發(fā)病率相當高，某些情況乳牛群中臨床呼吸疾病高達60%。BRSV可以成為影響各年齡動物的流行病，接觸病毒的畜群傾向于感染更年輕的動物和易感動物。種群內病毒的生存機制尚不完全清楚，可從無癥狀的動物中分離病毒并持續(xù)數(shù)月，也會持續(xù)感染相對孤立狀態(tài)下的小牛[5]，可能由于發(fā)生潛伏感染造成的。據(jù)報道牛亞臨床感染不保證BRSV的持久性，認為感染來源于臨床帶病動物，旨在評估病毒傳播的持久性，以充分理解BRSV的傳輸機制。

在北美患病率很大，1970年初美國研究表明成年牛中67%的感染率，無癥狀牛血清陽性率高達95%[6]。血清陽性率似乎與宿主年齡密切相關，在老年動物中發(fā)病率較高，美國南部地區(qū)普遍表現(xiàn)出更高的血清陽性率相比于北部地區(qū)。而其他病毒，如牛病毒性腹瀉和副流感病毒也提高了死亡率。在歐洲大陸傳播情況下，從瑞典南部地區(qū)的樣品中觀察到牛奶樣品中高的抗體頻率，北部樣品檢測率較低，表明BRSV感染主要發(fā)生在瑞典中西部和南部地區(qū)。丹麥報道BRSV感染率（54%）相當高[7]，在比利時觀察到BRSV感染的高流行性，在英格蘭報道散裝罐牛奶樣品中存在抗體。在非洲，埃塞俄比亞和南非也證明有高發(fā)率的BRSV感染，高血清陽性率也與設施有關，有機農場相比于傳統(tǒng)農場表現(xiàn)出較低抗體。因此，需要更多的信息來了解地理區(qū)域病毒存活的機制，此外對于牛群爆發(fā)的監(jiān)測可以提供更有價值的信息，幫助了解BRSV感染的流行病學。

3 分子流行病學

有關BRSV感染的分子流行病學的資料有限，但DNA測序可能有助于揭開BRSV傳輸?shù)姆肿訖C制，系統(tǒng)遺傳學可以確定不同基因型BRSV的親緣關系，同時了解BRSV的分子基礎，以及用于研究BRSV起源和后續(xù)演進。最新序列信息有助于了解BRSV感染模式[8]，目前進化方法方便促進研究新毒株的起源，病毒重組的鑒定，群體大小的出現(xiàn)，病毒傳播以及演變。分子流行病學方法提供關于BRSV演化的重要見解，病毒分子流行病學的研究很可能會提高病毒傳播的動態(tài)。BRSV分離物中出現(xiàn)抗原的變異，針對特定病毒株的多克隆血清缺乏建議，沒有認識到不同分離物之間的反應，此外也可以推斷一些結構蛋白的分子大小，暗示BRSV是由不同的亞組組成。BRSV存在多樣性，在開創(chuàng)性研究中，BRSV中表現(xiàn)出不同識別模式，表明抗原的多樣性，雖然BRSV疫苗有很多功效，但疫苗的失敗可能是歸因于BRSV更廣泛的抗原譜，報告也認為有兩種不同BRSV亞組的存在。

BRSV的分子流行病學研究始于核苷酸糖蛋白（G）、融合蛋白（F）、核衣殼（N）、基質（M）、磷蛋白（P），20世紀90年代初疏水性（SH）和M2蛋白初步評價了兩個菌株之間P蛋白的同源性，顯示有97%同一性的核苷酸水平[9]。隨后分析有限數(shù)量的核苷酸變異G蛋白的水平，表明BRSV菌株之間的同一性的水平介于84%和95%。這種程度的異質性表明只存在單一基因組。BRSV株之間抗原異質性和分子多樣性之間的直接比較表明抗原性差異是亞組間變化的結果，在野生BRSV菌株也證實存在抗原變異。

通過單克隆抗體識別G蛋白部分核苷酸序列，對抗BRSV G、F、N和P蛋白表明分離株隨機抗原的差異性。觀察病毒蛋白存在表位交叉反應，特別是F蛋白。此外觀察F蛋白和P蛋白結構上存在差異，P蛋白表現(xiàn)出多樣性，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時分子大小表現(xiàn)差異，與抗原相關的F、N蛋白沒有觀察到和P蛋白結構上的差異。G蛋白的核苷酸序列同一性介于94.1%～99.9%。相比較而言，預測的氨基酸序列同源性范圍為89.9%～99.6%，認為BRSV屬于一個單系群[10]。

更全面的研究分析針對BRSV G蛋白的反應模式，從不同地理區(qū)域分離的G蛋白基因段發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性，表明BRSV株之間組內遺傳變異88%～100%之間[11]。相應系統(tǒng)遺傳分析表明存在兩個主要分支，分支被進一步細分為兩組，Ia和Ib，再分成五個不同譜系，每個代表一個集群，Ia族所含毒株屬于抗原亞組A；而分支Ib包括歐洲血統(tǒng)屬于亞組B；分支Ⅱ，分類為抗原亞組B；第三個集群包括斯堪的納維亞株[11]。間接觀察進化樹和一些菌株之間的抗原模式關系認為BRSV屬于單個抗原組，與研究組有不同的遺傳變異體。瑞典和丹麥之間的比較分析表明，瑞典株的還原序列多樣性可能是瑞典封閉欄中奶牛的有限進口造成的，這些發(fā)現(xiàn)認為母牛進口增加了區(qū)域BRSV譜系核苷酸序列的多樣性。

