采用UPLC—MS/MS法研究辣薄荷基厚樸酚在不同種屬肝微粒體中的代謝特征

鄧星 羅莉婭 茍立平 溫倩雯 湯明海 萬(wàn)麗

中圖分類號(hào) R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）02-0170-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.06

摘 要 目的：建立測(cè)定肝微粒體孵育體系中辣薄荷基厚樸酚濃度的方法，并探討其在不同種屬肝微粒體中的代謝特征。方法：分別將辣薄荷基厚樸酚溶解于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）啟動(dòng)的人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒體孵育體系中，置于37 ℃水浴中進(jìn)行孵育，分別于孵育的0、2、5、10、15、20、30、45、60 min時(shí)用甲醇終止反應(yīng)，以厚樸酚為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定各孵育體系中辣薄荷基厚樸酚的質(zhì)量濃度。色譜柱為Acquity UPLCTM CSH C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL；離子源為電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行正離子掃描，用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 401.2→331.1（辣薄荷基厚樸酚）、m/z 265.1→247.0（內(nèi)標(biāo)）。以孵育0 min時(shí)辣薄荷基厚樸酚的質(zhì)量濃度為參照，計(jì)算其在不同孵育體系中的藥物剩余百分比、體外代謝半衰期（t1/2）和固有清除率（CLint）。采用化學(xué)抑制劑法探討辣薄荷基厚樸酚的代謝途徑；在上述色譜條件下，采用一級(jí)全掃描以正離子方式檢測(cè)，初步分析其體外代謝產(chǎn)物。結(jié)果：辣薄荷基厚樸酚質(zhì)量濃度檢測(cè)的線性范圍為3.91～500.00 ng/mL，定量下限為3.91 ng/mL；日內(nèi)、日間RSD均小于10%，準(zhǔn)確度為87.40%～103.75%，基質(zhì)效應(yīng)不影響待測(cè)物的測(cè)定。辣薄荷基厚樸酚在人、大鼠、小鼠、犬肝微粒體中代謝明顯，而在猴肝微粒體中代謝不明顯；孵育30 min后，其在各種屬肝微粒體的藥物剩余百分比趨于穩(wěn)定。辣薄荷基厚樸酚在人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒體中的t1/2分別為12.07、17.68、17.59、216.56、61.88 min，CLint分別為0.115、0.078、0.079、0.006、0.022 mL/（min·mg）。細(xì)胞色素P450（CYP）2A6、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2酶對(duì)該化合物代謝的抑制率分別為55.76%、93.94%、96.01%、93.69%、71.81%、23.25%、28.04%。辣薄荷基厚樸酚在人肝微粒體中兩個(gè)主要代謝產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 441.2（[M+Na]+）、m/z 337.2（[M+H]+）。結(jié)論：本研究建立的UPLC-MS/MS法簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)，可用于肝微粒體孵育體系中辣薄荷基厚樸酚濃度的測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)的研究。該化合物在人、大鼠、小鼠、猴、犬等5種肝微粒體中的代謝特征有差異，且其代謝過(guò)程可能與CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9等酶有關(guān)。

