金黃色葡萄球菌生物被膜的形成與調(diào)控機(jī)制

常佳偉，萬(wàn)佳宏，王 曈，陳 程，王桂琴

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是革蘭氏陽(yáng)性菌，可以引起人和動(dòng)物感染化膿性疾病及毒素性疾病。S.aureus能夠附著在一些醫(yī)用器材上和宿主組織中，建立成熟的生物被膜(Bacterial biofilm，BF)，從而引起持續(xù)性感染。細(xì)菌生物被膜一旦形成，不僅保護(hù)細(xì)菌免受宿主吞噬細(xì)胞的殺傷作用，而且對(duì)抗菌藥物的耐藥性增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)菌對(duì)低氧、低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的耐受性也增強(qiáng)，這是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的一種自我保護(hù)形式，使對(duì)其的臨床治療變得更加困難。所以，研究S.aureus生物被膜的形成及調(diào)控機(jī)制，對(duì)預(yù)防與治療S.aureus引起的感染具有重大意義。

1 細(xì)菌生物被膜的概念及形成過(guò)程

生物被膜是指細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，其細(xì)胞及其分泌的多種蛋白質(zhì)、多糖等胞外多聚物(Extracellular Polymeric Substance，EPS)及細(xì)胞外DNA(eDNA)粘聚在一起，形成膜狀物質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)包裹在細(xì)菌的表面，并附著在生物及非生物表面[1]。細(xì)菌生物被膜的形成是由多種因素共同調(diào)控的，它的形成、聚集、解離是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化(圖1)[2]。細(xì)菌從浮游狀態(tài)到生物被膜的產(chǎn)生，主要分為5個(gè)階段：第一階段是可逆的附著：細(xì)菌通過(guò)非特異性的靜電、范德華力、空間相互作用可逆的附著在機(jī)體表面；第二階段稱(chēng)為不可逆的黏附定植：即浮游細(xì)菌經(jīng)過(guò)可逆的黏附階段，并逃避了宿主的清除后，產(chǎn)生一些相關(guān)蛋白及聚集因子，使其能夠牢固的黏附在機(jī)體上[3]；第三階段為結(jié)構(gòu)分化：細(xì)菌經(jīng)過(guò)附著與黏附后形成一些微小菌落，在細(xì)菌某些基因的表達(dá)下，使包裹在其外部的菌落結(jié)構(gòu)分化；第四階段是生物被膜的成熟發(fā)展：細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞分裂并與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，使細(xì)菌生物被膜形成緊密相連的、多層次的三維蘑菇狀結(jié)構(gòu)[4]；第五階段為解聚再定植：細(xì)菌生物被膜不斷增厚后，在特定基因的調(diào)控或外界因素的影響下，生物被膜內(nèi)的細(xì)胞解聚，又重新回到浮游狀態(tài)，再定植在其它的部位，從而形成一個(gè)循環(huán)過(guò)程[5]。

圖1 S.aureus生物被膜形成示意圖

2 S.aureus生物被膜的形成機(jī)制

S.aureus生物被膜的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，它的形成機(jī)制也很復(fù)雜，是由多種因素及多種基因共同調(diào)控的，并不是單一因素直接作用而形成。其主要是由多糖細(xì)胞間粘附素(PIA)依賴(lài)機(jī)制、相關(guān)蛋白依賴(lài)機(jī)制、eDNA共同作用的。

2.1 PIA依賴(lài)機(jī)制 細(xì)菌生物被膜基質(zhì)的主要成分是PIA，后者由β-1，6-連接的N-乙酰葡糖胺聚合物組成，也稱(chēng)為聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)[6]。PIA聚合物在生物被膜的結(jié)構(gòu)完整性中具有重要作用，并且其合成及修飾是由ica基因座編碼的蛋白質(zhì)所調(diào)控。ica包含4個(gè)功能基因(icaA、icaB、icaC、icaD)和1個(gè)調(diào)節(jié)基因(icaR)，ica基因編碼的蛋白質(zhì)含有PIA糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，icaD與icaA基因編碼的蛋白協(xié)同增強(qiáng)糖基轉(zhuǎn)移酶的活性[2]，icaB基因編碼外分泌蛋白，是去乙?；?，若失去icaB，PIA/PNAG被乙?；螅筒荒苄纬缮锉荒7]，icaC編碼的蛋白質(zhì)參與多糖粘附因子的糖鏈修飾，并合成長(zhǎng)鏈多糖，使之具有生物學(xué)功能[8]。icaR是一種阻遏基因，其與icaA啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并且負(fù)調(diào)控ica的表達(dá)，有研究顯示，當(dāng)敲除icaR后，能夠顯著增加細(xì)菌ica操縱子的表達(dá)及PIA生成[1]。

2.2 相關(guān)蛋白依賴(lài)機(jī)制 盡管ica編碼的蛋白調(diào)控PIA的合成是生物被膜形成的重要機(jī)制，但越來(lái)越多的研究表明細(xì)菌表面蛋白以獨(dú)立于ica依賴(lài)的機(jī)制介導(dǎo)附著、促進(jìn)細(xì)胞間粘附及生物被膜的積累與成熟。S.aureus表達(dá)28種表面蛋白，從牛乳房炎中分離出來(lái)的S.aureus生物被膜相關(guān)蛋白(Bap)、表皮葡萄球菌中分離出的積累相關(guān)蛋白(Aap)及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)中發(fā)現(xiàn)的纖連結(jié)合蛋白(FnBPs)，均可以介導(dǎo)生物被膜的形成[9]。此外，S.aureus的胞外粘附蛋白(Eap)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白(Emp)、表面決定簇蛋白C(IsdC)及細(xì)胞黏附素聚集因子(Clf A、Clf B）也參與生物被膜的形成。

