霍山石斛對腎陰虛小鼠血清IL-2、IL-6及抗氧化作用的實驗研究

侯燕 周雪 樂娜 費文婷 湯如瑩 王林元 張建軍

摘要? 目的：研究霍山石斛對腎陰虛小鼠血清白細胞介素-2（IL-2）、IL-6及抗氧化作用的影響。方法：96只昆明雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為正常組，模型組，鐵皮石斛組，六味地黃丸組，霍山石斛（0.33、1、2、3 g/kg）4個劑量組，給藥14 d。除正常組外，其余各組小鼠每天下午給予甲狀腺素溶液160 mg/kg，建立小鼠腎陰虛模型，觀察霍山石斛對腎陰虛小鼠體質(zhì)量、胸腺和脾臟指數(shù)，血清IL-2、IL-6含量及肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）水平的影響。結(jié)果：霍山石斛各給藥組均能明顯緩解小鼠的陰虛狀態(tài)，增加體質(zhì)量（ P <0.01， P <0.05），1、2、3 g/kg劑量組霍山石斛能提高陰虛小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（ P <0.01），降低血清IL-6（ P <0.05， P <0.01），升高IL-2（ P <0.01），升高陰虛小鼠肝組織SOD、GSH-Px、CAT水平（ P <0.01），降低肝組織MDA水平（ P <0.05， P <0.01），且與鐵皮石斛比較，其升高SOD、CAT和降低MDA作用明顯增強（ P <0.01， P <0.05）。結(jié)論：霍山石斛具有增強陰虛狀態(tài)下機體免疫調(diào)節(jié)作用和增強抗氧化能力的作用，其免疫調(diào)節(jié)作用與鐵皮石斛相當(dāng)，抗氧化性優(yōu)于鐵皮石斛。

關(guān)鍵詞? 霍山石斛;腎陰虛;抗氧化;免疫調(diào)節(jié)

Study on the Effects of Dendrobium huoshanense on serum IL-2，IL-6 and Antioxidation in Mice with Kidney-yin Deficiency

Hou Yan，Zhou Xue，Le Na，F(xiàn)ei Wenting，Tang Ruying，Wang Linyuan，Zhang Jianjun

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 10029，China）

Abstract Objective： To explore the effects of dendrobium huoshanense on serum IL-2，IL-6 and antioxidation in mice with kidney-yin deficiency.? Methods： A total of 96 healthy Kunming male mice were divided into normol group，model group，Dendrobium candidum group （3 g/kg），Dendrobium huoshanense （0.33 g/kg，1 g/kg，2 g/kg，and 3 g/kg） four groups with the correspondent drugs for 14 days. In addition to normal group，the mice in each group were given thyroxine solution 160 mg/kg every afternoon to establish the kidney-yin deficiency model. The changes of hair，food intake，autonomous activity in mice were observed，and the body weight，thymus index and spleen index were measured，and the level of IL-6 and IL-2 in serum，the content of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in liver tissues were detected separately.? Results： Dendrobium huoshanense can obviously alleviate the yin deficiency symptoms of mice，such as yellowing dull hair，dry stool，yellow urine，restlessness，irritability and increase the body weight （ P <0.01， P <0.05）. Dendrobium huoshanense could obviously relieve the deficiency of the mice，and increase the body weight （ P <0.01， P <0.05）. The 1 g/kg，2 g/kg and 3 g/kg Dendrobium huoshanense groups could improve the thymus index and spleen index （ P <0.01），and reduce the serum IL-6 （ P <0.05， P <0.01），increase the level of SOD，GSH-Px and CAT in liver tissue of yin deficiency mice （ P <0.01），and reduce the level of MDA in liver tissue （ P <0.05， P <0.01）; and the effects of increasing SOD，CAT and the MDA decreasing rate of these 3 groups are faster than that of Dendrobium candidum groups.? Conclusion： Dendrobium huoshanense can enhance the immune regulation and the ability of anti-oxidation of the body with kidney-yin deficiency，and the former effect is similar to that of Dendrobium candidum and the later effect is better than that of Dendrobium candidum.