一項大規(guī)模研究歐洲、北美BRSV的分子流行病學和進化，該研究評估了N、F和G蛋白的核苷酸多樣性，并分析氨基酸序列以及它們的親緣關系。百分比為G蛋白基因（8%），N和F蛋白的基因最低（2%）[12]。一般來說，在所有BRSV蛋白中觀察到同區(qū)域內動物的同源性，其中N和G蛋白基因序列中檢測到的基因序列的差異，表明單個病毒或密切相關的病毒會在給定時間內傳染指定的畜群。在系統(tǒng)遺傳分析基礎上，G蛋白質序列分成六個不同的組，進行N和F蛋白基因序列的分析；觀察到任一蛋白質只有五個聚類組。如預期的一樣，BRSV序列的特征聚類是根據(jù)地理來源區(qū)別的，進一步觀察確定地理和時間聚類的理論。在1976年前歐洲分離出亞群I，美國的病毒分離出亞組Ⅲ。從北歐、丹麥和瑞典株發(fā)現(xiàn)亞組Ⅱ呈簇狀，荷蘭、比利時和法國分別發(fā)現(xiàn)亞組Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ[13]。研究發(fā)現(xiàn)動物感染用BRSV疫苗的免疫接種失敗，表明商業(yè)疫苗對抗感病毒染效果不佳，此外觀察到BRSV的N、G和F蛋白的演變，可能與不同國家疫苗接種相關，在G蛋白、N和F蛋白的特定區(qū)域都有強的陽性反應等。法國BRSV分離株列入本研究還顯示保守中央疏水部位于突變G蛋白胞外域[14]，形成四個Cys殘基、兩個二硫鍵、一個螺旋，這些對G蛋白的三維結構至關重要，高度保守區(qū)域不斷修改免疫G蛋白，增加BRSV在疫苗發(fā)展上的重要性?？傮w來說現(xiàn)代分子流行病學為研究不同區(qū)域BRSV分子流行病學模式建立了基礎。BRSV已被證明作為病毒復雜混合物變種的存在，稱為不確定的“變異種”。在臨床分離株BRSV G蛋白基因的分析中證明亞群的共存性，克隆分析G-編碼區(qū)的核苷酸異質性表現(xiàn)出每個核苷酸突變頻率范圍是從6.8×104到10.1×104進行替換[15]，結果表明，BRSV種群進化的復雜和動態(tài)性，盡管這種病毒遺傳有明顯的穩(wěn)定性。

在牛群間相同病毒的循環(huán)通過分子流行病學途徑表現(xiàn)出來，特別是疾病暴發(fā)期間。然而病毒株復發(fā)性也會發(fā)生顯著變化（高達11%），在牛群中不同BRSV的循環(huán)變異會持續(xù)感染小牛。由于病毒進化，新的高強度病毒成為主體傳播給動物，高水平多樣性的爆發(fā)可能表明BRSV是從外引進新病毒株的結果[16]。所有研究集中于基因編碼G蛋白核苷酸序列的研究，通過G蛋白獲得的信息已經(jīng)用于了解BRSV的序列，區(qū)域所提供的序列信息用于表明病毒株。未來研究會分析更多BRSV部分，以及病毒基因組的全長，這些將有可能為該病毒株提供更準確的理解。BRSV全球分子流行病學研究一直難以實現(xiàn)，目前少量文獻報告提供了BRSV的分布情況。分子BRSV的表征區(qū)域在世界仍然是相當不完整，日本在21世紀初進行一項關于亞群菌株循環(huán)的研究，該菌株被進一步細分為兩個不同譜系[17]，但這項研究只有極少數(shù)菌株，并未全面了解該地區(qū)BRSV的分子流行病學的研究。巴西研究確定少量BRSV B組毒株，另一項研究表明英國分離株基因和美國毒株有關，兩份報告都表明BRSV流行病學對全球進口活牛分子研究起的重要作用[18]。

綜上所述，在過去二十年中BRSV的分子流行病學研究有很大發(fā)展。分子特性的研究以及BRSV株系統(tǒng)遺傳和進化已經(jīng)推進我們對于病毒和疾病傳播的分子機制的研究，但該領域仍然需要廣泛的研究來揭示病毒的持久性。BRSV在不同地理區(qū)域的分子監(jiān)控的建立將有可能提高病毒暴發(fā)的識別，預防措施為了控制病情。新一代測序“DNA測序時代”可以發(fā)現(xiàn)宿主的病毒復制和生存的基本能力。

4 結束語

BRSV被認為是近幾十年中引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的重要病因，病毒基因組特異性和復制低保真度維持病毒在宿主內的生存和持續(xù)性。從臨床標本中分離的病毒菌株，病毒顆粒通常有不穩(wěn)定性，但分子生物學的方法可以成為BRSV在臨床上正確識別和鑒定的金標準，BRSV在分子流行病學領域取得的顯著的進步，可以增強我們在全球BRSV的分布和傳輸模式上的了解?？傊路肿訉W方法包括新一代測序的到來，將可能幫助揭開不同地理區(qū)域病毒基因的組成，以及病毒持久性傳播的機制。

[1]王麗榮.牛呼吸道合胞體病毒的病原學與診治[J].獸醫(yī)臨床，2006（6）：70-72.

