芍藥甘草滴丸的制備及其芍藥苷、甘草苷和甘草酸的HPLC含量測(cè)定

王敏 龔慕辛 劉正躍 史赫男 黃秋陽 張芮乾 郭思遠(yuǎn) 賀蕊

摘要? 目的：制備芍藥甘草滴丸（SGDP），測(cè)定其主要成分芍藥苷、甘草苷、甘草酸的含量，以及其他與質(zhì)量控制相關(guān)的指標(biāo)，為有效控制其質(zhì)量提供重要指標(biāo)和參數(shù)。方法：采用水煎煮提取，乙醇沉淀、HP-20大孔樹脂純化后，選擇合適的基質(zhì)和冷卻劑，制備SGDP;采用HPLC-DAD法測(cè)定SGDP中芍藥苷（230 nm）、甘草苷（276 nm）、甘草酸（250 nm）的含量。并按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版的方法對(duì)其外觀、重量差異、溶散時(shí)限進(jìn)行檢查。結(jié)果：成功制備了SGDP，HPLC法可同時(shí)測(cè)定SGDP中芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的含量，分別是（32.66±0.46）mg/g、（9.23±0.23）mg/g、（17.48±0.86）mg/g;平均回收率分別是111.23%、96.04%、104.43%。外觀、重量差異、溶散時(shí)限均符合藥典要求。結(jié)論：SGDP的制備工藝合理可行。HPLC法靈敏、準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于同時(shí)檢測(cè)SGDP中芍藥苷、甘草苷、甘草酸的含量，為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 芍藥甘草滴丸;芍藥苷;甘草酸;甘草苷

Preparation of Shaoyao Gancao Dripping Pills and Determination of Its Main Contents of Paeoniflorin，Liquiritin and Glycyrrhizic Acid by HPLC Method

Wang Min，Gong Muxin，Liu Zhengyue，Shi Henan，Huang Qiuyang，Zhang Ruiqian，Guo Siyuan，He Rui

（School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract Objective： To prepare Shaoyao Gancao Dripping Pills （SGDP） and determine its main contents of paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid by HPLC Method，and to provide important reference and parameters for the effective quality control of SGDP. Methods： SGDP was prepared by water decoction，ethanol precipitation and purification of HP-20 macroporous resin.The main contents paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid of SGDP were determined by HPLC-DAD methods at 230 nm，276 nm and 250 nm，respectively.The appearance，weight difference and solution time were determined according to Chinese Pharmacopoeia （2015）. Results： SGDP was successfully prepared and the main contents of paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid ammonium salt of SGDP were （32.66±0.46） mg/g，（9.23±0.23） mg/g，and （17.48±0.86） mg/g，respectively，and could be detected simultaneously by HPLC method with mean recovery rate of 111.23%，96.04% and 104.43%，respectively.The indexes of appearance，weight difference and solution time were consistent with the standards of the pharmacopoeia. Conclusion： The preparation techniques of SGDP was rational and practicable.HPLC method was sensitive，accurate，and reproducible.It could be used to determine paeoniflorin，liquiritin and glycyrrhizic acid of SGDP simultaneously and provide important reference for the quality control of SGDP.

Key Words? Shaoyao Gancao Dripping Pills; Paeoniflorin; Glycyrrhizic acid; Liquiritin

中圖分類號(hào)：R932;R944.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.013

芍藥甘草滴丸（Shaoyao Gancao Dripping Pills，SGDP）是由《傷寒論》中的芍藥甘草湯劑型改造而成。芍藥甘草湯藥雖僅有兩味中藥組成，但其結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)，配伍精當(dāng)，為后世醫(yī)家所推崇，具有確切的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[1-2]，也可治療脾胃病[3]。臨床研究[4-5]和越來越多的基礎(chǔ)研究[6-8]表明其具有確切的防治哮喘的作用，主要與其抗炎、解痙、平喘的作用有關(guān)[4，9]。芍藥甘草湯對(duì)哮喘患者[4-5]、大鼠[6-8]、小鼠[10]和豚鼠[11]的哮喘均具有一定的防治作用。哮喘是目前最普遍的和發(fā)病率上升最快的疾病之一，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，伴有哮鳴音等[12]，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來巨大的思想和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，己成為嚴(yán)重威脅公眾健康的一種主要慢性疾病。哮喘發(fā)病急，急需能夠快速發(fā)揮藥效的藥物進(jìn)行急救。滴丸可以發(fā)揮速效作用，且制備工藝簡(jiǎn)單，容易攜帶。因此本研究將芍藥甘草湯結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)制備成SGDP，以快速發(fā)揮其解痙、止痛、抗炎、鎮(zhèn)咳等多種作用，達(dá)到快速緩解甚至治療哮喘的目的，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，包括外觀、重量差異、溶散時(shí)限和主要成分芍藥苷、甘草酸、甘草苷的含量測(cè)定。

