外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復(fù)作用

景雷　歐愛春　李亞男　王英振

[摘要]目的探討多聚蛋白多糖（Aggrecan）過表達載體修飾骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）來源外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對新西蘭大白兔軟骨缺損的修復(fù)作用。方法培養(yǎng)兔源性BMSCs，流式細胞儀檢測第2代BMSCs表面蛋白CD44、CD29、CD34和CD45表達。慢病毒Aggrecan過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，超速離心法提取外泌體，Western Blot方法檢測外泌體分子標志物CD81和CD63的表達。構(gòu)建絲素蛋白支架聯(lián)合外泌體復(fù)合物，利用掃描電鏡技術(shù)檢測絲蛋白支架的結(jié)構(gòu)。利用蘇木精`-伊紅（HE）染色和番紅`-快綠染色檢測新西蘭大白兔軟骨缺損模型中軟骨結(jié)構(gòu)。結(jié)果第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表達分別為60.2%和58.3%，CD34和CD45表達分別為3.4%和2.6%。慢病毒Aggrecan過表達載體轉(zhuǎn)染效率為（95±2）%。掃描電鏡觀察顯示，外泌體為直徑40～100 nm雙層膜的膜狀結(jié)構(gòu)。Western Blot檢測顯示，外泌體可以表達分子標志物CD81和CD63。HE染色和番紅`-快綠染色結(jié)果顯示，Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復(fù)作用明顯優(yōu)于BMSC組和陰性對照組（F=19.298、12.548，P<0.05）。結(jié)論Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架對軟骨缺損的修復(fù)具有明顯的促進作用，可為骨性關(guān)節(jié)炎治療提供新的思路與方法。

[關(guān)鍵詞]外泌體;間充質(zhì)基質(zhì)細胞;絲素蛋白支架;骨關(guān)節(jié)炎

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of exosome derived from Aggrecan overexpression vector`-modified bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） combined with silk fibroin scaffold in the repair of cartilage defect in New Zealand white rabbits. MethodsRabbit`-derived BMSCs were cultured. Flow cytometry was used to measure the expression of CD44， CD29， CD34， and CD45 on the surface of the second`-generation BMSCs. Lentivirus Aggrecan`-overexpression plasmid was transfected into BMSCs， the exosomes were extracted by ultracentrifugation， and Western blot was used to measure the expression of the biomar`-kers CD81 and CD63. The silk fibroin scaffold`-exosome complexes were constructed， and scanning electron microscopy was used to observe the structure of silk fibroin scaffolds. HE staining and safranine`-fast green staining were used to observe cartilage structure in New Zealand white rabbits with cartilage defect. ResultsThe expression rates of CD44 and CD29 on the surface of the se`-cond`-generation BMSCs were 60.2% and 58.3%， respectively， and the expression rates of CD34 and CD45 were 3.4% and 2.6%， respectively. The transfection efficiency of lentiviral Aggrecan`-overexpression vector was （95±2）%. Scanning electron microscopy showed that the exosome had a double`-membrane structure with a diameter of 40-100 nm. Western blot showed that exosomes expressed the molecular markers CD81 and CD63. HE staining and saffron`-fast green staining showed that exosomes secreted by Aggrecan overexpression vector`-modified BMSCs combined with silk fibroin scaffold had a better effect in repairing cartilage defect than the BMSC group and the negative control group （F=19.298 and 12.548，P<0.05）. Conclusionexosomes secreted by Aggrecan overexpression vector`-modified BMSCs combined with silk fibroin scaffold can significantly promote the repair of cartilage defect， which provides new ideas and methods for the treatment of osteoarthritis in clinical practice.

