金蓮花的誘變生物學(xué)效應(yīng)研究

龔佳夢 耿金鵬 曹天光 秦壘 丁蘭 展永

摘要 利用快中子、返回式衛(wèi)星搭載、重離子多種方式處理野生金蓮花種子，研究其對金蓮花生物性狀及遺傳物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：快中子在花部性狀的作用更為顯著，花形變異較多；而返回式衛(wèi)星搭載的金蓮花植株在葉型的變異較為明顯；重離子輻照處理金蓮花的分子標(biāo)記結(jié)果顯示，7Li250Gy（29.11%）多態(tài)性比率高于12C100Gy（21.95%）、7Li200Gy（21.87%）、12C150Gy（20.39%）；聚類分析表明，7Li 250Gy輻照產(chǎn)生的突變株與對照的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，其次是7Li200Gy、12C100Gy，最后是12C150Gy。本研究為金蓮花優(yōu)勢新品種的選育提供了材料和新種質(zhì)資源，也為誘變育種的應(yīng)用和分子生物學(xué)水平上的研究提供了參考依據(jù)。

關(guān) 鍵 詞 輻射；金蓮花；航天；RAPD

中圖分類號 Q691 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A

金蓮花（Trollius）為毛茛科金蓮花亞科金蓮花屬植物，金蓮花莖葉形態(tài)優(yōu)美，花大色艷，株型緊湊，極適宜盆栽觀賞；同時(shí)其莖、葉、花、籽均可入藥，對多種炎癥有良好的治療效果，是常用中藥材。其無毒副作用、抗菌、抗病毒的特性催生出巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，因而金蓮花需求量日益增大，野生金蓮花不能滿足市場的巨大需求，同時(shí)野生金蓮花品質(zhì)不穩(wěn)定，種質(zhì)資源單一，需要對野生品種進(jìn)行馴化和改良。

20世紀(jì)80年代，輻射誘變育種在我國興起，它是一種生物誘變新技術(shù)，具有變異幅度大、罕見變異多、良性變異多、頻率高、且穩(wěn)定快等優(yōu)勢，在國內(nèi)外廣泛使用。輻射誘變育種主要利用加速的離子轟擊植物種子、胚芽、花粉等生物材料，使之基因突變，從而選育出新的品種，為優(yōu)良品種的選育提供豐富的植物材料，并在植物新品種培育方面取得了良好的效果。輻射可以對小麥同一突變體造成多種變異[2]。陳肖英[3]等通過航天育種的手段選育出蝴蝶蘭航蝴2號新品種，該品種既繼承了原品種“內(nèi)山姑娘”速生粗壯、花大色艷、花多耐開、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性好等優(yōu)良特性，還形成了一系列超親變異性狀。通過使用碳離子束誘變技術(shù)，Satoru Ishikawa[4]成功地生產(chǎn)出了在Koshihikari這一最受歡迎的日本溫帶水稻品種中積累了非常低的Cd的非轉(zhuǎn)基因水稻變種。張穎聰[5]等通過碳離子和質(zhì)子輻射“穗中紅48”番木瓜品種獲得大量突變單株，有株高矮、果實(shí)長等優(yōu)良性狀，為之后的進(jìn)一步研究提供大量素材。耿金鵬[6]通過7Li重離子輻射選育出早熟、株型、抗性等不同類型的玉米自交系210份，并組配出高產(chǎn)量的“福生”系列新品種。利用離子注入選育出的“京廣1號”、“京廣2號”蓮新品種改善了對重金屬和礦質(zhì)元素的吸收能力[7]。目前，國內(nèi)外對于金蓮花主要是其所包含的有效成分的研究，例如生物堿和黃酮類，對金蓮花物種保護(hù)和育種的研究報(bào)道較少[8]。選用輻射誘變方法選育金蓮花優(yōu)良品種的研究更是鮮有報(bào)道。采用輻射誘變育種的方法短期內(nèi)選育出可穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)、高品質(zhì)、觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值更大的金蓮花新品種的幾率更高。李碩[9]等對當(dāng)歸輻射選育品種藥材的結(jié)果證明無明顯毒性，臨床常用量安全可行，為輻射選育中藥材新品種臨床用藥的安全有效及推廣應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

返回式衛(wèi)星搭載作為輻射誘變的一種延伸，具有高真空、微重力、射線種類復(fù)雜等特殊條件，可以對進(jìn)入其中的植物材料誘發(fā)顯著變異。航天育種具有部分品種變異幅度大，育種周期短，誘變后代群體間出現(xiàn)一些有利的特殊突變體的優(yōu)勢[10]。已經(jīng)有一些關(guān)于玫瑰[11]、鳳仙花[12-13]、月季[14]、菊苣[15]等花卉航天育種的研究。