1 材料

炙甘草（北京盛世龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1706020），白芍（北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20160818），PEG4000（中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站營(yíng)銷，批號(hào)：900906），PEG6000（天津化學(xué)試劑六廠分廠，批號(hào)：20000708），蒸餾水，甲基硅油（市購），HP-20樹脂（Solarbio公司，批號(hào)：707B021），芍藥苷購置于中國(guó)藥品檢定研究院（批號(hào)：110736-201438），甘草苷購置于中國(guó)藥品生物制品檢定研（批號(hào)：110736-201438），甘草酸銨鹽購置于SIGMA公司（Lot# BCBL1535V），分析純乙醇，蒸餾水，ThermoFisher色譜乙腈和色譜三氟乙酸（TFA）購置于國(guó)藥科興化工產(chǎn)品（北京）有限公司，娃哈哈純凈水。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi R-210，Switzerland），滴丸機(jī)（TDSJ-A型，北京正大綠洲制藥有限公司），萬分之一和十萬分之一電子分析天平（satorius公司），智能崩解儀（ZB-1E型，天大天發(fā)公司），Agilent HPLC儀（Aglient Techonologies 1200 series）。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥甘草總提物的制備及純化-水提醇沉法 按《傷寒論》處方比例取白芍和炙甘草各240 g（1∶ 1），參考文獻(xiàn)報(bào)道[13]，加10倍量的水浸泡0.5 h，煎煮1.5 h，過濾;藥渣加入8倍量水煎煮1 h，過濾，合并2次濾液。加熱濃縮至250 mL，即2 g（原藥材）/mL左右，待放涼后加入（慢加快攪）乙醇使乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%，攪拌，4 ℃冰箱靜置24 h，過濾，得濾液，使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇并濃縮濾液至30 mL。

2.2 HP-20大孔樹脂繼續(xù)純化 樹脂的預(yù)處理方法：用乙醇浸泡過夜，濕法裝柱，柱體積約為500 mL，依次使用3倍量無水乙醇、95%乙醇、50%乙醇和10倍量左右蒸餾水洗脫。洗脫：將水提醇沉后的濃縮液，上樣HP-20樹脂柱，依次用10倍量水、3倍量50%和3倍量100%乙醇洗脫。收集50%和100%乙醇洗脫液，減壓濃縮至重量為20.02 g，取10.01 g濃縮液用于制備滴丸。

2.3 SGDP的制備 參考文獻(xiàn)[14]和實(shí)驗(yàn)摸索，選擇PEG4000：PEG6000（1∶ 5）作為基質(zhì)，甲基硅油作為冷卻劑，制備滴丸。稱取PEG4000和PEG6000分別為3.33 g、16.67 g，將基質(zhì)于水浴上加熱（85～90°C）熔融，加入上述純化后的濃縮液10.01 g，攪拌混勻，保溫下傾入滴丸器中，滴距4 cm，滴管口內(nèi)徑/外徑為2 mm/2.8 mm，以適宜的滴速滴入互不相溶的冷卻劑甲基硅油中，冷卻劑溫度15 ℃，冷卻柱長(zhǎng)度110 cm，冷卻固化成丸，取出，除去冷卻劑，即得SGDP。同法制備空白滴丸。

2.4 質(zhì)量檢測(cè) 1）外觀性狀：SGDP外觀為棕褐色，表而光滑，色澤均勻，質(zhì)地堅(jiān)硬，味微苦，甘。2）重量差異：按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版第四部通則0108丸劑質(zhì)量檢查法進(jìn)行檢查。3）溶散時(shí)限：按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版第四部通則0921崩解時(shí)限檢查法進(jìn)行檢查。

2.5 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）;流動(dòng)相：0.05%三氟乙酸水溶液（A）-0.05%三氟乙酸乙腈（B）;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)芍藥苷230 nm，甘草苷276 nm，甘草酸250 nm;柱溫室溫;進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相梯度見表1。