[KEY WORDS]exosome; mesenchymal stromal cells; silk fibroin scaffold; osteoarthritis

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是關(guān)節(jié)外科最常見的疾病，也是目前臨床上的治療難題，其病理機制主要為軟骨細胞過度凋亡和軟骨基質(zhì)降解而導(dǎo)致的軟骨缺損[1`-3]。多聚蛋白多糖（Aggrecan）是軟骨基質(zhì)合成最主要的成分[4`-5]。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）具有多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下，可以分化成人體內(nèi)的多種細胞[6`-8]，如成骨細胞、軟骨細胞以及神經(jīng)細胞等[9`-11]。新近研究結(jié)果表明，BMSCs在特定誘導(dǎo)條件下可以轉(zhuǎn)化成成骨細胞，進而促進骨與軟骨損傷的修復(fù);而且BMSCs來源于病人自體，移植后可以避免排斥反應(yīng)，這為臨床上骨缺損的修復(fù)提供了一個新的思路[12]。本研究利用BMSCs的多分化潛能，構(gòu)建Aggrecan的過表達載體轉(zhuǎn)染BMSCs，收集外泌體，聯(lián)合絲素蛋白支架，探討其對于軟骨缺損的修復(fù)作用，以期尋找最優(yōu)化的治療方案，為OA的治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

新西蘭大白兔20只，雌性，年齡為（12.11±3.04）月，體質(zhì)量（5.47±1.01）kg，購自山東省濟南市實驗動物中心;胎牛血清購自Gibco公司;DMEM、TRIZOL及2.5 g/L的胰酶Trypsin均購自美國Invitrogen公司;氯仿、乙醇（體積分數(shù)0.75）及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國ABI Applied Biosystems公司;Real`-time PCR儀購自美國bio`-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1BMSCs分離和培養(yǎng)將兔麻醉后，消毒，鋪巾，利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿穿刺針采集新鮮骨髓，按1∶3體積比加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液，充分混勻后，移入25 cm2的Hank培養(yǎng)瓶中，差速培養(yǎng)法培養(yǎng)，3 d后去掉培養(yǎng)瓶中的油脂等雜質(zhì)，之后每3 d換1次細胞培養(yǎng)液。BMSCs細胞融合率達70%～80%后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2BMSCs鑒定采用流式細胞儀檢測BMSCs表面蛋白CD29、CD44、CD34和CD45的表達，采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察BMSCs的細胞形態(tài)。

1.2.3慢病毒Aggrecan過表達載體構(gòu)建兔源性Aggrecan基因序列從Pubmed genebank中獲得，序列號為NW_003159560;大小為40 893 bp（DNA linear CON 23`-JUN`-2016）;按照RNA過表達序列的構(gòu)建原則，構(gòu)建Aggrecan過表達序列，以環(huán)狀質(zhì)粒pHBLV`-U6`-ZsGreen`-PGK`-Puro作為質(zhì)粒的克隆載體。利用慢病毒轉(zhuǎn)染Aggrecan過表達載體。Aggrecan過表達質(zhì)粒的構(gòu)建和慢病毒的轉(zhuǎn)染均由上海吉凱公司完成。

1.2.4慢病毒細胞轉(zhuǎn)染取第2代BMSCs，將細胞接種到6孔板，待融合率為50%時進行慢病毒轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書操作，轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI）=50，慢病毒滴度為3×107 mg/L。慢病毒轉(zhuǎn)染效率=熒光下視野細胞/白光下視野細胞×100%。

1.2.5外泌體的提取和鑒定采用超速離心法收集BMSCs的外泌體，將Aggrecan過表達載體轉(zhuǎn)染72 h 的BMSCs和無病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液，使BMSC的外泌體分泌到培養(yǎng)液中，然后將收集的培養(yǎng)液加入到低溫超速離心機中，分別設(shè)置轉(zhuǎn)速和時間為：300 r/min，15 min;2 000 r/min，15 min;10 000 r/min，30 min;100 000 r/min，70 min。收集純凈外泌體，利用掃描電鏡進行形態(tài)鑒定。

