中藥龜甲HPLC指紋圖譜研究

呂曉娜 李夢 李紅霞 陳銘陽 徐清 張帆 楊瑤珺 劉春生

摘要? 目的：建立中藥龜甲的HPLC指紋圖譜，以達到鑒別龜甲與其混偽品的目的。方法：收集不同產(chǎn)地的龜甲及其混偽品21批，按上下甲進行分類，共42個樣品。通過鹽酸水解、脫磷、脫鈣等前處理，以6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯（AQC）進行衍生化反應(yīng)，采用C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，3 μm），柱溫37 ℃，以乙腈，水，緩沖鹽為流動相進行梯度洗脫，流速1.00 mL/min，檢測波長248 nm。采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（《中華人民共和國藥典》2012版）對正品龜甲上甲與下甲、正品與常見混偽品進行相似度分析。結(jié)果：所建立的指紋圖譜具有較好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。正品龜甲的上下甲相似度為0.932～0.995。正品與混偽品的相似度在0.90以下者占90.91%。結(jié)論：正品上、下甲的HPLC圖譜差異較小，正品與混偽品差異較明顯。所建立的HPLC指紋圖譜可用于龜甲的質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞? 龜甲;混偽品;HPLC指紋圖譜;相似度;評價

HPLC Fingerprint of Carapax et Plastrum Testudinis

Lyu Xiaona，Li Meng，Li Hongxia，Chen Mingyang，Xu Qing，Zhang Fan，Liu Chunsheng，Yang Yaojun

（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Abstract Objective： To establish HPLC （High Performance Liquid Chromatography） fingerprint of Carapax et Plastrum Testudinis by identifying tortoiseshells and their adulterants.? Methods： A total of 21 batches of tortoiseshells and their adulterants from different habitats was collected，and 42 samples were classified by the carapace and plastron. The pre-treatment of acid hydrolysis，dephosphorization and decalcification pretreatment with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate （AQC） derivatization reaction was carried out using the C18 column （3.9×150 mm，3 μm），the column temperature of 37 ℃. Acetonitrile，water，salt buffer were used as mobile phase for gradient elution at a flow rate of 1.00 mL/min and a the detection wavelength of 248 nm. The system of similarity evaluation （Pharmacopoeia 2012） was used to analyze tortoiseshells by the carapace and plastron，tortoisshells and their common adulterants.? Results： The fingerprint had good precision，reproducibility and stability. The similarity of tortoiseshells was between 0.932-0.995. The percentage was less than 90.91% under the similarity of 0.90 between tortoiseshells of their adulterants.? Conclusion： The difference of HPLC is relatively small between tortoiseshells′ carapaces and plastrons，and the difference between tortoise shells and their adulterants is obvious. The established HPLC fingerprint can be used for the quality evaluation of tortoiseshells.

Key Words? Carapax et Plastrum Testudinis; Adulterants; High Performance Liquid Chromatography fingerprint; Similarity evaluation

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.012

龜甲始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定龜甲為龜科動物烏龜 Chinemys reevesii （Gray）的背甲及腹甲。其具有滋陰潛陽、益腎強骨、養(yǎng)血補心等功效[2]，常以龜甲飲片、醋龜甲、龜甲膠等形式入藥，需求量大;且正品資源較少，價格較貴，市場上偽品與混淆品泛濫[3]。然而，龜甲的代表性成分尚不清楚，在質(zhì)量控制上缺乏具有說服力的指標[3]。目前龜甲的生藥學(xué)鑒別主要集中在性狀和薄層鑒別上，也有部分學(xué)者嘗試用比值圖示法和相似系數(shù)法對其性狀進行研究，并取得一定的成效。但上述研究都僅限于2個或幾個龜類藥材之間的比較，缺乏對龜類藥材的系統(tǒng)性比較研究[4]。同時，龜甲的上甲與下甲是否能夠統(tǒng)一使用，仍存在一些爭議。對正品上下甲、正品與混偽品的深入研究，不僅有助于制定龜甲質(zhì)量評價標準，而且對龜甲藥材的市場管理有一定的指導(dǎo)意義。