關(guān)鍵詞 辣薄荷基厚樸酚；不同種屬；肝微粒體；體外代謝穩(wěn)定性；代謝酶；代謝產(chǎn)物

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of piperitylmagnolol in the incubation system of liver microsomes， and to investigate the metabolic characteristics of it in different species of liver microsomes. METHODS： The piperitylmagnolol were respectively dissolved in NADPH activated liver microsome incubation systems of human， rat， mouse， monkey and dog， and then incubated in water at 37 ℃. The reaction was terminated with methanol at 0， 2， 5， 10， 15， 20， 30， 45 and 60 minutes of incubation， respectively. Using magnolol as internal standard， UPLC-MS/MS method was used to determine the concentration of piperitylmagnolol in the incubation system. The determination was performed on Acquity UPLCTM CSH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid-methanol （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the sample size was 2 μL. The ion source was electrospray ion source， and the positive ion scanning was carried out in the multiple reaction monitoring mode. The ion pairs used for quantitative analysis were m/z 401.2→331.1 （piperitylmagnolol） and m/z 265.1→247.0 （internal standard）， respectively. Using the concentration of piperitylmagnolol at 0 min of incubation as a reference， the residual percentage， metabolism half-life in vitro （t1/2） and intrinsic clearance （CLint） were calculated for different incubation systems. The metabolic pathway of piperitylmagnolol was studied by chemical inhibitor method. Under the above chromatographic conditions， the metabolites in vitro were preliminarily analyzed by first-order full scanning and positive ion detection. RESULTS： The linear range of piperitylmagnolol was 3.91-500.00 ng/mL. The limit of quantitation was 3.91 ng/mL. RSDs of intra-day and inter-day were less than 10%. The accuracy ranged 87.40%-103.75%. Matrix effect didn’t affect the determination of the substance to be measured. The piperitylmagnolol was metabolized significantly in human， rat， mouse and dog liver microsomes， but not in monkey liver microsomes. After incubating for 30 min， residual percentage of piperitylmagnolol kept stable in different species of liver microsomes. The t1/2 of piperitylmagnolol were 12.07， 17.68， 17.59， 216.56 and 61.88 min in human， rat， mouse， monkey and dog liver microsomes； CLint were 0.115， 0.078， 0.079， 0.006， 0.022 mL/（min·mg）， respectively. Inhibitory rates of CYP2A6， CYP2D6， CYP2C19， CYP3A4， CYP2C9， CYP2E1 and CYP1A2 to compound metabolism were 55.76%， 93.94%， 96.01%， 93.69%， 71.81%， 23.25%， 28.04%， respectively. Quasi-molecular ion peaks of the two main metabolites of piperitylmagnolol in human liver microsomes were m/z 441.2（[M+Na]+） and m/z 337.2（[M+H]+）， respectively. CONCLUSIONS： Established UPLC-MS/MS method is simple， rapid and specific， and can be used for the determination of piperitylmagnolol concentration in the incubation system of liver microsomes and pharmacokinetic study. The metabolic characteristics of the compound are different among liver microsomes of human， rat， mouse， monkey and dog. Its metabolism process may be associated with CYP2D6， CYP2C19， CYP3A4， CYP2C9， etc.

KEYWORDS Piperitylmagnolol； Different species； Liver microsomes； Metabolic stability in vitro； Metabolic enzyme； Metabolites

木脂素類（Lignans）化合物由于其多樣的結(jié)構(gòu)和生物活性一直是目前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一[1]。相關(guān)研究指出，該類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝及抑制血小板活化因子等藥理作用[2]。辣薄荷基厚樸酚（Piperitylmagnolol，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）最早被發(fā)現(xiàn)于木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）的干燥干皮、枝皮及根皮中[3]，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等活性[4]，屬于木脂素中的新木脂素類化合物。Youn UJ等[5]研究發(fā)現(xiàn)，辣薄荷基厚樸酚對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa、慢性髓系白血病細(xì)胞K562、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116等多種人腫瘤細(xì)胞具有一定的體外抑制活性，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為7.7～9.5 μg/mL；Syu WJ等[6]研究表明，辣薄荷基厚樸酚和厚樸酚對(duì)耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等耐藥菌株均有一定的體外抑制作用，其最低抑制濃度（MIC）為6.25～25 μg/mL，且辣薄荷基厚樸酚的抑菌效果更好。由此可見(jiàn)，該化合物具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

與體內(nèi)代謝研究相比，體外代謝研究具有操作簡(jiǎn)單方便、經(jīng)濟(jì)高效、檢測(cè)多樣化的特點(diǎn)，更適用于新藥代謝特征的早期評(píng)價(jià)[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于辣薄荷基厚樸酚的相關(guān)研究尚少，為進(jìn)一步明確其開(kāi)發(fā)價(jià)值，本研究以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）為檢測(cè)手段，初步考察了該化合物在5個(gè)不同種屬（人、大鼠、小鼠、猴、犬）肝微粒體中的體外代謝穩(wěn)定性，并預(yù)測(cè)了參與其代謝的主要同工酶和主要代謝產(chǎn)物，旨在獲取辣薄荷基厚樸酚的體外代謝特征，為其后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UPLC系統(tǒng)，含SIL-30AC型自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-30AD型色譜儀、CBM-20A型系統(tǒng)控制器、CTO-20AC型柱溫箱（日本Shimadzu公司）；SCIEX QTRAP 5500型三重四級(jí)桿MS儀（美國(guó)AB公司）；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Heraeus Fresco 17型高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；S0200-230型渦旋混合儀（上海迪奧生物科技有限公司）；Milli Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Merck Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