Key Words? Dendrobium huoshanense; Kidney-yin deficiency; Antioxidant; Immune Regulation

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.018

霍山石斛（ Dendrobium huoshanense） 又名米斛，是蘭科石斛屬多年生草本植物，主產(chǎn)于安徽省霍山縣等地，其藥用價值和保健功能在歷代本草經(jīng)典中均有記載和例證，據(jù)《增補本草備要》記載：“斛出霍山，養(yǎng)胃清熱，生津止渴，清虛熱，功勝全面”[1]。道家經(jīng)典《道藏》曾把霍山石斛稱為“九大仙草之首”[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛含有多糖[3]、生物堿[4]、氨基酸[5]、微量元素[6]、菲類及黃酮類[7]等多種化學(xué)成分，具有極大的藥用價值，是我國珍稀藥用植物。

由于霍山石斛生長環(huán)境狹窄，繁殖困難，加上過度采挖和生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生霍山石斛資源極度匱乏，導(dǎo)致對霍山石斛的功效研究和臨床應(yīng)用尚未深入。近年來國家和地區(qū)加大對霍山石斛野生資源的保護和人工培育技術(shù)的研究，取得極大進展，已成功掌握霍山石斛的培育方法，并在當(dāng)?shù)匦纬煞N植基地，使霍山石斛的產(chǎn)量逐年增加，相關(guān)藥理學(xué)研究和產(chǎn)品開發(fā)已取得一定進展。目前國內(nèi)已有以霍山石斛為主要原料的保健產(chǎn)品，如“清養(yǎng)浸膏”“清養(yǎng)顆?！焙汀翱圃?霍山石斛膠囊”等，以增強免疫力為主要保健功能，多用于免疫低下人群[8-9]。

前期實驗[10]結(jié)果表明，霍山石斛具有甘寒、滋陰清熱的藥性特點，能提高腎陰虛小鼠的抗疲勞作用，但根據(jù)霍山石斛的中藥藥性特點研究其抗氧化及免疫力調(diào)節(jié)作用及機制的文獻尚無報道。本實驗以甲狀腺素誘導(dǎo)的腎陰虛小鼠為研究對象，以《中華人民共和國藥典》收錄的鐵皮石斛和臨床常用的治療腎陰虛證的六味地黃丸味為對照，通過檢測小鼠的體質(zhì)量、臟器指數(shù)，血清白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）含量，以及肝臟超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidas，GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平，探討霍山石斛對腎陰虛小鼠免疫及抗氧化能力的影響，為進一步深入挖掘霍山石斛的功效，促進臨床合理應(yīng)用及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性昆明小種鼠96只，體質(zhì)量（20±2）g，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，合格證：SCK（京）2016-002。實驗過程中給予小鼠普通飼料，自由飲水，室溫（22±2）℃，相對濕度為60% ～70%。

1.1.2 藥物 霍山石斛和鐵皮石斛均購自霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司，批號分別為H1704001和T1703001。六味地黃丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，生產(chǎn)批號：16032527。將以上藥品分別打粉，過80目篩，用基質(zhì)油配成相應(yīng)濃度備用。甲狀腺片購自上海長城藥業(yè)有限公司，批號：20161101，用生理鹽水配制成8 mg/mL的溶液備用。

1.1.3 試劑與儀器 SOD試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號20180119），GSH-Px試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號20180119），CAT試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號20180119），MDA試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號20180119），IL-2、IL-6試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號20180119）。HY-YQ-08酶標(biāo)分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）;日本日立7160全自動生化儀;TGL-16A臺式高速冷凍離心機;電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 96只雄性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為8組，即正常組，模型組，六味地黃丸組（2 g/kg），鐵皮石斛組（3 g/kg），霍山石斛0.33、1、2和3 g/kg 4組。實驗第8天開始每天下午除正常組小鼠給予生理鹽水外，其余各組小鼠給予甲狀腺片溶液（160 mg/kg），1次/d，共14 d，制備腎陰虛模型。

1.2.2 給藥方法 實驗第8天開始每天上午除正常組和模型組小鼠給予基質(zhì)油外，其余各組小鼠給予相應(yīng)濃度的藥物，灌胃量為每10 g體質(zhì)量0.2 mL。

1.2.3 檢測指標(biāo) 實驗第22天脫頸椎處死動物，摘眼球取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，酶免法檢測炎性細胞因子IL-6、IL-2水平;取其胸腺、脾臟，用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，稱重，臟器指數(shù)=臟器重（mg）/體質(zhì)量（g）;取其肝臟0.5 g，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，研磨，離心，取其上清液，按照試劑盒說明書檢測SOD、CAT、GSH-Px、MDA的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（? ±s ）表示，組間比較用單因素方差（Oneway ANOVA）分析，方差齊時采用最小顯著性法（LSD），方差不齊時用非參數(shù)檢驗，組間比較用Mann Whitney法。以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 霍山石斛對腎陰虛小鼠一般狀態(tài)的影響 與正常組比較，隨著造模時間的延長，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)易激惹、自主活動增加、飲食量減少、毛色發(fā)黃、大便干、小便黃等癥狀，符合臨床腎陰虛的表現(xiàn);與模型組比較，鐵皮石斛組、六味地黃丸組和霍山石斛1、2、3 g/kg組小鼠的陰虛癥狀明顯改善，霍山石斛0.33 g/kg組小鼠的上述狀態(tài)改善不明顯。

