拮抗菌HM-7培養(yǎng)基的優(yōu)化

唐蕊 張雪輝 鄭佳

摘? ?要： 以拮抗菌HM-7的光密度值為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行了優(yōu)化，利用分光光度法確定最優(yōu)培養(yǎng)基，旨在提高拮抗菌HM-7的產(chǎn)菌量，為進(jìn)一步研究拮抗菌HM-7提供一定的依據(jù)和參考，同時(shí)為生物防治在生活中廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，拮抗菌HM-7的最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖2 g、酵母膏8 g、NaCl 4 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.0，在此條件下培養(yǎng)24 h，更利于菌體生長，為擴(kuò)大培養(yǎng)拮抗菌HM-7打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 拮抗菌; 培養(yǎng)基; 正交試驗(yàn); 優(yōu)化

Abstract：The optical density of the antagonistic bacteria HM-7 was used as evaluation index， the carbon source nitrogen source and inorganic salt in the medium were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment， and the optimal conditions were determined by spectrophotometry. The aim of this study was to improve the yield and to provide a basis for the further study of antagonistic bacteria HM-7， meanwhile， it would lay the foundation for the extensive application of biological control in life. The results showed that the optimal medium of antagonistic bacteria HM-7 was glucose 2 g， yeast extract 8 g， NaCl 4 g， distilled water 1000 ml， pH 7.0， under these conditions， the growth of bacteria was much better than other formulas. Our results laid a foundation for expanding the culture of antagonistic bacteria HM-7.

Key words： Antagonistic bacteria; Culture medium; Orthogonal experiment; Optimization

近年來，環(huán)境問題顯露，人們的環(huán)保意識(shí)增強(qiáng)，隨著人類對化學(xué)防治和物理防治的質(zhì)疑越來越多，促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展、維護(hù)生態(tài)環(huán)境的生物防治逐漸深入人心，受到人類關(guān)注。生物防治主要包括以蟲治蟲、以菌治蟲、以菌治菌3類，通過生物間競爭作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及誘導(dǎo)抗性對植物體發(fā)揮作用，具有選擇性強(qiáng)、無污染、兼防兼治保持生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)[1] 。生物防治能夠很快的深入人心，得到人民的普遍認(rèn)可，完全取決于其對人體無害且能更好的防治病蟲害，因此需要大力推進(jìn)生物防治的發(fā)展，讓生態(tài)環(huán)境越來越好，人民幸福感提升。自古代廣東省利用黃柑蟻防治柑橘害蟲后，國內(nèi)外學(xué)者開始進(jìn)一步研究生物防治，因此生物防治成為防治病蟲害研究的一大熱點(diǎn)[2]。唐蕊等[3]從土壤中分離出對黃瓜枯萎病有拮抗作用的拮抗菌HM-7，鑒定為生防芽孢桿菌中的解淀粉芽孢桿菌，其具有廣泛的抑菌范圍，能夠抑制黃瓜等多種作物的病害，提高植物抗蟲性和抗逆性，因此有著良好的發(fā)展前景。

筆者通過對拮抗菌HM-7培養(yǎng)基的優(yōu)化，得到一個(gè)適合生長的培養(yǎng)基，給菌株提供良好的生活環(huán)境，提高產(chǎn)菌量。同時(shí)對拮抗菌HM-7的擴(kuò)大培養(yǎng)和儲(chǔ)存具有重要意義，為其以后應(yīng)用于生物防治提供保障，也為生物防治能廣泛的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為邢臺(tái)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離且保藏的拮抗菌HM-7，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 原菌液的制備 將微生物實(shí)驗(yàn)室保存的拮抗菌HM-7活化2 h，轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中在37 ℃、120 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)24 h，得到拮抗菌HM-7的原菌液[4]。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 碳源優(yōu)化試驗(yàn)：分別選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉作為碳源，保證基礎(chǔ)培養(yǎng)基的其他組分一樣。添加0.4%的碳源到未含碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，確保pH為7.0，以5%的接種量將原菌液接種到培養(yǎng)基中，在37 ℃，120 r·min-1的條件下培養(yǎng)24 h。用分光光度計(jì)測定600 nm處波長的光密度值，確定最佳碳源[5-6]。

氮源優(yōu)化試驗(yàn)：分別選擇蛋白胨、酵母膏、豆粕、氯化銨、尿素作為氮源，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他組分不變。添加1.0%的氮源到未含氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，確保pH為7.0，以5%的接種量將原菌液接種到培養(yǎng)基中，在37 ℃，120 r·min-1的條件下培養(yǎng)24 h。用分光光度計(jì)測定600 nm處波長的光密度值，確定最佳氮源[5-6]。

無機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)：分別選擇NaCl、 KCl、 K2HPO4、 KH2PO4、MgSO4 作為無機(jī)鹽，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他組分不變。添加0.5%的無機(jī)鹽到未含無機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，確保pH為7.0，以5%的接種量將原菌液接種到培養(yǎng)基中，在37 ℃，120 r·min-1的條件下培養(yǎng)24 h。用分光光度計(jì)測定600 nm處波長的光密度值，確定最佳無機(jī)鹽[5-6]。