2.6 芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽混合對(duì)照品溶液的配置 用十萬分之一天平精密稱取芍藥苷0.00240 g、甘草苷0.00209 g、甘草酸銨鹽0.00210 g，分別溶于500 μL的甲醇、甲醇、50%甲醇，配置成10 mmol/L的芍藥苷、甘草苷儲(chǔ)備液，5 mmol/L的甘草酸銨鹽儲(chǔ)備液備用。分別取3種貯備液適量用70%的甲醇稀釋， 制成含芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的系列混合對(duì)照品溶液。各對(duì)照品溶液濃度見表2。

2.7 供試品溶液的制備 取本品20粒，研碎，精密稱取0.0500 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇8 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液置10 mL容量瓶中。用少量甲醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液加入同一容量瓶中?0%甲醇定容至刻度，搖勻。取1 mL用0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液?？瞻椎瓮璋凑胀ㄌ崛?，制備。

2.8 專屬性實(shí)驗(yàn) 以SGDP的供試品溶液和空白滴丸的提取液進(jìn)樣，考察空白基質(zhì)對(duì)芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨的測(cè)定是否有干擾。結(jié)果表明，按選取的色譜條件，供試品溶液中的雜質(zhì)對(duì)芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的測(cè)定均無干擾，如圖1。

2.9 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，以芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)濃度為橫坐標(biāo)（X），采用多元回歸運(yùn)算，得芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的回歸方程分別為y=6.856 8x-21.958（R2=0.999 5），y=7.082 9x-44.853（R2=0.997 8），y=2.937 2x+44.074（R2=0.992 7）。結(jié)果顯示，芍藥苷在100～600 μmol/L、甘草苷在60～160 μmol/L、甘草酸銨鹽在20～120 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

2.10 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定樣品中芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的峰面積，計(jì)算其 RSD 值分別為0.07%、0.04%、0.38%，說明精密度良好。

2.11 重復(fù)性考察 取同一批次的6份SGDP，分別按照供試品溶液的制備方法制備，測(cè)定芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的峰面積。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的峰面積的 RSD 值（ n =6）分別為0.14%、0.29%、0.60%，說明重復(fù)性良好。

2.12 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，每隔1 h進(jìn)樣1次，考察8 h，測(cè)定芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨鹽的峰面積。計(jì)算其 RSD 值分別為0.31%、0.11%和0.88%，保留時(shí)間極差分別為0.004 min、0.030 min和0.002 min，說明供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.13 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批SGDP樣品約0.0250 g，平行6份，分別精密加入相當(dāng)于0.0500 g樣品中成分50%量的對(duì)照品（含約170.74 μmol/L即0.00082 g芍藥苷，55.43 μmol/L即0.00023 g甘草苷，52.26 μmol/L即0.00044 g甘草酸銨鹽），按供試品溶液制備法制備。照上述色譜條件測(cè)定，并分別記錄其峰面積并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度，以測(cè)定量（測(cè)得總量-樣品中的量）與加入量的比值計(jì)算回收率，結(jié)果見表3～表5，說明加樣回收率符合分析要求。

2.14 結(jié)果

2.14.1 質(zhì)量差異 取供試品20丸，精密稱定總質(zhì)量，求得平均丸重后，再分別精密稱定每丸的質(zhì)量。20粒SGDP與平均每粒滴丸質(zhì)量（0.0254 g）比較，其質(zhì)量差異均小于藥典規(guī)定限度15%，符合中華人民共和國(guó)藥典規(guī)定。見表6。

2.14.2 溶散時(shí)限 6粒SGD P 均在5 min內(nèi)溶散完全，溶散時(shí)限小于30 min，符合藥典規(guī)定。

2.14.3 SGDP中芍藥苷、甘草酸、甘草苷的含量?? 取不同批次的6份SGDP，分別按照供試品溶液制備方法制備，按照上述色譜條件測(cè)定。見表7。滴丸中，芍藥苷的含量為（32.66±0.46）mg/g， RSD 為1.4%;甘草苷的含量為（9.23±0.23）mg/g， RSD 為2.5%;甘草酸銨鹽的含量為（17.48±0.86）mg/g， RSD 為4.9%。各批次 RSD 均小于5%，說明工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本研究中，SGDP的制備處方源自經(jīng)典《傷寒論》的芍藥甘草湯處方（白芍：炙甘草=1∶ 1）。由于滴丸的載藥量相對(duì)比較小，因此，需對(duì)芍藥甘草水煎提取物的濃縮液進(jìn)行純化。本研究首先選用水提醇沉對(duì)粗提物進(jìn)行純化，除去大部分蛋白質(zhì)等水溶性強(qiáng)的雜質(zhì)。然后選用HP-20大孔樹脂進(jìn)行進(jìn)一步的純化，收集50%和100%乙醇的洗脫液，減壓除去溶劑，濃縮到稠膏狀，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，與基質(zhì)PEG4000-PEG6000（1∶ 5）1∶ 2的比例進(jìn)行混熔，使用滴制法制備SGDP。在制備滴丸時(shí)，發(fā)現(xiàn)PEG4000：PEG6000=1∶ 5的基質(zhì)與濃縮液1∶ 1混合后并不能形成圓整的滴丸，故適時(shí)調(diào)整為基質(zhì)與藥液的比例為2∶ 1，成型性好。