辣薄荷基厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)：20170323，純度：>99%）、厚樸酚對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：20161103，純度：>99%）均由四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；人肝微粒體（批號(hào)：M10001-2017002，質(zhì)量濃度：20 mg/mL）、大鼠肝微粒體（批號(hào)：M10011-2017002，質(zhì)量濃度：20 mg/mL）、小鼠肝微粒體（批號(hào)：M10017-2017002，質(zhì)量濃度：20 mg/mL）、猴肝微粒體（批號(hào)：M10005-2017002，質(zhì)量濃度：20 mg/mL）、犬肝微粒體（批號(hào)：M10007- 2017002，質(zhì)量濃度：20 mg/mL）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）孵育系統(tǒng){含A液[β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽、葡萄糖-6-磷酸、氯化鎂水溶液，批號(hào)：NRS（A）2017001]、B液[葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、檸檬酸鈉溶液，批號(hào)：NRS（B）2017001]}均購(gòu)自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；硝酸毛果蕓香堿對(duì)照品（批號(hào)：100157-200201，純度：供含量測(cè)定用）、鹽酸噻氯匹定對(duì)照品（批號(hào)：100542-201002，純度：>99.7%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；奎尼丁對(duì)照品[梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：KVZTE-LQ，純度：>98%]；酮康唑?qū)φ掌罚ǖ聡?guó)Dr Ehrenstorfer公司，批號(hào)：11208，純度：>99%）；磺胺苯吡唑?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：SLBC7923V，純度：>99%）、二乙基二硫代氨基甲酸鈉對(duì)照品（批號(hào)：MKBJ4989V，純度：99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；α-萘黃酮對(duì)照品（東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：UEESA-JQ，純度：>98.0%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLCTM CSH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min，80%B→90%B；2～5 min，90%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；離子噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：20 psi。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描，正離子方式檢測(cè)。用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 401.2→331.1（辣薄荷基厚樸酚）和m/z 265.1→247.0（內(nèi)標(biāo)），碰撞能量（CE）分別為38、30 eV，去簇電壓（DP）均為130 V；離子束聚焦電壓（EP）：10 V；碰撞池出口電壓（CXP）：10 V；駐留時(shí)間：0.20 s。

2.2 溶液的配制

2.2.1 辣薄荷基厚樸酚貯備液及系列工作液 取辣薄荷基厚樸酚對(duì)照品10.00 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的辣薄荷基厚樸酚貯備液，于4 ℃冰箱中密封保存，備用。臨用前，用甲醇逐級(jí)稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度，即得辣薄荷基厚樸酚系列工作液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)貯備液及內(nèi)標(biāo)溶液 取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品10.00 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，于4 ℃冰箱中密封保存，備用。臨用前，用甲醇稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度，即得內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 特異性抑制劑溶液 分別取細(xì)胞色素P450（CYP）酶抑制劑硝酸毛果蕓香堿、奎尼丁、鹽酸噻氯匹定、酮康唑、磺胺苯吡唑、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、α-萘黃酮對(duì)照品各10.00 mg，精密稱定，用甲醇分別定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的特異性抑制劑貯備液，于4 ℃冰箱中密封保存，備用。臨用前，用甲醇稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度，即得特異性抑制劑溶液。

2.3 樣品孵育與處理

2.3.1 樣品孵育 參照文獻(xiàn)[8]配制孵育體系。其總體積為200 μL，包含磷酸鹽緩沖液（PBS，100 mmol/L，pH 7.4）188 μL和NADPH孵育系統(tǒng)12 μL（含A液10 μL和B液2 μL），于冰浴上混合而得（現(xiàn)用現(xiàn)配），隨后加入質(zhì)量濃度為100 μg/mL的辣薄荷基厚樸酚工作液（該孵育體系中甲醇的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)低于1%），于37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min后，加入肝微粒體5 μL啟動(dòng)反應(yīng)。