1.2.3 正交試驗(yàn) 利用葡萄糖、酵母膏、NaCl 3個(gè)因素和不同添加量3個(gè)水平制成因素水平表1，采用L9（34）正交試驗(yàn)表來進(jìn)行正交試驗(yàn)，測定其對拮抗菌HM-7生長的影響，最終得到最優(yōu)培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對拮抗菌HM-7的影響 碳源優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，各個(gè)碳源對拮抗菌HM-7的生長影響不同，其中可溶性淀粉最差，蔗糖、麥芽糖、牛肉膏相差不大，葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，拮抗菌HM-7的光密度值為1.990，高于其他碳源。葡萄糖為單糖，容易被細(xì)菌吸收并利用，所以當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，菌體生長最好，能夠達(dá)到最優(yōu)狀態(tài);圖2為葡萄糖作為唯一碳源時(shí)不同添加量對菌體生長的影響情況，圖2表明不同的葡萄糖添加量對菌體生長也會(huì)有明顯的影響。在供試濃度變化范圍內(nèi)出現(xiàn)了偏低或偏高均不利于其生長的結(jié)果，故可以得出，當(dāng)添加量為0.3%時(shí)，菌體生長達(dá)到最好，此時(shí)光密度值為2.075。

2.1.2 氮源對拮抗菌HM-7的影響 氮源優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，不同氮源對拮抗菌HM-7的生長影響差異非常顯著。其中酵母膏作為唯一氮源時(shí)，拮抗菌HM-7的生長情況為最佳，此時(shí)的光密度值為2.197，蛋白胨次之，豆粕居中，氯化銨菌體生長量小，尿素最次。酵母膏高于其他有機(jī)氮源，成為最佳氮源。圖4是酵母膏作為唯一氮源時(shí)不同添加量對菌體生長的影響情況，圖4表明不同的添加量對菌體生長不像碳源那樣明顯，但也會(huì)有一定的影響。在供試濃度變化范圍內(nèi)說明酵母膏添加量為0.8%時(shí)更利于菌體的生長，光密度值達(dá)2.152，為最佳濃度。

2.1.3 無機(jī)鹽對拮抗菌HM-7的影響 無機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，不同無機(jī)鹽對拮抗菌HM-7的生長影響差異比較顯著。從圖5看出，KCL、NaCl、MgSO4作為唯一無機(jī)鹽時(shí)，拮抗菌HM-7的菌體生長量，相差不大，光密度值均在2左右，其中NaCl最佳，此時(shí)光密度值為2.043。K2HPO4和 KH2PO4作為唯一無機(jī)鹽時(shí)，光密度值明顯降低，說明其不利于菌體的生長。圖6為NaCl作為唯一無機(jī)鹽時(shí)不同添加量對菌體生長的影響情況，結(jié)果表明不同的添加量對菌體生長也會(huì)有明顯的影響。在供試濃度變化范圍內(nèi)出現(xiàn)了偏低或偏高均不利于其生長的結(jié)果，故可以得出，最合適的添加量為0.4%，此時(shí)光密度值為2.106。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對碳源、氮源、無機(jī)鹽3類不同培養(yǎng)基質(zhì)以及不同添加量進(jìn)行正交試驗(yàn)。其結(jié)果及極差分析如表2所示，通過極差的大小得出不同培養(yǎng)基質(zhì)對拮抗菌HM-7生長的影響效果。從表2中的OD值可以看出各因素對拮抗菌HM-7生長影響效果的主次順序?yàn)镃>B>A，即無機(jī)鹽（NaCl）>氮源（酵母膏）>碳源（葡萄糖）。通過OD值k值得知適合拮抗菌菌體生長的最佳組合為A1B2C2，所以最適合菌體生長的培養(yǎng)基配方為葡萄糖2 g·L-1、酵母膏8 g·L-1、NaCl 4 g·L-1。

3 討論與結(jié)論

通過對培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)基質(zhì)的研究，看出拮抗菌HM-7生長受氮源和無機(jī)鹽濃度的影響居多。實(shí)驗(yàn)得出拮抗菌HM-7生長的理想培養(yǎng)基配方為葡萄糖2 g·L-1、酵母膏8 g·L-1、NaCl 4 g·L-1，在此條件下拮抗菌HM-7的生長量較高，適合其生長。

相比于傳統(tǒng)的化學(xué)防治，生物防治具有環(huán)境污染小、對人畜無害、沒有殘留，能夠在不影響人們生活的情況下防治病蟲害。隨著人們更加注意環(huán)境問題，同時(shí)對綠色食品的需求有一定提高，生物防治成為了生物科學(xué)研究的熱點(diǎn)[7]。郝建安等[8]對解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)其對水稻紋枯病菌、黑痘病菌等有一定的抑制作用;代玉立[9]研究枯草芽孢桿菌菌株RSS-1，發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)τ筒司瞬【a(chǎn)生抑制;楊凡等[10]研究表明，淡紫紫孢菌pt361菌株能有效防治黃瓜根結(jié)線蟲，其對線蟲卵寄生率為72.6%，其菌株混合發(fā)酵液對線蟲幼蟲致死率達(dá)95.2%;閆建芳等[11]研究表明，鏈霉菌組合ST-2其發(fā)酵液對黃瓜枯萎病的相對防效達(dá)65.89%，顯著高于對照申嗪霉素39.50%的效果。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，拮抗菌可以作為微生物農(nóng)藥來發(fā)揮作用，能夠有目的性的殺害病蟲，同時(shí)可以保持生態(tài)平衡，因此微生物防治相對于化學(xué)防治更加容易在人們心中扎根，具有很好的發(fā)展前景[12]。但由于人們已經(jīng)長期使用化學(xué)防治來治理病蟲害，并沒有了解到認(rèn)識(shí)到生物防治的優(yōu)越性，加之生物防治實(shí)施受到多種因素影響，防治效果不穩(wěn)定，因此生物防治沒有大范圍實(shí)施到農(nóng)業(yè)和生活中，因此，在提高人們環(huán)保意識(shí)的同時(shí)，還需進(jìn)行技術(shù)的指導(dǎo)，確保生物防治的效果，為其能夠廣泛應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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