[2]Ohlson A.,Heuer C.,Lockhart C.,et al.Risk factors for seropositivity to bovine coronavirus and bovine respiratory syncytial virus in dairy herds[J].Vet.Rec,2010（167）: 201-66.

[3]王曉梅.牛呼吸道合胞體病毒病的流行及診治[J].獸醫(yī)臨床，2011（8）：74.

[4]Smith R.A.Effects of feedlot disease on economics,production and carcass value[J].The American Association of Bovine Practitioners Proceedings,2000,(33):125-128.

[5]李鵬，張淑琴，溫永俊，等.牛病毒性呼吸道疾病診斷技術研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2013，34（4）：90-93.

[6]Lamb R.A.,Parks G.D.Paramyxoviridae:The Viruses and their Replication.In Fields Virology,5th ed.Knipe,D.M.Howley,P.M.,Eds [J].Lippincott Williams&Williams:Philadelphia,PA,USA,2007,2:1449-1496.

[7]Woldemeskel M.,Kebede E.,Yigezu L.,et al. Prevalence of bovine respiratory syncytial virus(BRSV)and bovine herpesvirus-4 (BHV-4)in cattle from Ethiopia[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,2000,107:464-466.

[8]王紅，侯喜林，樸范澤.牛呼吸道合胞體病毒的分離鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報，2009，9：1414-1419.

[9]翁善鋼.牛呼吸道合胞體病毒的流行與診斷[J].中國奶牛，2013，8：45-47.

[10]Brodersen B.W.Bovine respiratory syncytial virus.Vet.Clin.North.Am[J].Food Anim. Pract.,2010,26:323-333.

[11]Grubbs S.T.,Kania S.A.,Potgieter L.N.Prevalence of ovine and bovine respiratory syncytial virus infections in cattle determined with a synthetic peptide-based immunoassay [J].Vet.Diagn.Invest.,2001,13:128-132.

[12]Almeida R.S.,Domingues H.G.,Spilki F.R., et al.Circulation of bovine respiratory syncytial virus in Brazil[J].Vet.Rec.,2006, 158:632-634.

[13]Pardon B.,De Bleecker K,.Dewulf J.,et al. Prevalence of respiratory pathogens in diseased,non-vaccinated,routinely medicated veal calves[J].Vet.Rec.,2011,169:278.

[14]Valarcher J.F.,Schelcher F.,Bourhy H.Evolution of bovine respiratory syncytial virus [J].Virol,2000,74,10714-10728.

[15]Lam T.T.,Tang J.W.Use of phylogenetics in the molecular epidemiology and evolutionary studies of viral infections[J].Critical reviews in clinical laboratory sciences 2010, 47:45-49.

[16]Khudyakov Y.Coevolution and HBV drug resistance[J].Antivir.Ther.,2010,15:505-515.

[17]Spilki F.R.,Almeida R.S.,Domingues H.G., et al.Phylogenetic relationships of Brazilian bovine respiratory syncytial virus isolates and molecular homology modeling of attachment glycoprotein[J].Virus Res,2006, 116:30-37.

[18]Meyer G.,Deplanch M.,Schelcher F.Human and bovine respiratory syncytial virus vaccine research and development[J].Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.,2008,31: 191-225.

Epidemiology,Molecular Epidemiology of Bovine Respiratory SyncytialVirus

Ma Lili,Ni Hongbo*
(College of animal science and technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Bovine respiratory syncytial virus(BRSV)is an enveloped single strand RNA virus, the virus belongs to the members of the family Paramyxoviridae pneumovirus.Since the beginning of 1970s BRSV was confirmed to be the main reason of respiratory disease caused by the calf.Research facility BRSV many immunological and molecular biological methods.In spite of this in many ways,epidemiology,molecular epidemiology and the evolution of the virus is still not fully understood.The natural infection process complex and make the diagnosis more difficult,treatment needs better preventive measures to control the disease.Understanding BRSV infection to be able to establish a mechanism to prevent the spread of virus and disease.This paper reviews the important information about the epidemiology and molecular epidemiology of BRSV the virus evolution and highlighted the importance of transmission of the virus.

Bovine respiratory syncytial virus;Global distribution;Genotype;Evolution

S858.23

A

1672-9692(2016)11-0037-04

2016-10-09

馬莉莉（1992-）,女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向為分子細菌學和免疫學。

倪宏波（1972-）,男，黑龍江人，教授，博士生導師，主要從事分子細菌學和免疫學研究。