HPLC適用于成分復(fù)雜而不易分離的分析對象，具有分離效能高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，是目前指紋圖譜技術(shù)中用途最廣泛的一種方法。通過HPLC對龜甲中羥脯氨酸[5]、膠原蛋白的含量[6]，龜甲炮制品龜甲膠中14種氨基酸含量[7]等均有研究。而本實驗所采用的AQC柱前衍生化HPLC也較成熟，如應(yīng)用于人血漿[8]、阿膠[9]、稻米[10]等。

中藥指紋圖譜建立的目的是全面反映中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，進而反映其內(nèi)在質(zhì)量[11-12]，已應(yīng)用于柑橘屬中藥[13]、鉤藤[14]、黃芩[15]等中藥的鑒別。本實驗采用HPLC對不同產(chǎn)地的龜甲藥材及其混偽品進行了指紋圖譜研究，建立了正品龜甲的HPLC指紋圖譜，為龜甲藥材的質(zhì)量控制提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 收集正品龜甲及其混偽品，按上下甲分為42個樣品，采集地為廣州、茂名、南京、無錫等地，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定其品種。

1.1.2 藥物 L-羥脯氨酸（Hyp）對照品（批號Z26M7H11979，上海源葉生物科技有限公司）;17種氨基酸標準品混合液[天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe），除Cys為1.25 mmol/L外，其余均為2.5 mmol/L;批號2QL228986，Waters公司提供]。

1.1.3 試劑與儀器 Waters AccQ.Flour衍生化試劑盒[包含Waters AccQ.Flour緩沖液、AQC試劑粉、AQC稀釋液，批號：8217860041];AccQ.Tag流動相濃縮液（乙酸鹽-磷酸鹽萃取劑）（批號8114160431）;乙腈（色譜純）;鹽酸;純凈水;waters高效液相色譜儀（包括2695紫外檢測器，Empower數(shù)據(jù)工作站）;TCQ-250超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）;分析天平;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城儀器廠）;CS101-1C電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶四達實驗儀器廠）;旋渦振蕩器;中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版（國家藥典委員會）。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備 取濃度為2.5 mmol/L（Cys1.25 mmol/L）的17種氨基酸對照品100 μL，放入一小樣品瓶中，加0.9 mL高純水稀釋，混勻，即得17種混合氨基酸對照品溶液。取Hyp適量，精密稱定，加入0.1 mol/L鹽酸制成0.25 mmol/L的溶液，混勻，即得羥脯氨酸對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取樣品0.1 g，加入6 mol/L鹽酸5 mL，充入高純氮氣30 s，密封，置于110 ℃烘箱中水解8 h，過濾，蒸干，加入20 mL 70%乙醇超聲15 min，過濾，蒸干，加入0.1 mol/L草酸6 mL，超聲，定容至50 mL容量瓶，用0.22 μm濾膜過濾，即得。

1.2.3 空白溶液的制備 在不加入樣品的情況下，同供試品溶液的制備方法制備。

1.2.4 衍生方法 分別精密移取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液和各10 μL，置于離心管中，加入AccQ.Flour緩沖液70 μL，漩渦混合，在渦旋狀態(tài)下加入AQC溶液20 μL，并保持漩渦混合10 s，密封，置55 ℃烘箱內(nèi)10 min，取出，放涼，轉(zhuǎn)移至微量進樣瓶，即得空白、對照品和供試品的衍生化溶液。

1.2.5 色譜條件 色譜柱為Waters AccQ.Tag法專用C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，3 μm），流動相A為AccQ.Tag流動相的1∶ 10稀釋液，B為乙腈，C為水，按表1進行梯度洗脫，流速1.00 mL/min，紫外檢測波長248 nm，柱溫37 ℃，進樣量10 μL。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實驗 取同一供試品的衍生化溶液，連續(xù)進樣6次，結(jié)果15個主要色譜峰（His、Cys、Met含量較低，未納入計算）的相對保留時間的 RSD 均<0.68%，相對峰面積的 RSD 均<2.04%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品的衍生化溶液，分別于0、3、6、12、24、72 h進行檢測，結(jié)果15個主要色譜峰的相對保留時間的 RSD 均<0.90%，相對峰面積的 RSD 均<2.87%，各色譜峰的相似度值不低于0.97，表明供試品在室溫下72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 重復(fù)性實驗 取同一正品龜甲樣品，按實驗方法平行制備6份供試品溶液并衍生化，分別進樣檢測。結(jié)果15個主要色譜峰的相對保留時間的 RSD 均<1.0%，相對峰面積的 RSD 均小于3.0%，各色譜峰的相似度值不低于0.98，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 中藥龜甲指紋圖譜的建立

