聚酰胺色譜法聯(lián)合中壓液相制備色譜法提取分離鐮形棘豆中活性黃酮類成分

牛俐燃 李冠聰 楊光明 潘揚 蔡寶昌

摘要? 目的：對藏藥鐮形棘豆中黃酮類成分進行提取分離，并將得到的黃酮化合物進行抗人肺腺癌A549細(xì)胞的活性篩選。方法：鐮形棘豆藥材浸提液經(jīng)乙酸乙酯萃取，該萃取部位通過聚酰胺柱色譜梯度洗脫，結(jié)合中壓液相制備色譜法進一步純化分離，獲得單一黃酮化合物，通過高效液相色譜法（HPLC）、質(zhì)譜法（MS）及核磁共振波譜法（NMR）對化合物進行分析、鑒定;采用CCK-8法，檢測黃酮化合物對人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果：從鐮形棘豆的乙酸乙酯部位分離得到2個黃酮類單體，鑒定為7-羥基二氫黃酮及2′，4′-二羥基二氫查爾酮，HPLC分析兩者純度均大于98%;CCK-8法結(jié)果顯示，7-羥基二氫黃酮及2′，4′-二羥基二氫查爾酮均能顯著抑制A549細(xì)胞活力，并呈量效關(guān)系，48 h的IC50值分別為137.6 μg/mL和63.83 μg/mL。結(jié)論：分離得到的2個黃酮成分對A549細(xì)胞均有良好的抑制作用，為后期抗肺癌機制研究提供了實驗基礎(chǔ)。聚酰胺柱色譜法具有富集黃酮的作用，適用于分離黃酮類成分，聚酰胺色譜法聯(lián)合中壓制備液相色譜法，提取分離鐮形棘豆中黃酮類成分，簡便易行，為分離黃酮類成分提供參考。

關(guān)鍵詞? 鐮形棘豆;黃酮化合物;聚酰胺色譜法;中壓制備色譜法;A549細(xì)胞;質(zhì)譜法

Extraction and Separation of Bioactive Flavonoids from Oxytropis Falcata by Polyamide Chromatography Combined with Medium-pressure Liquid Chromatography

Niu Liran1，2，Li Guancong1，2，Yang Guangming1，2，Pan Yang1，3，Cai Baochang1，2

（1 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2 Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Standardization of Chinese Medicine Processing & Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China; 3 Laboratory of Medical Fungi and Phyto-Biotech，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective： To extract and isolate the flavonoids from Oxytropis falcata （Of），and screen bioactive flavonoids on human lung adenocarcinoma A549 cells in vitro. Methods： Crude extraction was extracted from Of by ethyl acetate.Ethyl acetate extraction was further separated by polyamide column chromatography with gradient elution and purified by medium-pressure liquid chromatography to obtain the flavonoids; High performance liquid chromatography （HPLC），mass spectrometry （MS） and nuclear magnetic resonance spectroscopy （NMR） were used to analyze and elucidate the structure of the obtained flavonoids.CCK-8 analysis was used to detect the inhibited viability of flavonoids on human lung adenocarcinoma A549 cells in vitro. Results： There were 2 flavonoids isolated from Of ethyl acetate fraction，and were identified as 7-hydroxy dihydroflavone and 2′，4′-dihydroxy dihydrochalcone.Purity of them were both greater than 98% by HPLC analyses; The results of CCK-8 showed that 7-hydroxy dihydroflavone and 2′，4′-dihydroxy dihydrochalcone could significantly inhibit the viability of A549 cells in a dose dependent manner.The IC50 values were 137.6 μg/mL and 63.83 μg/mL at 48 h，respectively. Conclusion： The 2 flavonoids have effective bioactivities on inhibiting proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells，which could provide the experimental basis for the further studies on anti-lung cancer mechanism.Polyamide column chromatography is suitable for enrichment and isolation of flavonoids.Polyamide column chromatography combined with medium pressure liquid chromatography is simple and easy to prepare various flavonoids.Thus，the method could provide a reference for obtaining flavonoids from Chinese medicines.

