白屈菜紅堿對人高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系MHCC97-H生長侵襲和遷移能力的調(diào)節(jié)作用*

程金玉 趙樂中 李 偉 謝國永

商丘市第三人民醫(yī)院普外科 (河南 商丘， 476000)

原發(fā)性肝癌包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管細胞癌和肝膽管混合型癌，其中肝細胞癌占90%以上。多數(shù)患者確診時已經(jīng)屬于中晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移?；熕幬飭为毣蚵?lián)合使用效率不高，且毒副作用大，可重復(fù)性差。應(yīng)用中醫(yī)中藥能夠改善該類患者的癥狀，提高機體免疫功能，減輕放化療的不良反應(yīng)。白屈菜是傳統(tǒng)中藥材，具有止咳、鎮(zhèn)痛、解毒等多種功效。白屈菜紅堿是白屈菜中重要活性成分，具有抗炎、抑菌、抗寄生蟲等多種藥理活性[1,2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白屈菜紅堿對多種腫瘤細胞系有抑制作用，如鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、神經(jīng)瘤等[3]。筆者以體外培養(yǎng)的肝癌細胞MHCC97-H為研究對象，探討白屈菜紅堿對其生長、侵襲和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 白屈菜紅堿(純度>98%，CAS：34316-15-9)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰酶購自Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Ki67、VEGF、MMP-9抗體購自美國Cell Signalling Technology公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝癌細胞MHCC97-H的培養(yǎng) MHCC97-H細胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱。細胞每隔1 d更換新鮮培養(yǎng)基，傳代時使用0.25%胰蛋白酶消化。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。白屈菜紅堿溶解于滅菌水后，用0.22 μm針頭濾器過濾。

1.2.2 CCK-8檢測藥物毒性和細胞增殖 取對數(shù)生長期的MHCC97-H細胞，胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度至8×104個/ml，取100 μl細胞懸液至96孔板，正常條件下預(yù)培養(yǎng)6 h。待細胞貼壁后分別加入10 μl相應(yīng)濃度的白屈菜紅堿，并設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后檢測450 nm處光吸收值，細胞存活率=(加藥-空白)/(對照-空白)×100%。

取對數(shù)生長期的MHCC97-H細胞，胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度至4×104個/ml，取100 μl細胞懸液至96孔板，正常條件下預(yù)培養(yǎng)6 h待細胞貼壁。MHCC97-H細胞貼壁后，將細胞分為MHCC97-H組、白屈菜紅堿低濃度組(10μmol/L，簡稱低濃度組)、白屈菜紅堿中濃度組(20 μmol/L，簡稱中濃度組),白屈菜紅堿高濃度組(50 μmol/L，簡稱高濃度組),分別使用含0.10、20、50 μmol/L白屈菜紅堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，并設(shè)置空白對照組，分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入10 μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)檢測儀檢測450 nm處光吸收值。

1.2.3 體外侵襲實驗 Matrigel用無血清培養(yǎng)基稀釋后，取200 μl至Transwell上室，4℃風(fēng)干。取對數(shù)生長期的MHCC97-H細胞，0.25%胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，取200 μl細胞懸液接種于Matrigel包被的Transwell上層小室，下層小室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去上層基質(zhì)和細胞。4%多聚甲醛固定15 min，在濾膜上加幾滴吉姆薩染液，反應(yīng)10 min，蒸餾水洗后，倒置顯微鏡下隨機選擇5個400倍視野觀察計數(shù)并拍照，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.4 劃痕實驗 實驗前用記號筆于培養(yǎng)板背面劃平行的5條直線，滅菌后備用。將細胞傳代培養(yǎng)于12孔板中，加入不同劑量的藥物后，用10 μl槍頭沿培養(yǎng)板背面直線垂直劃痕。用預(yù)冷的PBS洗滌3次后，加入無血清培養(yǎng)液(含10 μg/ml的絲裂霉素C)進行培養(yǎng)，于0、 24 h進行拍照記錄，并計算劃痕閉合率，劃痕閉合率 =(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡實驗 收集不同濃度白屈菜紅堿作用24 h后的MHCC97-H細胞，用加蛋白酶抑制劑的裂解液冰上超聲裂解，4℃下12000 rpm離心30 min后取上清液，BCA法測定蛋白濃度。各組樣品上樣量為30 μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫下封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10 min；加二抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜后顯影，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白屈菜紅堿毒性檢測 以含有一系列濃度白屈菜紅堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)MHCC97-H細胞24 h后，檢測MHCC97-H細胞的存活率。結(jié)果顯示，濃度小于50 μmol/L時白屈菜紅堿對MHCC97-H細胞存活率沒有顯著影響；濃度大于100 μmol/L時白屈菜紅堿能明顯降低MHCC97-H細胞的存活率，見圖1。本實驗選擇白屈菜紅堿濃度小于50 μmol/L的3個梯度進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度白屈菜紅堿的細胞毒性圖