2.3.2 樣品處理 取孵育后的樣品200 μL，于不同時(shí)間點(diǎn)加入4 ℃甲醇（含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL）400 μL終止反應(yīng)，渦旋混勻3 min后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液適量進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 取人肝微粒體適量，經(jīng)高溫滅活后，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備不含待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的空白對(duì)照樣品、含上述物質(zhì)的樣品以及體外代謝穩(wěn)定性研究孵育樣品（人肝微粒體，孵育5 min時(shí)的樣品），再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，辣薄荷基厚樸酚和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為4.68、2.33 min，分離度良好，且沒(méi)有受到空白基質(zhì)的干擾，表明本法專屬性強(qiáng)，詳見(jiàn)圖2。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與定量下限的考察 按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制辣薄荷基厚樸酚系列工作液，分別量取上述工作液2 μL，加入PBS 200 μL，混勻，加至經(jīng)高溫滅活的人肝微粒體中，制得辣薄荷基厚樸酚質(zhì)量濃度分別為3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)法（加權(quán)系數(shù)為1/x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.409 6x+0.069 9（R2=0.999 6）。結(jié)果表明，辣薄荷基厚樸酚質(zhì)量濃度檢測(cè)的線性范圍為3.91～500.00 ng/mL，定量下限為3.91 ng/mL。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制辣薄荷基厚樸酚低、中、高質(zhì)量濃度（7.81、62.50、400.00 ng/mL）質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作5次，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度；將實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD均小于10%，準(zhǔn)確度分別為91.11%～100.37%、87.40%～103.75%、87.06%～98.67%，符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[9]，詳見(jiàn)表1。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制辣薄荷基厚樸酚低、中、高質(zhì)量濃度（7.81、62.50、400.00 ng/mL）質(zhì)控樣品，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得相應(yīng)峰面積（A）；另用流動(dòng)相配制與上述質(zhì)控樣品理論質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，得相應(yīng)峰面積（B）。每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作5次。基質(zhì)效應(yīng)=A/B×100%。結(jié)果顯示，辣薄荷基厚樸酚的基質(zhì)效應(yīng)為85.40%～103.75%（RSD為3.72%～6.79%，n=5），內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)為99.96%～100.37%（RSD為1.21%～2.03%，n=5），表明本法受基質(zhì)效應(yīng)的影響較小，詳見(jiàn)表1。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制辣薄荷基厚樸酚低、中、高質(zhì)量濃度（7.81、62.50、400.00 ng/mL）質(zhì)控樣品，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作5次，考察各質(zhì)控樣品于室溫及自動(dòng)進(jìn)樣室（4 ℃）內(nèi)放置24 h的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在上述條件下，辣薄荷基厚樸酚各質(zhì)控樣品起止時(shí)間點(diǎn)峰面積的比值為86.98%～96.51%（RSD為0.79%～3.70%，n=5），表明其穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表2。

2.5 辣薄荷基厚樸酚體外代謝特征研究

2.5.1 代謝穩(wěn)定性 取“2.2.1”項(xiàng)下辣薄荷基厚樸酚貯備液適量，用甲醇稀釋至40 μg/mL，取上述稀釋后的溶液2 μL，加至“2.3.1”項(xiàng)下孵育體系中，于37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min后，加入肝微粒體5 μL啟動(dòng)反應(yīng)。分別于孵育0、2、5、10、15、20、30、45、60 min時(shí)加入4 ℃甲醇（含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL）各400 μL終止反應(yīng)，渦旋混勻3 min后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液，按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各體系中辣薄荷基厚樸酚的質(zhì)量濃度。以孵育0 min時(shí)辣薄荷基厚樸酚的質(zhì)量濃度為參照，其他時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度與之相比計(jì)算其藥物剩余百分比；以藥物剩余百分比為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)，采用Excel 2016軟件繪制辣薄荷基厚樸酚在5種肝微粒體孵育體系中的孵育曲線，詳見(jiàn)圖3。各種屬肝微粒體孵育體系均平行操作3次。