本實(shí)驗(yàn)利用快中子、返回式衛(wèi)星搭載、重離子的手段對野生金蓮花種子進(jìn)行誘變處理，研究當(dāng)代植株的生物學(xué)效應(yīng)。通過統(tǒng)計(jì)分析金蓮花的表觀性狀和檢測分析分子水平的多態(tài)性，探討多種誘變方式對野生金蓮花的影響，為擴(kuò)大金蓮花的種質(zhì)資源和選育出適合現(xiàn)階段生產(chǎn)需要的高品質(zhì)金蓮花品種提供一定的實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

輻照材料為河北省承德市圍場縣性狀穩(wěn)定的野生金蓮花種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料輻射處理

對照組：未經(jīng)任何處理的野生金蓮花。

采用4種不同方式對金蓮花種子進(jìn)行輻照處理，分別為：

1）在中國原子能科學(xué)研究院進(jìn)行的快中子輻照處理，標(biāo)記為N；

2）搭載2016年4月6日發(fā)射成功的“實(shí)踐十號”返回式衛(wèi)星，標(biāo)記為SP10；

3）在中國科學(xué)院近代物理研究所利用蘭州重離子加速器國家實(shí)驗(yàn)室生物輻射終端（HIRFL）的12C離子對金蓮花種子進(jìn)行輻照處理，使用的劑量分別是100 Gy、150 Gy，標(biāo)記為12C 100、12C 150；

4）在中國原子能科學(xué)研究院利用北京串列加速器核物理國家實(shí)驗(yàn)室生物輻射終端（HI-13）的7Li離子對金蓮花種子進(jìn)行輻照處理，使用的劑量分別是200 Gy、250 Gy，標(biāo)記為7Li 200、7Li 250。

1.2.2 田間試驗(yàn)

2014年在河北省承德市圍場縣田間種植對照（CK），快中子（N）處理及搭載“實(shí)踐十號”返回式衛(wèi)星（SP10）的金蓮花種子，種植期間對金蓮花表觀性狀進(jìn)行定期觀察。2017年在河北省承德市圍場縣田間種植對照（CK）、12C離子（12C）、7Li離子（7Li）輻射處理的金蓮花種子，采集其葉片―80 ℃冰箱保存，用于RAPD實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 提取基因組DNA

采用植物基因組DNA提取試劑盒的方法提取金蓮花基因組總DNA：提取未經(jīng)輻照處理的金蓮花基因組總DNA作為對照（CK），提取輻照處理12C 100、12C 150、7Li 200、7Li 250的金蓮花基因組總DNA。提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測合格后使用。

1.2.4 篩選隨機(jī)引物

參考李勇等[16]30種10個堿基大小的隨機(jī)引物中篩選出20種用于金蓮花隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增的隨機(jī)引物。20條隨機(jī)引物的堿基序列如表1所示。

1.2.5 隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增（RAPD-PCR）

植物主要性狀的遺傳性較低，且遺傳具有復(fù)雜性，因此基于形態(tài)特征對植物品種進(jìn)行選擇的方法并不可靠，最好的方法是利用分子標(biāo)記來檢測金蓮花的遺傳多樣性[17]。Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）分子標(biāo)記方法普遍用于生物DNA多態(tài)性研究，具有簡單、易操作、引物隨機(jī)、多態(tài)性高等優(yōu)勢。李勇等利用DNA隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增的方法從分子水平對不同產(chǎn)地的金蓮花進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，為優(yōu)良品種的選育提供了參考數(shù)據(jù)。

RAPD擴(kuò)增參考李勇等的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，并略有調(diào)整。PCR反應(yīng)使用Golden Easy PCR System試劑盒，25 μl反應(yīng)體系：DNA模板（200 ng/μl）2 μl，2X Reaction Mix（500 μM dNTP each，20 mM Tris-HCl（pH8.3），100 mM KCl，3 mM MgCl3，其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑）12.5 μl，Golden DNA Polymerase（2.5 U/μl）0.2 μl，隨機(jī)引物（10 μmol/L）2 μl，滅菌ddH2O 8.3 μl。PCR反應(yīng)在EasyCycler Gradient 96型擴(kuò)增儀上完成，擴(kuò)增程序：94 ℃ 40 s，94 ℃ 20 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，45個循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)果用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并成像觀察分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，按照有帶記為“1”，無帶記為“0”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得的結(jié)果用POPGENE32軟件計(jì)算多態(tài)性比率。參考李謹(jǐn)[18]等，定義計(jì)算公式：多態(tài)性比率（%）=（每個輻照處理組多態(tài)性條帶數(shù)/對照組總條帶數(shù)）。定義DNA多態(tài)性比率公式為M= nd /N×100%，式中，nd表示處理組相比對照組的差異條帶數(shù)目，N表示對照組總條帶數(shù)目。