Key Words? Oxytropis falcata; Flavonoids; Polyamide column chromatography; Medium-pressure liquid chromatography; A549 cells; Mass spectrometry

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.005

鐮形棘豆（ Oxytropis falcata? Bunge）為豆科棘豆屬植物，多年生無莖草本，藏族人稱之為“莪大夏”“達(dá)夏”[1]。據(jù)《晶珠本草》[2]及《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥第1冊記錄[3]，其根及根莖或全草入藥，味辛、性寒，有小毒，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈止血等療效。內(nèi)服可治療流感、扁桃體炎、炭疽及麻風(fēng)等，外敷可治療瘡癤腫痛、創(chuàng)傷及骨傷等，具有廣闊的開發(fā)前景。藏藥鐮形棘豆中富含黃酮類化合物。文獻(xiàn)報道已分離得到黃酮苷、黃酮及二氫黃酮、二氫查耳酮、查耳酮、黃酮醇、異黃烷及黃烷酮等成分[4-6]，且這些黃酮成分具有顯著的藥理活性[7-8]，是評價鐮形棘豆藥效的重要依據(jù)。因此，完善鐮形棘豆黃酮類成分的制備工藝，提高黃酮類成分的得率及純度，對于進一步開發(fā)利用鐮形棘豆的藥用資源具有重要意義。聚酰胺色譜法對各種黃酮類化合物均有較好的富集純化效果[9-10]，中壓制備液相色譜法單次上樣量大、步驟簡便，適合單體的規(guī)模化提取分離[11]。本實驗采用聚酰胺色譜法結(jié)合中壓液相制備色譜法，提取分離純化鐮形棘豆中黃酮類成分。通過2種方法的結(jié)合，實現(xiàn)了對鐮形棘豆中黃酮類化合物快速、有效的分離純化，得到了2個高純度的黃酮類化合物，并將黃酮單體進行人肺腺癌A549細(xì)胞的活性篩選實驗，為探索鐮形棘豆資源的進一步開發(fā)應(yīng)用和抗腫瘤活性成分研究提供依據(jù)。

1 材料

鐮形棘豆藥材于2016年12月采購自青海省共和縣，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院潘揚老師鑒定為豆科棘豆屬植物鐮形棘豆（ Oxytropis falcata?? Bunge）的干燥全草;柱色譜用聚酰胺（100～200目，化學(xué)純，國藥集團上海化學(xué)試劑有限公司），Reveleris 4 g硅膠柱（美國GRACE公司）;乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚、丙酮等液體試劑均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）;薄層層析硅膠G板（青島海洋化工廠）;CCK-8試劑盒（南京恩晶公司，批號20180714）;RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清（加拿大維森特公司，批號270636013）。

Mettler Toledo電子天平;Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀;Büchi Reveleris X2中壓液相制備色譜儀;X-4型數(shù)字顯微熔點儀;LC/MS-2020單極四級桿質(zhì)譜儀;Bruker-500核磁共振儀，TMS內(nèi)標(biāo);VS-1300-U超凈工作臺;Eppendorf 5810R高速冷凍離心機;Perkin Elmer Victor X3酶標(biāo)儀。

A549人肺腺癌細(xì)胞株，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室惠贈。取A549細(xì)胞株于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/L的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、90%相對濕度的培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞長至80%融合時，胰酶消化，按照細(xì)胞濃度需求傳代，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。

2 方法

2.1 提取與分離

2.1.1 鐮形棘豆的提取

稱取鐮形棘豆藥材10 kg，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇于室溫下冷浸提取3次，每次浸泡3 d，減壓抽濾，棄去殘渣，合并提取液，于50 ℃下減壓濃縮成浸膏;取上述浸膏500 g，經(jīng)2%鹽酸溶解，過濾，得酸性不溶物，再經(jīng)2%氫氧化鈉處理后過濾，濾液用1%鹽酸調(diào)節(jié)pH至5;將酸水液經(jīng)乙酸乙酯反復(fù)萃取，得乙酸乙酯萃取物100 g。