由圖3可見(jiàn)，辣薄荷基厚樸酚在人、大鼠、小鼠、犬等4種肝微粒體中的代謝明顯，而在猴肝微粒體中的代謝不明顯。孵育30 min后，其在各種屬肝微粒體中的藥物剩余百分比變化較小，代謝逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5.2 體外半衰期（t1/2）與固有清除率（CLint）的計(jì)算 計(jì)算辣薄荷基厚樸酚人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒體中的代謝相關(guān)參數(shù)：將各時(shí)間點(diǎn)的藥物剩余百分比的自然對(duì)數(shù)（y）與孵育時(shí)間（x）作線性回歸，得相應(yīng)回歸方程；以上述線性回歸方程的斜率（k）根據(jù)公式t1/2=-0.693/k計(jì)算得其t1/2，并按公式CLint=0.693×孵育液體積（mL）/[t1/2×肝微粒體質(zhì)量（mg）]計(jì)算得其CLint[10]，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 辣薄荷基厚樸酚的代謝途徑分析

參照“2.5”項(xiàng)下確定的辣薄荷基厚樸酚在不同種屬肝微粒體中的代謝相關(guān)參數(shù)，采用化學(xué)抑制劑法[11]對(duì)其代謝途徑進(jìn)行初步探討。在“2.3.1”項(xiàng)下孵育體系中分別加入“2.5.1”項(xiàng)下40 μg/mL辣薄荷基厚樸酚溶液1 μL和各特異性抑制劑（按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制，并折算為摩爾濃度，即CYP2A6抑制劑硝酸毛果蕓香堿25 μmol/L、CYP2D6抑制劑奎尼丁10 μmol/L、CYP2C19抑制劑鹽酸噻氯匹定25 μmol/L、CYP3A4抑制劑酮康唑1 μmol/L、CYP2C9抑制劑磺胺苯吡唑20 μmol/L、CYP2E1抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉50 μmol/L以及CYP1A2抑制劑α-萘黃酮1 μmol/L[12-13]）1 μL，于37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min后，加入人肝微粒體5 μL啟動(dòng)反應(yīng)，混勻后，于37 ℃水浴中繼續(xù)孵育30 min，加入4 ℃甲醇（含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL）400 μL終止反應(yīng)；同時(shí)設(shè)置未發(fā)生反應(yīng)的陰性對(duì)照（即不加NADPH孵育系統(tǒng)和特異性抑制劑，用甲醇補(bǔ)足剩余體積）和完全反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照（即不加特異性抑制劑，但加NADPH孵育系統(tǒng)，用甲醇補(bǔ)足剩余體積），同法孵育。按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算辣薄荷基厚樸酚質(zhì)量濃度和抑制率[抑制率=[1-（陰性對(duì)照樣品質(zhì)量濃度-試驗(yàn)組樣品質(zhì)量濃度）/（陰性對(duì)照樣品質(zhì)量濃度-陽(yáng)性對(duì)照樣品質(zhì)量濃度）]×100%][12-13]。各種屬肝微粒體孵育體系均平行操作3次。

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果顯示，辣薄荷基厚樸酚的代謝是由多種CYP酶介導(dǎo)的，其中CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9酶對(duì)辣薄荷基厚樸酚代謝的抑制率較高，分別為93.94%、96.01%、93.69%、71.81%，表明上述4種酶可能是參與該化合物代謝的主要同工酶；而CYP2A6、CYP2E1、CYP1A2酶的抑制率較低，分別為55.76%、23.25%、28.04%，提示上述3種酶可能與該化合物的代謝無(wú)關(guān)，詳見(jiàn)表4。

2.7 辣薄荷基厚樸酚體外代謝產(chǎn)物初探

按“2.3.1”項(xiàng)下方法，于冰浴上將質(zhì)量濃度為2 mg/mL的辣薄荷基厚樸酚工作液2 μL（按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制）加至孵育體系中，于37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min后，加入人肝微粒體5 μL啟動(dòng)反應(yīng)，混勻后，分別于孵育0、60 min時(shí)加入4 ℃甲醇（含內(nèi)標(biāo)）各400 μL終止反應(yīng)，渦旋混勻3 min后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下，采用一級(jí)全掃描（MS Scan）以正離子方式檢測(cè)，掃描范圍為m/z 100～1 000，比較上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的色譜圖差異，以初步判斷辣薄荷基厚樸酚的體外代謝產(chǎn)物。