利用POPGENE32軟件計(jì)算不同誘變處理植株間的遺傳距離。用NTSYS2.10軟件基于遺傳相似系數(shù)的OPGMA法對不同誘變處理植株進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 快中子輻射處理對金蓮花表觀性狀的影響

通過對金蓮花表觀性狀的觀察發(fā)現(xiàn)快中子輻射能夠引起M1代植株花形和葉片都發(fā)生明顯變異，花形變異豐富，葉片變異較少。

在圖1中，N-1花朵明顯大于對照（CK），花朵直徑可達(dá)到10 cm，極具觀賞價(jià)值，經(jīng)濟(jì)效益更高；此外，更是出現(xiàn)N-2的對生花朵，1根枝條上2朵金蓮花共生；N-3花瓣層數(shù)相比對照減少，；N-4花蕊增多且雜亂；N-5部分花瓣邊緣出現(xiàn)裂隙；N-6花瓣形狀由對照組扁長型變異為短圓；N-7花瓣向花蕊處彎曲聚集，較對照組緊密。由統(tǒng)計(jì)知，快中子輻照處理金蓮花在花形，花瓣、花蕊等多方面都發(fā)生明顯變異，如表2所示。

快中子輻射金蓮花植株葉片變異較少，變異株與對照相比，葉柄變長，葉片小葉缺裂程度增大，葉片變細(xì)長，如圖2所示。

2.2 返回式衛(wèi)星搭載對金蓮花表觀性狀的影響

通過對金蓮花表觀性狀的觀察發(fā)現(xiàn)返回式衛(wèi)星搭載金蓮花植株花形和葉片都發(fā)生明顯變異，花形變異少，葉片變異豐富繁多。

返回式衛(wèi)星搭載金蓮花花形變異少，只出現(xiàn)花瓣層數(shù)增多的變異株（圖3），而葉片變異種類繁多，每一株葉片都有少許不同，圖4給出了幾種典型變異葉片。由圖4，與對照相比，SP10-1葉片中心呈黃色，小葉缺裂程度變大，葉片變窄變長；SP10-2葉片小葉緊湊、較對照組圓潤，顏色較深；SP10-3多個葉片聚集叢生；SP10-4小葉間隔大、缺裂程度變小；SP10-5、SP10-6小葉變寬、去缺裂程度變小，且由羽形（CK）變異為掌形，SP10-6較SP10-5小葉短寬；SP10-7小葉無缺裂、變寬，鋸齒狀葉緣變平滑，葉片呈掌形。統(tǒng)計(jì)可知，返回式衛(wèi)星搭載的金蓮花植株葉片主要變異性狀為形狀、寬度及小葉缺裂程度，如表3所示。

2.3 誘變金蓮花的遺傳多樣性分析

RAPD分子標(biāo)記被廣泛地應(yīng)用于植物品種鑒定、群體結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性等，它是通過觀察基因組的擴(kuò)增片段來反應(yīng)不同品種之間遺傳物質(zhì)的差異情況。由于目前對金蓮花基因組結(jié)構(gòu)缺乏足夠的認(rèn)識，采用RAPD的方法對輻照處理后的金蓮花進(jìn)行遺傳多樣性分析是非常合適的。為從分子水平上進(jìn)一步探索誘變金蓮花植株間的差異，該研究用篩選出的20條隨機(jī)引物對CK和12C100、12C 150、7Li200、7Li250誘變處理樣品DNA進(jìn)行遺傳多樣性分析。

圖5是隨機(jī)引物OPB-9對對照和4個不同重離子輻照處理的金蓮花樣品的隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增電泳結(jié)果，箭頭所指為多態(tài)性條帶處，12C100分別在分子量為1 300 bp和1 500 bp處缺失1條帶，而在分子量為1 400 bp處多出1條帶；12C150在分子量為800 bp處缺失1條帶；7Li200在分子量1 300 bp處缺失1條帶；7Li250在分子量950 ～ 2 000 bp之間缺失6條帶。對20條隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到，對照株得到185條清晰穩(wěn)定擴(kuò)增條帶，分子量大小在200 ～ 3 000 bp之間，重離子輻照組多態(tài)性比率7Li250> 12C100>7Li200>12C150，分別為29.11%、21.95%、21.87%、20.39%（圖6）。重離子輻照處理中多態(tài)性比率最高的分別是OPH-3為引物的12C100處理達(dá)到71.43%，OPA-17＼OPA-19為引物的12C150處理達(dá)到50%，7Li200處理的OPB-4高達(dá)83.33%，7Li250處理的OPB-4同樣高達(dá)83.33%。