2.2.1 各龜甲樣品與其混偽品的HPLC圖譜采集 ?在本實驗色譜條件下，15種氨基酸得到有效分離。按羥脯氨酸衍生物峰計算，理論板數(shù)在4 000以上。所得空白、羥脯氨酸、17種混合氨基酸和樣品的HPLC圖譜見圖1。

2.2.2 正品上甲與下甲HPLC圖譜的相似度 取10批正品下甲藥材，按上述試驗方法制備供試品衍生化溶液，進行HPLC分析，所得圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（中華人民共和國藥典2012版）進行相似度分析，其相似度為0.927～0.995，將生成的下甲對照圖譜與各上甲樣品進行相似度分析，結(jié)果見表2;10批正品上甲藥材的相似度為0.917～0.985，上甲對照圖譜與各下甲樣品的相似度結(jié)果見表3。由表2可知，下甲對照圖譜與各上甲樣品的相似度為0.932～0.995，上甲對照圖譜與各下甲樣品的相似度為0.949～0.989。表明：上甲與下甲的相似度基本均在0.950以上，差異較小。因此采用龜甲上甲與下甲的HPLC圖譜統(tǒng)一建立龜甲藥材HPLC指紋圖譜。

2.2.3 龜甲藥材指紋圖譜的建立 實驗中，正品上甲與下甲樣品均一一對應(yīng)，根據(jù)上述實驗結(jié)果，考慮將對應(yīng)的上甲與下甲樣品合并，共10個批次。利用相似度軟件，對色譜峰進行剪切、校正等處理，采用平均數(shù)法生成對照指紋圖譜。見圖2、表3。由表中數(shù)據(jù)可知，批次間的相似度在0.900以上的占95.56%，在0.950以上的占91.11%。各批次與所得龜甲的對照指紋圖譜的相似度在0.964～0.999，顯示其與對照指紋圖譜有良好的相似性。

2.3 龜甲及其混偽品的相似度分析 將所收集的22個混偽品按試驗方法制備供試品衍生化溶液，以色譜條件對其進行檢測。用2.2.3項所得的對照指紋圖譜與各混偽品的HPLC圖譜進行相似度評價。見表4。可知相似度值在0.85以下的占81.82%;相似度值在0.90以下的占90.91%。其中地龜下甲、鷹龜下甲與正品龜甲的相似度值在0.90以上，巴西龜、黃喉擬水龜、中華花龜?shù)绕贩N與正品龜甲的相似度值均在0.90以下。這表明在一定程度上，龜甲藥材的對照指紋圖譜能夠作為鑒別龜甲正偽品的參考方法之一。

3 討論

龜甲藥材中主要有效成分為蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)水解、AQC試劑衍生化的方法對檢測氨基酸的種類和含量有較好的效果。然而，圖譜中羥脯氨酸與衍生化副產(chǎn)物的出峰時間較接近，且色譜峰保留時間對圖譜相似度有較大影響，因此，在色譜柱分離效果和儀器靈敏度良好的情況下，需嚴格控制流動相A稀釋液的比例，而本實驗采用的是1∶ 10的稀釋比例。通過筆者市場走訪發(fā)現(xiàn)，龜甲混偽品眾多，而未鑒別出的地龜下甲、鷹龜下甲在性狀上與正品龜甲差異較大，且目前養(yǎng)殖量和野生量均較少，因此對正品龜甲的鑒別影響較小。故根據(jù)龜甲對照指紋圖譜及其混偽品的相似度值，可以用于鑒別正偽品龜甲，為擴大龜甲藥源提供參考。

目前，在龜甲的藥效成分尚未完全闡明的情況下，利用龜甲指紋圖譜作為質(zhì)量控制指標或龜甲中多種氨基酸的含量范圍為指標，并結(jié)合化學(xué)模式識別如主成分分析、聚類分析以及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等，整個評價研究將是一種更有效的質(zhì)量控制方法。

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