結(jié)果顯示，與0 min時(shí)的色譜圖（圖4A）比較，60 min時(shí)的色譜圖（圖4B）新增2個(gè)色譜峰，其準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 441.2（[M+Na]+）、m/z 337.2（[M+H]+）；根據(jù)該化合物的碎片離子峰初步判斷，4.347、6.903、10.653 min處的色譜峰則可能是由與肝微粒體有關(guān)的雜質(zhì)所致，詳見(jiàn)圖4、圖5。

3 討論

在新藥研發(fā)的早期階段，學(xué)者可通過(guò)研究藥物在體外肝微粒體中的代謝特征來(lái)比較其在不同種屬中代謝的差異，可為后期動(dòng)物模型的選擇和藥物在人體內(nèi)的代謝特征研究提供一定的參考[14-15]。本研究建立了測(cè)定新木脂素類化合物辣薄荷基厚樸酚質(zhì)量濃度的UPLC-MS/MS法。該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度及準(zhǔn)確度高、基質(zhì)效應(yīng)低、重復(fù)性好，可用于生物樣品中該化合物濃度的測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)的研究。

厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚結(jié)構(gòu)相近，且性質(zhì)穩(wěn)定，能與生物基質(zhì)基線分離，且保留時(shí)間、響應(yīng)值和峰形均較好，故本研究將厚樸酚選為內(nèi)標(biāo)。在前期條件篩選中，本課題組首先以甲醇-水、乙腈-水體系作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測(cè)物峰形拖尾嚴(yán)重；而在水相中加入0.1%甲酸后，能使待測(cè)物的峰形得以改善，并同時(shí)使其具有較高的響應(yīng)值和合適的保留時(shí)間。因此，本研究最終選擇0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相。此外，在方法學(xué)考察中，肝微粒體是經(jīng)高溫滅活的，且含量極低，因此可忽略不同種屬肝微粒體間的差異，故本研究最終選擇了具有代表性的人肝微粒體作為生物樣品基質(zhì)，進(jìn)行后續(xù)方法學(xué)考察。

參考《化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[16]，本研究選取5個(gè)種屬的肝微粒體進(jìn)行體外代謝特征研究。結(jié)果顯示，辣薄荷基厚樸酚在犬和猴肝微粒體中的代謝時(shí)間較長(zhǎng)（t1/2較大），在人和大鼠、小鼠肝微粒體中的代謝較為相似，提示在后續(xù)研究中可考慮以大鼠或小鼠作為臨床前藥動(dòng)學(xué)和毒理學(xué)研究的模型動(dòng)物。代謝途徑試驗(yàn)結(jié)果表明，CYP2D6、CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9酶可能參與了辣薄荷基厚樸酚的代謝過(guò)程，而CYP2A6、CYP2E1、CYP1A2酶可能與該化合物的代謝無(wú)關(guān)。這提示該化合物的體內(nèi)代謝可能涉及多種同工酶，在聯(lián)合用藥時(shí)，應(yīng)考慮上述同工酶共同作用所導(dǎo)致的藥效增強(qiáng)或中毒情況的發(fā)生[17]。體外代謝產(chǎn)物特征離子碎片峰可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z 441.2，推斷其可能是原化合物被引入羥基（—OH），然后加Na+而得；此外，還可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z 337.2，推測(cè)其可能是原化合物環(huán)己烯結(jié)構(gòu)開(kāi)環(huán)，脫去—C5H8，然后加H+而得。但其具體的代謝物結(jié)構(gòu)及代謝過(guò)程仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步確證。

綜上所述，本研究建立的UPLC-MS/MS法簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)，可用于生物樣品中辣薄荷基厚樸酚濃度的測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)的研究。該化合物在人、大鼠、小鼠、猴、犬等5種肝微粒體中的代謝特征有所差異，且其代謝過(guò)程可能與CYP2D6、CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9等酶有關(guān)。但其具體種屬代謝差異、代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)等尚需后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2018-06-06 修回日期：2018-11-10）

（編輯：張?jiān)拢?/p>