2.1.2 聚酰胺色譜富集分離

取100～200目聚酰胺粉，用體積分?jǐn)?shù)95%的沸乙醇冷凝回流2 h后，抽濾、烘干。稱取聚酰胺粉500 g，用超純水?dāng)嚢杈鶆?，濕法裝柱，輕輕敲擊玻璃柱至柱床面不再下沉，過程中始終保持水面高于聚酰胺，以超純水為起始洗脫液，調(diào)節(jié)流速至約25 mL/min，用超純水沖洗平衡。

2.1.3 中壓液相色譜分離純化

取乙酸乙酯萃取物20 g，經(jīng)中壓聚酰胺柱色譜進行分離，以水-無水乙醇為溶劑系統(tǒng)梯度洗脫（無水乙醇0～95%），等體積收集，各梯度流分經(jīng)TLC檢識合并，30%流分部位濃縮得到混合物A（2.5 g），50%流分部位得到混合物B（1.3 g）;混合物A和B分別取0.5 g，經(jīng)中壓液相制備硅膠柱進一步分離，以石油醚-丙酮為溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，混合物A的流分5（石油醚-丙酮=100∶ 25）得到化合物I（30 mg），液相色譜分離行為見圖1;混合物B的流分3（石油醚-丙酮=100∶ 15）得到化合物II（20 mg），液相色譜分離行為見圖2。分離流程見圖3。

2.2 人肺癌A549細(xì)胞生長抑制試驗（CCK-8法）

取I、II化合物各4 mg，精密稱定。加入50 μL的DMSO助溶，加入完全培養(yǎng)基5 mL，作為儲備液，用時稀釋，DMSO最終濃度不超過0.5%。將配制好的不同濃度的藥物（6.25 μg/mL，12.50 μg/mL，25.00 μg/mL，50.00 μg/mL，100.00 μg/mL，200.00 μg/mL，400.00 μg/mL），以0.22 μm微孔濾膜（GVMP 01230，Millipore，USA）過濾除菌，4 ℃保存待用。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入預(yù)先配制好的不同濃度樣品溶液各100 μL。每組平行設(shè)置6個復(fù)孔。置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h及48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，置酶標(biāo)儀中檢測，在波長450 nm處測定吸光度值（OD），每組重復(fù)3次。同時設(shè)立對照組，空白組。并按照以下公式計算細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率（%）=1- 實驗組OD-空白組OD 對照組OD-空白組OD ×100%。

3 結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

合物I：白色針晶，mp 188～190 ℃;ESI/MS（ m/z ）：240[M+H]+;1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.87（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），7.47～7.36（5H，H-2′～6′），6.55（1H，dd，J=8.5 Hz，2.2 Hz，H-6），6.48（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），5.58（1H，dd，J=12.7，3.0 Hz，H-2），3.07（1H，dd，J=16.8，12.7 Hz，H-3α），2.86（1H，dd，J=16.8 Hz，H-3β）;13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：190.83（CO），79.91（C-2），44.30（C-3），128.85（C-6，4′，5），110.63（C-6），163.62（C-7），103.45（C-8），162.82（C-9），115.16（C-10），138.75（C-1′），126.16（C-2′，6′），129.46（C-3′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對照一致，故確定化合物I為7-羥基二氫黃酮（7-hydroxy flavonone）。其核磁氫譜、碳譜數(shù)據(jù)見圖4和圖5;結(jié)構(gòu)式見圖6。

