高效液相色譜法測(cè)定布洛芬與羥丙基-β-環(huán)糊精的包合作用

張劍,靖會(huì),張博,韓祿,楊怡,劉春葉

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 藥物研究所,陜西 西安 710021)

包合常數(shù)(K)作為一個(gè)重要參數(shù),是直接決定著環(huán)糊精的包合性質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù),同時(shí)也是對(duì)環(huán)糊精應(yīng)用于在藥學(xué)研究過(guò)程中的一個(gè)不可缺少的參數(shù)應(yīng)用起著主要作用。環(huán)糊精包合常數(shù)的測(cè)定方法主要有：高效液相色譜法、紫外-可見分光光度法、相溶解度法、高效液相色譜法、核磁共振法、熒光法、圓二色譜法、表面張力法、相溶解度法、電化學(xué)法、量熱法、競(jìng)爭(zhēng)法和薄層色譜法等,它們各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍,其中紫外-可見分光光度法、高效液相法、核磁共振法和相溶解度法應(yīng)用較普遍[1]。為控制該包合物的質(zhì)量,本論文建立了以相溶解度法[2-5]測(cè)定布洛芬與羥丙基-β-環(huán)糊精K值及布洛芬在該包合物中含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

甲醇,色譜純；磷酸(95%)、布洛芬(98%)、羥丙基-β-環(huán)糊精均為分析純；去離子二次蒸餾水。

BP221S電子分析天平；VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀；CVDRTEX-S渦旋；TGL-16C離心機(jī)；DEF-6050真空干燥箱；SHA-C恒溫振蕩器；AgiLent1260高效液相色譜儀。

1.2 羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)與布洛芬(BF)的包合物制備

1.2.1 液態(tài)包合物的制備 分別配制濃度為0.2×10-2,0.4×10-2,0.6×10-2,0.8×10-2,1.0×10-2mol/L的HP-β-CD水溶液。加入過(guò)量BF固體粉末,置于25 ℃恒溫振蕩器中(r=180 r/min),連續(xù)振搖24 h使其達(dá)到溶解平衡。取上清液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾[6],取續(xù)濾液離心2 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,在221 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 固體包合物的制備 將液態(tài)包合物置于蒸發(fā)皿于30 ℃恒溫水浴中蒸干,得白色粉末狀包合物[7]。分別將白色粉末狀包合物、BF對(duì)照品粉末、HP-β-CD對(duì)照品粉末于30 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干,置于干燥器中備用。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 紅外光譜色譜法 采用KBr壓片法對(duì)BF對(duì)照品粉末、HP-β-CD對(duì)照品粉末及固體包合物進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。

1.3.2 高效液相色譜法 色譜柱：Aglient C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相：甲醇-水(0.2%磷酸)(90∶10),流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)221 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫35 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜表征

固體包合物、BF對(duì)照品粉末、HP-β-CD對(duì)照品粉末的紅外光譜圖見圖1。

圖1 包合物、HP-β-CD、BF的紅外光譜色譜圖Fig.1 Infrared spectroscopy of HP-β-CD,BF and inclusion

2.2 流動(dòng)相的確定

流動(dòng)相組成對(duì)包合物色譜峰的影響見圖2。在選擇流動(dòng)相時(shí),由于布洛芬在中性及堿性條件下易解離,從而導(dǎo)致拖尾現(xiàn)象,所以,通常會(huì)通過(guò)加入酸性改性劑來(lái)加以改善酸堿度。實(shí)驗(yàn)表明,使用甲醇-0.2%磷酸溶液(75∶25)就可以基本消除改善拖尾現(xiàn)象,在既能保證分離度的同時(shí),又能縮短分析時(shí)間。

圖2 不同流動(dòng)相比例的高效液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of the different proportion of mobile phase (HPLC)

依箭頭方向,流動(dòng)相(0.2%磷酸∶甲醇)的比例依次為：30∶70,25∶75,20∶80,10∶90

由圖2可知,流動(dòng)相的比例以0.2%磷酸∶甲醇=10∶90時(shí)色譜峰形最好。故本研究選擇0.2%磷酸∶甲醇=10∶90作為流動(dòng)相。

2.3 定量限和檢測(cè)限

將布洛芬對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液稀釋,得濃度分別為2 500,1 250,625,500,250,50,25,20 μg/mL的對(duì)照品溶液,在1.3.2節(jié)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè),測(cè)得定量限為50 μg/mL,檢測(cè)限為20 μg/mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取布洛芬對(duì)照品適量,用甲醇溶液制成濃度分別為50,250,500,625,1 000 μg/mL的系列對(duì)照品溶液,在221 nm處測(cè)定吸光度。以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸,得BF溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=42.573C+1 078.7,r=0.999 1,表明布洛芬在50～1 000 μg/mL范圍內(nèi),濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