本研究按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版收錄的滴丸的質(zhì)量檢查方法，對(duì)SGDP的重量差異和溶散時(shí)限進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示均合格。本研究還采用HPLC法首次同時(shí)測(cè)定了SGDP中的3種解痙、抗炎、抗哮喘[15-16]成分，即主要成分芍藥苷、甘草苷、甘草酸的含量，方法簡(jiǎn)便、靈敏度高，重現(xiàn)性好、精密度高、加樣回收率好，結(jié)果精確、可靠，為SGDP的質(zhì)量控制提供了重要參考。

參考文獻(xiàn)

[1] Bi X，Gong M，Di L.Review on prescription compatibility of Shaoyao Gancao decoction and reflection on pharmacokinetic compatibility mechanism of Traditional Chinese Medicine prescription based on in vivo drug interaction of main efficacious components[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014：ID 208129.

[2]曾永青，李立新，王洋洋.芍藥甘草湯加減聯(lián)合氟桂利嗪治療神經(jīng)性頭痛的臨床療效觀察[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（1）：60-62.

[3]崔晨，耿琦，蔣健.蔣健以芍藥甘草湯為主古方新用治療脾胃病[J].世界中醫(yī)藥，2017，12（11）：2727-2730.

[4]張思杰，史鎖芳.史鎖芳教授運(yùn)用芍藥甘草湯治療哮喘急性發(fā)作的經(jīng)驗(yàn)[J].吉林中醫(yī)藥，2011，31（3）：206-207.

[5]李富生，石昕昕，劉新智，等.芍藥甘草散治療哮喘證35例小結(jié)[J].國(guó)醫(yī)論壇，1987，8（4）：37.

[6]董雷，蔡宛如.芍藥甘草湯對(duì)哮喘大鼠氣道重塑的影響及相關(guān)機(jī)制研究[J].中藥材，2016，39（4），887-890.

[7]何飛，汝觸會(huì)，沈曉強(qiáng)，等.芍藥甘草湯對(duì)哮喘大鼠輔助性T細(xì)胞17及其細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，41（2），112-116，135.

[8]李澤華，呂卓，肖超妮，等.芍藥甘草湯干預(yù)過敏性哮喘大鼠的尿液代謝組學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（10）：4416-4420.

[9]Jeong SJ，Lim HS，Seo CS，et al.Traditional herbal formula Jakyakgamcho-tang（Paeonia lactiflora and Glycyrrhiza uralensis）impairs inflammatory chemokine production by inhibiting activation of STAT1 and NF-κB in HaCaT cells[J].Phytomedicine，2015，22（2）：326-332.

[10] 王洋，關(guān)煒，李韶妮.芍藥甘草湯防治支氣管哮喘機(jī)理研究[J].山西中醫(yī)，2011，27（9）：43-45.

[11]蔡宛如，錢華，朱淵紅，等.芍藥甘草湯平喘和抗過敏作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2000，7（6），341-342.

[12]于文凱，文姝.腸道菌群與過敏性哮喘[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（10）：1217-1221.

[13]閻艷麗，李春花，宋曉宇，等.芍藥甘草滴丸的制備與療效觀察[J].中成藥，2005，27（6）：762-763.

[14]李春花，閻艷麗，宋曉宇，等.芍藥甘草滴丸制備研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2004，21（S2）：54-55.

[15]朱廣偉，張貴君，孫奕，等.醋白芍、炙甘草及其配伍載體中藥效組分變化規(guī)律分析[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（1）：143-146，150.

[16]高海洋.基于β2-AR色譜的芍藥甘草湯抗急性哮喘物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].西安：西北大學(xué)，2017.