化合物II：白色針晶，mp 89～91 ℃;ESI/MS（ m/z ）：242[M+H]+;1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：12.72（1H，s，OH），7.63（1H，d，J=8.6 Hz，H-6′），7.31～7.19（3H，m，H-2，4，6），5.68（1H，brs，OH），6.37（2H，m，H-3′，5′），3.20（3H，t，H-2α），3.04（2H，t，H-2β）;13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：203.6（CO），140.83（C-1），128.38（C-2，6），128.60（C-3，5），126.30（C-4），113.91（c-1′），162.48（C-2′），103.64（C-3′），165.26（C-4′），107.71（C-5′），132.20（C-6′），39.67（C-α），30.37（C-β）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對照一致，故確定化合物II為2′，4′-二羥基二氫查爾酮（2′，4′-dihydroxy dihydrochalcone）。其核磁氫譜、碳譜數(shù)據(jù)見圖7和圖8。結(jié)構(gòu)式見圖9。

3.2 化合物I、II對A549肺癌細(xì)胞生長抑制作用

CCK-8結(jié)果顯示（見圖10），7-羥基二氫黃酮（化合物I）及2′，4′-二羥基二氫查爾酮（化合物II）細(xì)胞給藥24 h后，均對A549細(xì)胞的生長具有抑制作用，且抑制效果具有劑量依賴趨勢，兩者均在400 μg/mL時對細(xì)胞的增殖抑制作用最強，抑制率分別為62.3%和89.7%，給藥48 h后兩者最高濃度對細(xì)胞的抑制率分別為66.8%和90.6%，抑制效果與作用時間呈正相關(guān)趨勢;IC50值結(jié)果顯示（見表1），7-羥基二氫黃酮及2′，4′-二羥基二氫查爾酮細(xì)胞給藥48 h后，IC50值分別為137.6 μg/mL和63.83 μg/mL。綜上結(jié)果表明，7-羥基二氫黃酮及2′，4′-二羥基二氫查爾酮能夠顯著抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖，具有良好的抗肺癌活性。

4 結(jié)論

藏藥鐮形棘豆具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤等療效，被譽為“草藥之王”。近年來，確生[14]、魏學(xué)紅[15]等國內(nèi)學(xué)者對鐮形棘豆的化學(xué)成分、提取工藝、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面開展了大量的研究工作，為開發(fā)利用鐮形棘豆的藥用植物資源奠定了良好的基礎(chǔ)。黃酮類化合物作為主要的活性物質(zhì)是鐮形棘豆抗炎抗腫瘤研究的熱點[16]。因此，研究鐮形棘豆黃酮類成分的提取分離技術(shù)具有科研意義。

本研究采用聚酰胺柱色譜聯(lián)用中壓制備色譜的方法對鐮形棘豆乙酸乙酯萃取部位進行分離純化，得到2種黃酮單體成分;取7-羥基二氫黃酮及2′，4′-二羥基二氫查爾酮進行體外抗肺癌A549細(xì)胞活性篩選，結(jié)果表明，2種成分均能明顯抑制A549細(xì)胞的增殖，并具有劑量依賴趨勢，其中2′，4′-二羥基二氫查爾酮抑制效果更佳，給藥48 h的IC50值為63.83 μg/mL。本文提取分離成分方法的創(chuàng)新之處在于，聚酰胺具有富集黃酮的作用，是較為理想的吸附劑，利用黃酮類化合物富含酚羥基的特點，通過分子中的酚羥基與聚酰胺分子中的酰胺基形成氫鍵締合產(chǎn)生吸附，可顯著提高黃酮成分純度[17];與中壓制備液相色譜法聯(lián)用提取分離鐮形棘豆中的黃酮單一成分，簡便易行，提取效率快，單體成分純度高，是分離純化鐮形棘豆黃酮類化合物的新手段;將制備得到的黃酮單體進行體外抗肺癌A549細(xì)胞實驗，檢測其抗癌活性，為研究及闡述鐮形棘豆抗腫瘤活性黃酮單體成分及其抗腫瘤的作用機制奠定基礎(chǔ)。

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