2.2 霍山石斛對腎陰虛小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響 給藥第14天，與正常組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）;與模型組比較，鐵皮石斛和六味地黃丸組小鼠的體質(zhì)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05， P <0.01），霍山石斛各劑量組小鼠體質(zhì)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01， P <0.05），其中霍山石斛0.33 g/kg和1 g/kg組小鼠的體質(zhì)量接近正常組小鼠體質(zhì)量。見表1。

與正常組比較，模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）。與模型組比較，霍山石斛1、2、3 g/kg組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）;霍山石斛0.33 g/kg組小鼠的胸腺指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05），脾臟指數(shù)有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。與鐵皮石斛比較，霍山石斛3 g/kg組小鼠的脾臟指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。見表1。

2.3 霍山石斛對腎陰虛小鼠血清IL-6、IL-2水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠IL-6明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）;與模型組比較，鐵皮石斛和六味地黃丸組小鼠IL-6明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01），霍山石斛各劑量組小鼠IL-6明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05， P <0.01）。見表2。

與正常組比較，模型組小鼠IL-2明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）;與模型組比較，鐵皮石斛和六味地黃丸組小鼠IL-2明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05， P <0.01），霍山石斛1、2、3 g/kg組小鼠IL-2明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01），霍山石斛0.33 g/kg組小鼠IL-2有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。見表2。

2.4 霍山石斛對腎陰虛小鼠肝臟SOD、MDA、GSH-Px、CAT的影響

與正常組比較，模型組小鼠的SOD、GSH-Px、CAT明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）;與模型組比較，鐵皮石斛和六味地黃丸組小鼠的SOD、GSH-Px、CAT明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）;霍山石斛1、2、3 g/kg組小鼠的SOD、GSH-Px、CAT明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01），霍山石斛0.33 g/kg組小鼠的SOD和GSH-Px明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）;與鐵皮石斛比較，霍山石斛1、2、3 g/kg組小鼠SOD、CAT顯著升高（ P <0.01， P <0.05），霍山石斛0.33 g/kg組小鼠GSH-Px明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05）。見表3。

與正常組比較，模型組小鼠MDA明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）;與模型組比較，鐵皮石斛和六味地黃丸組小鼠MDA明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01），霍山石斛各劑量組小鼠MDA明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.05， P <0.01）;與鐵皮石斛組比較，霍山石斛1、2、3 g/kg組小鼠MDA明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.01）。見表3。

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，衛(wèi)氣是人體內(nèi)具有抗御外邪、護衛(wèi)肌體功能的一類精微物質(zhì)，其盛衰是機體發(fā)生疾病的內(nèi)在原因，《靈樞·上膈》曰：“衛(wèi)氣不營，邪氣居之”?！鹅`樞·營衛(wèi)生會》曰：“營出于中焦，衛(wèi)出于下焦”，腎藏精主骨生髓，為先天之本，腎臟的生理功能將決定衛(wèi)氣的盛衰，進而影響機體的防御功能?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，免疫系統(tǒng)是防御疾病維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要系統(tǒng)，包括特異性免疫和非特異性免疫。非特異性免疫功能由遺傳獲得，具有“先天性”;特異性免疫功能指機體經(jīng)后天感染或人工預(yù)防接種而獲得抵抗感染能力，包括細胞免疫和體液免疫，具有“后天性”。免疫細胞是由骨髓干細胞分化而來，腎主骨生髓，為先天之本，因此機體的免疫功能與腎密切相關(guān)。