1.2.6絲素蛋白支架的制備和檢測利用鹽瀝濾法將2 mL濃度為100 g/L的絲素蛋白溶液灌入24孔板中，加入450～600 μm的NaCl顆粒，室溫風(fēng)干3 d，鹽析法成型后將絲素蛋白支架晾干，修剪成10 mm×10 mm×10 mm大小圓柱狀絲素多孔支架，消毒后備用。利用掃描電鏡檢測支架結(jié)構(gòu)。

1.2.7實驗分組及處理取20只成年健康新西蘭大白兔，隨機分為空白組、BMSCs組、陰性對照組、實驗組，每組5只。各組動物用150 g/L水合氯醛靜脈麻醉（3 mL/kg）后，常規(guī)消毒鋪無菌單，取膝關(guān)節(jié)正中側(cè)切口，逐層切開皮膚、皮下軟組織、淺深筋膜，顯露膝關(guān)節(jié)股骨側(cè)，使用口腔鉆在其軟骨層進行鉆孔，形成長5 mm、寬2 mm、深3 mm的錐形軟骨缺損，制成軟骨缺損模型，生理鹽水沖洗，進行相應(yīng)干預(yù)后逐層縫合。空白組：造模后植入絲素蛋白支架;BMSCs組：造模后植入絲素蛋白支架+BMSCs外泌體復(fù)合物;陰性對照組：造模后植入絲素蛋白支架+轉(zhuǎn)染空白載體BMSCs外泌體復(fù)合物;實驗組：造模后植入絲素蛋白支架+轉(zhuǎn)染Aggrecan過表達載體BMSCs外泌體復(fù)合物。

1.2.8蘇木精`-伊紅（HE）染色和番紅`-快綠染色方法檢測軟骨缺損兔模型的軟骨結(jié)構(gòu)14 d后，將實驗動物處死，取4組新西蘭大白兔軟骨缺損組織行HE染色和番紅`-快綠染液染色，40 g/L多聚甲醛固定30 min;脫鈣處理4周;過二甲苯Ⅰ處理15 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ 10 min;體積分數(shù)1.00、0.95、0.90、0.85乙醇梯度處理各5 min;二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ 10 min，二甲苯Ⅲ 10 min，體積分數(shù)1.00、0.95、0.90、0.85乙醇各處理5 min，自來水沖洗5 min， HE染液和番紅`-快綠染液染色5 min，封片，倒置光學(xué)顯微鏡觀察。應(yīng)用改良O’Driscoll 評分系統(tǒng)評估HE染色結(jié)果，改良Mankin評分評估番紅`-快綠染色結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用±s形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

接種48 h后，原代BMSCs開始貼壁，細胞呈梭形或者多角形;培養(yǎng)至第2代后，細胞呈旋渦狀或者輻射狀生長，增殖迅速。流式細胞儀檢測顯示，第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29的表達率分別為60.2%和58.3%，CD34和CD45的表達率分別為3.4%和2.6%。

2.2慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs效率

慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后觀察顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，為（95.07±2.11）%。

2.3掃描電鏡下外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下不同視窗觀察顯示，支架表面粗糙、凹凸不平，有利于細胞黏附和遷移。

2.4外泌體的形態(tài)學(xué)和標志物鑒定

掃描電鏡觀察顯示，外泌體為直徑40～100 nm的雙層膜膜狀結(jié)構(gòu)。Western Blot檢測顯示，外泌體可以表達分子標志物CD81和CD63。

2.5軟骨缺損兔模型軟骨缺損部位HE染色和番紅`-快綠染色觀察

HE染色顯示，空白組軟骨缺損范圍大，炎癥細胞浸潤多;BMSCs組軟骨缺損范圍較空白組明顯減小;陰性對照組炎性細胞減少，支架略有消失;實驗組炎性細胞明顯減少，支架消失，血管生成。實驗組改良O’Driscoll評分低于空白組、BMSCs組、陰性對照組，BMSCs組評分高于空白組，差異均有顯著性（F=19.298，P<0.01）。番紅`-快綠染色結(jié)果顯示，空白組軟骨缺損范圍大，并伴有軟骨下骨硬化;BMSCs組軟骨缺損范圍較空白組明顯減小;實驗組軟骨缺損部位有明顯修復(fù)，且為纖維組織修復(fù)。實驗組改良Makin評分高于空白組、BMSCs組、陰性對照組，BMSCs組評分高于空白組，差異均有顯著性（F=12.548，P<0.05）。見表1。