基于遺傳相似系數(shù)利用NTSYS2.10軟件UPGMA法對5種實(shí)驗(yàn)材料處理進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果如圖7。由聚類分析圖可知，當(dāng)截取遺傳相似系數(shù)水平為0.76時(shí)，對照和重離子處理材料聚為3類：對照CK和12C150在遺傳相似系數(shù)0.78處聚為一類、12C100為一類，7Li250、7Li200在遺傳相似系數(shù)0.83處聚為一類。用POPGENE32軟件得出對照和重離子處理材料間的遺傳距離，7Li250與對照組遺傳距離最遠(yuǎn)為0.384 1，其次是12C150、7Li200與對照組遺傳距離為0.264 5，最后12C100與對照組遺傳距離最近為0.243 6。

3 結(jié)論與討論

快中子輻照處理金蓮花植株花形發(fā)生直徑、對生、花瓣、花蕊等豐富變化，葉型變異較少，說明快中子在金蓮花花部性狀的作用更為顯著，花形變異較多。李多芳[19]等在快中子輻射百日草的研究中發(fā)現(xiàn)，百日草葉片和花部性狀均發(fā)生明顯變異，其中葉片變異性狀在植株生長過程中逐漸恢復(fù)，而花形花色變異種類繁多且變異性狀基本穩(wěn)定，與該研究結(jié)果相似。返回式衛(wèi)星搭載的金蓮花植株葉片在葉型、葉寬、缺裂等方面都發(fā)生了明顯變異，說明返回式衛(wèi)星搭載在植株葉型的變異較為明顯。王曾珍[20]航天誘變普那菊苣，變異株其特征為植株高大、單株分枝數(shù)多、基莖粗大、生殖枝和小花數(shù)多。焦展[21]航天誘變油葵，得到了一系列如株高變化、葉片變化、花期延長、始花期提前、百粒質(zhì)量增高等變異，推測這些變異在后代繁育中能夠使油葵表現(xiàn)更廣泛的適應(yīng)性和更強(qiáng)大的生活力，從而有望選育出優(yōu)異的品種類型。輻照后植株與對照株有明顯葉片性狀變化與該研究結(jié)果相似。重離子輻照金蓮花遺傳多態(tài)性分析顯示12C100、12C150、7Li200、7Li250多態(tài)位點(diǎn)百分率分別為21.95%、20.39%、21.87%、29.11%。余麗霞[22]等對碳離子輻射大麗花矮化突變體的RAPD分析，在所用的25條引物中，1.80×108 /cm2劑量輻照后有18 條引物擴(kuò)增出現(xiàn)多態(tài)性片斷，擴(kuò)增條帶多態(tài)率19.57%； 1.08×108 /cm2劑量輻照后僅有6條引物擴(kuò)增出現(xiàn)多態(tài)性片斷，擴(kuò)增條帶多態(tài)率5.76%。侯歲穩(wěn)[23]等在12C重離子輻照油菜誘變效應(yīng)研究中，42個RAPD隨機(jī)引物中有13個引物擴(kuò)增出差異條帶，30 Gy、90 Gy和180 Gy引起的RAPD變異率分別為22.1%、23.7%和36.2%。羅紅兵[24]等對7Li輻射玉米種子引起的基因組DNA變異分析，結(jié)果全都表明輻照后的植株DNA分子都發(fā)生了明顯變異且變異率差異較大。與該研究結(jié)果基本一致。輻射可有效引起金蓮花表型與DNA分子的變異。從微觀分子損傷到最終突變效應(yīng)的出現(xiàn)是一個極其復(fù)雜的過程。輻射誘變金蓮花的過程將發(fā)生能量沉積、動量傳遞和電荷交換效應(yīng)，直接或間接造成金蓮花的生物損傷，但由于金蓮花自身的防御與修復(fù)功能，以及一系列生化代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，最終呈現(xiàn)出表觀性狀與基因多態(tài)性的變異[25]?？熘凶?、返回式衛(wèi)星搭載、重離子不同誘變方式均可以有效改變金蓮花的遺傳物質(zhì)，為培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的金蓮花新品種提供了技術(shù)支持，在輻照誘變育種中有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，輻射后的金蓮花當(dāng)代植株不僅表觀性狀發(fā)生變異，DNA分子水平也發(fā)生突變，豐富了遺傳多樣性，為選育高產(chǎn)量、高品質(zhì)、高觀賞性的金蓮花優(yōu)勢品種提供了材料和新種質(zhì)資源。同時(shí)也為金蓮花在分子生物學(xué)水平上的研究提供了參考依據(jù)。

致謝：感謝中國科學(xué)院近代物理研究所和中國原子能科學(xué)研究院對輻射實(shí)驗(yàn)的幫助！

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[責(zé)任編輯 楊 屹]