甲狀腺素是制備腎陰虛模型常用的方法之一，大量外源性甲狀腺素能增加機體的能量代謝，使產(chǎn)熱增加，引起機體IL-6等炎性細胞因子的基因表達增強、生物學(xué)活性升高，IL-2等淋巴因子水平降低，影響機體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)功能，導(dǎo)致免疫器官萎縮，免疫因子水平紊亂，免疫功能低下，出現(xiàn)筋骨酸軟、神疲乏力、煩熱不安、神思遲鈍、動作失靈等癥狀。李慧芬等[11]研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素致腎陰虛大鼠的胸腺和脾臟指數(shù)明顯降低。胡旭光等[12]研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素及利血平致腎陰虛小鼠的CD4+/CD8+明顯降低。李麗[13]發(fā)現(xiàn)腎陰虛型圍絕經(jīng)期患者血清IL-6、TNF-α水平顯著高于正常人。杜希岱等[14]研究發(fā)現(xiàn)六味地黃湯加玄參等提高甲狀腺瘤患者的免疫功能，對腫瘤細胞有一定的抑制作用。以上研究均表明腎陰虛證的免疫功能處于低下或紊亂狀態(tài)。本實驗結(jié)果也表明，模型組小鼠毛發(fā)黃而無光澤，煩躁，自主活動增加，大便干，小便黃，體質(zhì)量降低，胸腺、脾臟指數(shù)降低，血清IL-2降低，IL-6升高，符合腎陰虛免疫功能低下的表現(xiàn)。實驗結(jié)果同時表明，霍山石斛能改善腎陰虛小鼠毛色變黃、煩躁等陰虛狀態(tài)，增加腎陰虛小鼠的體質(zhì)量，緩解甲狀腺素引起的免疫器官萎縮，增加胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，降低血清IL-6含量，升高IL-2含量，調(diào)節(jié)機體免疫因子紊亂狀態(tài)，作用與鐵皮石斛相當(dāng)。

自由基是機體生理過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，是維持機體正常生理功能的必要物質(zhì)，通常情況下含量較低，不會造成組織損傷，當(dāng)化學(xué)物質(zhì)、劇烈運動、缺氧等因素作用于機體時，引起機體SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶含量降低，MDA等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，加劇脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，破壞細胞結(jié)構(gòu)，影響正常的生理功能，引起疾病的發(fā)生和衰老的產(chǎn)生[15-16]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)腎陰虛與體內(nèi)自由基代謝異常有關(guān)，李承軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)老年腎陰虛患者指甲中的自由基含量明顯升高，紅細胞中SOD活性明顯降低，清除自由基的能力明顯下降。薛春苗等[18]研究發(fā)現(xiàn)溫?zé)崴幹履I陰虛小鼠SOD和GSH-PX活力降低，MDA含量升高，抗氧化能力降低，黃精粗多糖能增強腎陰虛小鼠的抗氧化能力，延緩衰老的進程。李慧芬等[11]研究發(fā)現(xiàn)女貞子生品及酒蒸品具有增強腎陰虛大鼠抗氧化能力，減少睪丸組織的氧化應(yīng)激損傷。本實驗結(jié)果表明，模型組小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT明顯降低，MDA明顯升高，符合腎陰虛氧化損傷表現(xiàn)?；羯绞芴岣吣I陰虛小鼠肝臟抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT水平，降低氧化產(chǎn)物MDA水平，且霍山石斛（1、2、3 g/kg）劑量組檢測結(jié)果與六味地黃丸相當(dāng)，但均優(yōu)于鐵皮石斛，提示霍山石斛的抗氧化性優(yōu)于鐵皮石斛。

霍山石斛是常用的補陰藥石斛的一種，具有抗疲勞[19]、降血糖、防治白內(nèi)障[20]等作用。

前期實驗[10]表明霍山石斛能降低腎陰虛小鼠血清cAMP/cGMP、T3、T4水平，能改善陰虛內(nèi)熱和內(nèi)分泌激素紊亂狀態(tài)，具有滋陰清熱作用。本實驗研究了霍山石斛對腎陰虛小鼠血清細胞因子和抗氧化作用的影響，驗證了其對陰虛狀態(tài)的改善作用，證實了霍山石斛對陰虛狀態(tài)下細胞因子紊亂的調(diào)節(jié)作用和增強機體抗氧化力作用，是霍山石斛滋陰清熱作用的表現(xiàn)之一，為進一步明確霍山石斛的功效，進而被《中華人民共和國藥典》收錄提供參考，也為霍山石斛的臨床合理應(yīng)用及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供實驗依據(jù)。霍山石斛增強免疫抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚需進一步研究。

致謝：感謝北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心李偉老師、中國人民解放軍第302醫(yī)院全軍中藥研究所肖小河老師和王伽伯老師對本實驗的指導(dǎo)與幫助！

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