3討論

本研究根據(jù)基因工程和組織工程的原理，以體外培養(yǎng)新西蘭大白兔來源的BMSCs為研究細胞，利用siRNA過表達技術(shù)構(gòu)建Aggrecan的過表達載體，轉(zhuǎn)染BMSCs，提取轉(zhuǎn)染后干細胞來源的外泌體，并且通過構(gòu)建絲素蛋白支架+外泌體復(fù)合體，對新西蘭大白兔軟骨缺損部位進行填充和修補，探討Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體對軟骨缺損的修復(fù)作用，以期為臨床上具有外側(cè)間室軟骨缺損的OA治療提供新的方法。既往研究表明，利用BMSCs復(fù)合異種骨基質(zhì)明膠可以有效修復(fù)大鼠橈骨缺損，提示組織支架可以促進BMSCs向骨細胞轉(zhuǎn)化，進而修復(fù)軟骨缺損部位[13`-15]。但是這種方法需要符合特定條件的組織工程支架體系，也就是需要特殊的“土壤”，BMSCs這個“種子細胞”才能更好地在其內(nèi)生長并且分化，但其臨床應(yīng)用的安全性有待進一步研究[16`-17]。有研究顯示，利用慢病毒構(gòu)建基因載體轉(zhuǎn)染BMSCs并不影響B(tài)MSCs的表型[18`-21]。另有研究顯示利用基因工程原理，構(gòu)建基因過表達的BMSCs也是提高“種子”有效分化的手段[22`-24]。本研究基于該理論，構(gòu)建Aggrecan基因過表達質(zhì)粒慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，制作新型“基因種子”，結(jié)果表明，Aggrecan基因過表達質(zhì)粒慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs具有較高的轉(zhuǎn)染效率，高達90%以上，可見慢病毒介導(dǎo)Aggrecan基因過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC是一種高效的轉(zhuǎn)染方法。

外泌體為一種新興的手段，可以作為無細胞物質(zhì)提取治療OA的手段之一[25`-28]。有研究結(jié)果顯示，在一定條件下，BMSCs可以促進軟骨細胞分化[29]，然而具體的作用機制未知。本研究利用超高速離心的方法，提取Aggrecan基因過表達質(zhì)粒慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs來源的外泌體，并且利用組織工程原理，構(gòu)建絲素蛋白支架，聯(lián)合外泌體，構(gòu)建外泌體+絲素蛋白支架體系。進而將基因修飾后干細胞來源外泌體與組織工程支架相結(jié)合，通過掃描電鏡觀察外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，可觀察到支架表面粗糙、凹凸不平，有利于細胞黏附和遷移。另外，我們還利用新西蘭大白兔構(gòu)建膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，應(yīng)用外泌體+絲素蛋白支架復(fù)合體對軟骨缺損部位進行填充和修復(fù)，HE染色和番紅`-快綠染色對軟骨缺損部位進行觀察，結(jié)果表明，實驗組改良O’Driscoll評分低于空白組、BMSCs組、陰性對照組，實驗組改良Makin評分高于空白組、BMSCs組、陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明外泌體+絲素蛋白支架復(fù)合體可以對軟骨缺損部位進行更有效的修復(fù)。

綜上所述，Aggrecan過表達載體修飾BMSCs分泌的外泌體聯(lián)合絲素蛋白支架復(fù)合體可以對軟骨缺損部位進行有效的修復(fù)，可以為臨床上OA治療提供新的思路與方法。

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