降解臍橙囊衣專(zhuān)用霉的誘變育種及產(chǎn)酶工藝優(yōu)化研究

龔靈茜

（湖南省長(zhǎng)沙市雅禮中學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

1 研究背景

筆者從湖南邵陽(yáng)當(dāng)?shù)氐哪毘戎鳟a(chǎn)區(qū)的腐爛臍橙、土壤中尋找產(chǎn)果膠酶的菌源。通過(guò)紫外誘變技術(shù)提高酶的產(chǎn)量，優(yōu)化誘變菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件，初步確定酶制劑脫囊衣工藝條件，為果膠酶大規(guī)模發(fā)酵提供參考依據(jù)，并且為生物酶法脫囊衣加工臍橙打下基礎(chǔ)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離篩選

2.1.1 初篩各菌株的菌落形態(tài)特征。經(jīng)連續(xù)馴化富集實(shí)驗(yàn)后，以富含果膠質(zhì)的臍橙囊衣果渣及柑橘果渣為唯一碳源及能源的培養(yǎng)基平板，對(duì)稀釋菌懸液進(jìn)行培養(yǎng)，初篩結(jié)果及菌落形態(tài)特征描述見(jiàn)表1。

表1 初篩后各菌株的菌落形態(tài)

2.1.2 菌株復(fù)篩。將透明圈較大的P5、P6、P7、P8菌株，采用復(fù)篩培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，進(jìn)行透明圈H(cm)、生長(zhǎng)圈C(cm)值的測(cè)定和搖瓶產(chǎn)酶酶活力的定量檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 復(fù)篩菌株H/C值與酶活力的比較

由表2復(fù)篩測(cè)定結(jié)果表明，菌株編號(hào)為P8酶活力較好；選擇該菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

2.1.3 菌株P(guān)8的分類(lèi)鑒定。菌體形態(tài)特征。P8在PDA菌落初為白色，后其上密生一層黑色粉粒，似粗地毯狀。菌絲枝繁茂，幼時(shí)無(wú)隔，老齡有隔；小孢子囊常生在輪生孢囊梗的頂端，孢囊孢子大、色淡、單細(xì)胞。

分子生物學(xué)鑒定。真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，又叫內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，主要包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2），其兩側(cè)分別是18S RNA基因和28S RNA基因。rDNA在種內(nèi)由于基因的流動(dòng)而經(jīng)常表現(xiàn)出很高的同源性，在種間則保持著各種程度的變異。變異的多少能夠反映生物進(jìn)化上屬內(nèi)種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。將菌株P(guān)8的rRNAITS2基因序列與GenBank內(nèi)登錄的不同種屬霉菌的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，分析各株序列間的同源性和差異及進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)上述菌落培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)觀察及18S RNA序列分析，初步鑒定P8為卷枝毛霉。

2.2 菌株P(guān)8的誘變及誘變株的篩選

2.2.1 紫外誘變時(shí)間。P8孢子紫外誘變劑量效應(yīng)曲線如圖1所示。可以看出，P8孢子經(jīng)紫外線照射后，再生菌落數(shù)逐漸減少。在0～10 min照射時(shí)間內(nèi)，曲線的變化很明顯。20 min以后，曲線的下降趨于平緩。根據(jù)圖1計(jì)算出P8最佳誘變的照射劑量為8 min。

圖1 紫外誘變劑量效應(yīng)曲線

2.2.2 誘變菌株的初篩

以8 min作為照射劑量誘變P8孢子，分別誘變3批，每批誘變后的單孢子懸液梯度稀釋后涂10個(gè)平皿。待孢子在平皿上已再生出菌落后，用滅菌牙簽將菌落挑入初篩平板中，每個(gè)平板10株誘變菌株，培養(yǎng)2～3 d。為此，從300多株誘變菌株中總共選出40株生長(zhǎng)速度快的誘變菌株。

2.2.3 誘變菌株的復(fù)篩

分別將40株誘變菌株每株接2個(gè)果膠酶篩選斜面培養(yǎng)，計(jì)算液體發(fā)酵產(chǎn)酶活力。根據(jù)酶活力的計(jì)算結(jié)果，從40株誘變菌株中選出酶活力較高的5株，進(jìn)行下一步的研究。根據(jù)誘變時(shí)的原始批次和編號(hào)，這5株菌分別命名為Y-9、Y-14、Y-19、Y-26、Y-37。

2.2.4 高產(chǎn)誘變菌株

取上述5株誘變菌株連同原始菌株在接種量相同條件下，進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)3次，產(chǎn)酶結(jié)果取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)表3的結(jié)果，選產(chǎn)酶活力明顯優(yōu)于原始菌株的Y-9、Y-26、Y-37編號(hào)的3株誘變菌株為高產(chǎn)誘變菌株。

表3 3株誘變菌株及原始菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶活力比較

表4 Y-9、Y-26和Y-37以及原始菌株P(guān)8連續(xù)進(jìn)行10代發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

2.2.5 誘變菌株產(chǎn)酶的遺傳穩(wěn)定

鑒于誘變菌株的性狀常不穩(wěn)定，對(duì)得到的3株誘變菌株（Y-9、Y-26和Y-37）進(jìn)行產(chǎn)酶的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可看出，Y-9和Y-37分別在傳代到第4代、第5代后，產(chǎn)量開(kāi)始減少，遺傳不穩(wěn)定。Y-26在連續(xù)轉(zhuǎn)接的10代里菌株的產(chǎn)酶活力都很穩(wěn)定，并且都顯著超過(guò)了對(duì)照的原始菌株，其差異均達(dá)極顯著水平(p＜0.01)，顯示Y-26的遺傳性能穩(wěn)定，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 誘變菌株Y-26的液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件