2.5 方法學(xué)考察

布洛芬對(duì)照品儲(chǔ)備液,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次,峰面積RSD為0.97%(n=5),表明本方法精密度良好；在1,2,3,4,5,6 h進(jìn)樣,峰面積RSD為2.77%(n=6),表明本方法日內(nèi)法精密度良好；在1,2,3,4,5,6 d進(jìn)樣,峰面積RSD為4.06%(n=6),表明本方法日間法精密度良好；取包合物溶液,分別于室溫下放置2,4,6,8,10,24 h后,峰面積RSD為4.14%,結(jié)果表明包合藥物在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

分別對(duì)低(Ⅰ)、中(Ⅱ)、高(Ⅲ)三個(gè)濃度的布洛芬-β-環(huán)糊精包合物0.80 mL各3份,進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)[8],結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 1 Results of recovery test (n=9)

由表1可知,平均回收率106.7%,RSD為4.7%(n=9),表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.6 相溶解度曲線

參考Higuchi和Connors的方法[6,9],以HP-β-CD濃度為橫坐標(biāo),BF的溶解度為縱坐標(biāo),繪制相溶解度曲線見圖3,判斷其包合類型并計(jì)算包合常數(shù),按K=斜率/[S0(1-斜率)]計(jì)算結(jié)合常數(shù)K,其中S0為BF的固有溶解度。線性回歸得相溶解度曲線方程為Y=0.646 1X+0.4,r=0.997 7,表明布洛芬在0.151 9×10-2～0.678 6×10-2mol/L有良好的線性關(guān)系。隨著環(huán)糊精濃度的增加,藥物的溶解度呈線性提高,表明BF在HP-β-CD中的相溶解度曲線為AL型[3],BF與HP-β-CD以1∶1進(jìn)行包合[10]。經(jīng)計(jì)算,得到布洛芬在HP-β-CD溶液中的包合常數(shù)為7.23×103L/mol。

圖3 布洛芬的相溶解度曲線Fig.3 The solubility phase diagram of the ibuprofen

2.7 HP-β-CD對(duì)BF的增溶效應(yīng)

運(yùn)用相溶解度法測(cè)定布洛芬在HP-β-CD中的增溶效應(yīng),結(jié)果見表2。

表2 布洛芬在HP-β-CD中的增溶效應(yīng)Table 2 The solubilization effects of BF in HP-β-CD

由表2可知,BF的溶解度隨HP-β-CD濃度的增加而增大,當(dāng)HP-β-CD濃度為0.2×10-2mol/L時(shí),布洛芬的溶解度增加了6.02倍。當(dāng)HP-β-CD濃度為1.0×10-2mol/L時(shí),布洛芬的溶解度增加了26.88倍。

3 結(jié)論

采用相溶解度曲線法研究不同濃度的羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)與布洛芬的超分子相互作用。利用高效液相色譜法和紅外光譜法等手段研究了布洛芬和羥丙基-β-環(huán)糊精的包合情況。通過(guò)高效液相色譜法和紫外光譜測(cè)定布洛芬和羥丙基-β-環(huán)糊精包合常數(shù)?？梢缘贸觯築F與HP-β-CD以1∶1進(jìn)行包合,其包合常數(shù)為7.23×103L/mol。采用溶解性能很好的衍生物HP-β-CD對(duì)BF進(jìn)行包合作用,當(dāng)HP-β-CD濃度為1.0×10-2mol/L時(shí),BF的溶解度達(dá)到了0.678 6×10-2mol/L,比 BF 在水中的溶解度增加了近26.88倍。說(shuō)明HP-β-CD布洛芬形成的超分子化合物均有較好的增溶作用。但并不是K值越大越好,如果K值太大,藥物就難以從包合物中解離出來(lái),因此,實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中需要考慮最終制劑的目的和要求。