2.2 4組細胞增殖情況 檢測1、2、3、4天細胞的增殖。結(jié)果顯示，與MHCC97-H組相比，低、中、高濃度組細胞增殖倍數(shù)明顯降低(P均<0.05)，隨著白屈菜紅堿濃度和作用時間的增加，效果越明顯。見圖2。

2.3 4組細胞的侵襲能力 與MHCC97-H組相比，低濃度組侵襲細胞數(shù)目沒有明顯變化；而中、高濃度組細胞侵襲的細胞數(shù)目明顯降低(P<0.05)，且隨著白屈菜紅堿濃度的增加，效果越明顯。見圖3。

圖2 4組細胞增殖圖

圖3 4組細胞的細胞侵襲圖

圖4 4組細胞的細胞遷移圖

2.4 4組細胞的細胞遷移情況 結(jié)果顯示，與MHCC97-H組相比，低、中、高濃度組細胞劃痕閉合率明顯降低(P<0.05)，且白屈菜紅堿濃度越高，效果越明顯，見圖4。

2.5 4組細胞增殖、遷移相關(guān)蛋白表達情況 低濃度組細胞與MHCC97-H組相比，Ki67和MMP-9的表達明顯降低，VEGF的表達沒有明顯變化；與MHCC97-H組相比，中、高濃度組細胞的Ki67、VEGF、MMP-9表達顯著降低；且隨著白屈菜紅堿濃度的增加，變化越明顯(P<0.05)，見圖5。

圖5 4組細胞的增殖、遷移蛋白電泳及表達量圖

3 討論

隨著檢測和治療技術(shù)的發(fā)展，肝癌的診斷和治療取得較大進步。由于肝癌早期癥狀不明顯，絕大多數(shù)患者確診時屬于晚期。目前靶向治療藥物應(yīng)用范圍較小，放療和消融治療后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥性，使中晚期肝癌整體治療效果仍不容樂觀，患者5年生存率較低[4]。肝癌細胞系MHCC97-H由上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院建立，肺轉(zhuǎn)移率為100%。肝癌患者出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移后，治療手段較為有限，且生存率低。Gao 等研究發(fā)現(xiàn)，白屈菜紅堿能誘導(dǎo)對順鉑耐藥的肺癌A549細胞凋亡，對肺癌細胞株H1299、H460、非耐藥A549細胞凋亡沒有影響[5]。

無限增殖是腫瘤細胞重要特征之一。Zhang等發(fā)現(xiàn)，白屈菜紅堿抑制人胃癌細胞BGC-823生長，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[6]。本研究結(jié)果提示白屈菜紅堿能夠抑制人肝癌細胞MHCC97-H的增殖。

侵襲和遷移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，在臨床上腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移是其難以治愈的重要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段的綜合過程，一般包括脫落、轉(zhuǎn)移、著床和轉(zhuǎn)移灶血管形成，因此腫瘤轉(zhuǎn)移能力的抑制是腫瘤治療中的重要任務(wù)[7]。MMP-9是重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能特異性的降解基底膜中的主要成分IV型膠原，與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8,9]。血管內(nèi)皮生長因子VEGF是高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，能改變血管通透性，促進腫瘤血管生成，從而促使腫瘤發(fā)生侵襲和遷移[10,11]。本研究結(jié)果提示白屈菜紅堿具有抑制肝癌細胞MHCC97-H的侵襲和遷移的能力。

白屈菜紅堿屬于苯丙菲啶類堿，與蛋白激酶C的催化區(qū)直接結(jié)合，抑制蛋白激酶C的活性[5]。蛋白激酶C是存在于細胞質(zhì)的磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內(nèi)信號傳遞的重要介質(zhì)[12]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和腫瘤耐藥性[13]。VEGF與其受體結(jié)合后，磷酸化下游磷脂酰肌醇-3-羥激酶等，進而發(fā)揮相應(yīng)作用[14]。蛋白激酶C在VEGF下游蛋白的磷酸化過程中發(fā)揮重要作用，當(dāng)?shù)鞍准っ窩被抑制后，VEGF的作用被減弱[15]。白屈菜紅堿對蛋白激酶C的抑制作用或許是其影響MHCC97-H增殖、侵襲和遷移的重要因素，但其中的分子學(xué)機制需要進一步實驗去驗證。