2.3.1 不同碳源與誘變株Y-26的產(chǎn)酶活力。以常見(jiàn)的果膠含量較為豐富的果膠廢水、臍橙囊衣果渣、橙皮粉、柚皮粉、桔皮粉為材料。

添加純果膠及含果膠豐富的果膠廢水明顯促進(jìn)誘變株Y-26聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶的合成，表明這兩種酶都屬于誘導(dǎo)酶。雖然純果膠作為碳源產(chǎn)酶活力高，但純果膠價(jià)格昂貴，造成生產(chǎn)成本高；橙皮粉、桔皮粉、臍橙囊衣果渣作為碳源產(chǎn)酶更經(jīng)濟(jì)，取材范圍廣，故用臍橙加工廢料作為Y-26的碳源來(lái)產(chǎn)酶，一方面可以節(jié)約成本，另外可避免因加工過(guò)程中囊衣及果皮丟棄造成環(huán)境污染。

2.3.2 不同氮源與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。本文以硫酸銨等為氮源探討了誘變株Y-26的產(chǎn)酶活力，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同氮源對(duì)誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

由表5可知，無(wú)機(jī)氮源硫酸銨產(chǎn)酶活力最高，平均達(dá)到35 172 U；尿素為氮源時(shí)酶活力次之；麥麩為氮源，菌株Y-26產(chǎn)酶力最低。因此，Y-26菌株以硫酸銨為氮源進(jìn)行研究。

2.3.3 不同金屬離子與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。金屬離子能促進(jìn)或抑制許多酶的產(chǎn)生，本文以Fe2+、Mg2+、Ca2+的不同濃度探討了誘變株Y-26的產(chǎn)酶活力。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6結(jié)果表明，Mg2+對(duì)產(chǎn)酶影響最大，對(duì)產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用； Ca2+對(duì)產(chǎn)酶有一定的抑制作用； Fe2+對(duì)產(chǎn)酶基本無(wú)影響。

2.3.4 初始pH與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行了不同起始pH對(duì)誘變株產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，誘變株Y-26對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，培養(yǎng)基起始pH在3～8均可發(fā)酵產(chǎn)酶，當(dāng)pH為5，誘變株Y-26產(chǎn)酶活力最高。

表6 不同金屬離子對(duì)誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

表7 初始pH對(duì)誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

2.3.5 培養(yǎng)時(shí)間與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。應(yīng)用前面優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)條件，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

由表8知，在時(shí)間為96～120 h范圍內(nèi)酶活力較高，酶活力沒(méi)有顯著差異?？紤]到產(chǎn)酶活力的穩(wěn)定性、節(jié)省時(shí)間及發(fā)酵所需的能源，最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間有待進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.3.6 不同溫度與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。誘變株Y-26置于不同溫度中，實(shí)驗(yàn)不同溫度與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力，結(jié)果見(jiàn)表9。

由表9知，在溫度為30℃～40℃范圍內(nèi)酶活力較高，考慮到節(jié)省能源，選擇30℃為最佳發(fā)酵產(chǎn)酶溫度。

表9 培養(yǎng)溫度對(duì)誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

2.4 誘變株Y-26酶制劑脫囊衣工藝初步研究

以酶制劑用量（酶濃度/%）、料液比（g/mL）、處理時(shí)間（min）、酸濃度（%）、溫度（℃）為實(shí)驗(yàn)因素，以砂囊得率為酶解囊衣效果評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)發(fā)酵酶制劑脫囊衣工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)與水平見(jiàn)表10。

由表10可知，根據(jù)R值大小為E＞D＞B＞C＞A，即影響酶解臍橙囊衣得率的主次順序?yàn)闇囟龋舅釢舛龋玖弦罕龋久笣舛龋緯r(shí)間；由表中K值分析可知酶解脫囊衣的最優(yōu)工藝組合為A4B1C3D4E4，即酶解時(shí)間為120 min，料液比為1:2，酶添加濃度為5%，酸濃度為0.5‰，酶解溫度為50 ℃。因此，需要以該工藝條件為驗(yàn)證試驗(yàn)，最后的砂囊得率為48.4%，故經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，A4B1C3D4E4為酶制劑脫囊衣的最佳工藝條件。

表10 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

3 結(jié)語(yǔ)

用傳統(tǒng)篩選和紫外誘變育種相結(jié)合技術(shù)手段，構(gòu)建遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)酶活力高且對(duì)臍橙囊衣降解具有高度專(zhuān)一性的微生物——卷枝毛霉。初步確定臍橙脫囊衣專(zhuān)用產(chǎn)酶卷枝毛霉的發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)該酶制劑提供理論參考。用該工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，不添加任何防腐劑，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期，原有的酸堿脫囊衣技術(shù)將被徹底更新?lián)Q代。通過(guò)改善臍橙橙汁胞加工工藝，促進(jìn)資源節(jié)約和環(huán)境保護(hù)，降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品更具競(jìng)爭(zhēng)力，產(chǎn)品質(zhì)量更安全可靠，有利于出口。