纖維結(jié)合蛋白(FnBPs)促進(jìn)MRSA菌株生物被膜的形成，F(xiàn)nBPA和FnBPB均具有N末端A結(jié)構(gòu)域，其與凝聚因子ClfA、表皮葡萄球菌SdrG蛋白在結(jié)構(gòu)、功能上具有相關(guān)性，并在A結(jié)構(gòu)域的N2和N3末端通過(guò)DLL(dock、lock、latch)機(jī)制的變化與纖維蛋白原相結(jié)合，形成高度穩(wěn)定的復(fù)合物，纖維蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域是一個(gè)無(wú)序的串聯(lián)重復(fù)序列，F(xiàn)nBPA介導(dǎo)的S.aureus生物被膜在N末端A結(jié)構(gòu)域的N2和N3亞結(jié)構(gòu)域形成，DLL機(jī)制不參與生物被膜的累積(圖2)[10]。

圖2 S.aurcusFnBPA蛋白的示意圖

Bap依賴(lài)的S.aureus生物被膜最初在牛乳房炎中檢測(cè)到，但從未在人的分離菌株中檢測(cè)到，Bap通過(guò)獨(dú)立于胞外多糖的機(jī)制促進(jìn)細(xì)菌初始附著到生物及非生物表面。Bap是具有多結(jié)構(gòu)域特征的表面蛋白且含2 276個(gè)氨基酸和86個(gè)殘基序列的13個(gè)重復(fù)序列[11]。N末端結(jié)構(gòu)域(819個(gè)氨基酸)包含細(xì)胞外分泌的信號(hào)序列，且大部分不含重復(fù)序列；核心結(jié)構(gòu)域(aa820～aa2148)由86個(gè)氨基酸序列(C重復(fù)序列)的串聯(lián)重復(fù)序列組成，有預(yù)測(cè)這些C重復(fù)會(huì)折疊成新的結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞粘附，在這個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列區(qū)域Bap富含絲氨酸和天冬氨酸殘基序列片段，其與葡萄球菌表面蛋白Sdr家族的SD重復(fù)序列具有同源性。Bap的C末端含有典型的細(xì)胞壁附著區(qū)域，其包含LPETG基序(圖3)[12]。Taglialegna等研究表明，Bap的N末端區(qū)域被釋放到細(xì)胞外介質(zhì)中并組裝成類(lèi)淀粉樣纖維，而C末端重復(fù)區(qū)域的一部分錨定在被膜中，在感染過(guò)程中，Bap通過(guò)增強(qiáng)對(duì)上皮細(xì)胞的粘附來(lái)促進(jìn)在乳腺中的持久性，并與宿主受體結(jié)合阻止細(xì)胞內(nèi)化，從而干擾FnBPs介導(dǎo)的侵入途徑[13]。這表明Bap具有雙重作用：一方面介導(dǎo)細(xì)菌與細(xì)菌之間的相互作用，另一方面介導(dǎo)細(xì)菌與宿主之間的相互作用。

圖3 S.aureusBap蛋白的示意圖

S.aureus表面蛋白G(SasG)與Aap密切相關(guān)，Aap和SasG蛋白結(jié)構(gòu)與功能非常相似，兩種蛋白均有重復(fù)的G5結(jié)構(gòu)域，SasG蛋白與Aap可以促進(jìn)生物被膜形成的主要附著或積累階段[14]。此外，分泌蛋白如Eap在生物被膜成熟過(guò)程中發(fā)揮作用，其能夠促進(jìn)細(xì)胞聚集并與細(xì)胞表面結(jié)合[15]。

2.3 eDNA依賴(lài)機(jī)制 eDNA也是S.aureus生物被膜的細(xì)胞外基質(zhì)組成成分之一，其參與生物被膜的早期粘附階段與成熟階段，由于DNA聚合物的負(fù)電荷，其作為靜電荷聚合物，將細(xì)胞固定到物體表面或宿主中。eDNA通過(guò)細(xì)胞裂解而釋放出來(lái)的，主要是由cid基因調(diào)控，cidA是一種編碼胞壁質(zhì)水解酶活性效應(yīng)器及調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的基因。研究顯示，cidA基因突變促進(jìn)細(xì)菌裂解，從而增加eDNA的釋放；lrg基因是另一種與胞壁質(zhì)水解酶和細(xì)胞死亡有關(guān)的調(diào)節(jié)基因，但其與cidA基因有所不同，研究顯示，IrgAB基因突變，可以抵消cidA基因介導(dǎo)的DNA釋放效應(yīng)[16]。此外，一些細(xì)胞外蛋白如表面活性肽(PSM)、β毒素及免疫顯性表面抗原B(IsaB)能夠與eDNA結(jié)合形成不溶性寡聚體，可能具有穩(wěn)定ECM結(jié)構(gòu)的作用[17]。

3 S.aureus生物被膜調(diào)控系統(tǒng)

3.1 群感應(yīng)系統(tǒng)(QS)葡萄球菌有兩種QS系統(tǒng)，即Agr和AI-2(Autoinducer-2)，它們以不同的途徑降低生物被膜的形成。Agr基因編碼兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄物，分別是由P2和P3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RNAII和RNAIII，RNAII中含有4個(gè)基因(AgrA、AgrB、AgrC和AgrD)，AgrD編碼自體誘導(dǎo)肽(AIP)的前體，AgrB是一種多功能內(nèi)肽酶和伴侶蛋白，有助于AIP的成熟和輸出，AgrC和AgrA包含雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其中AgrC是膜組氨酸激酶，AgrA是響應(yīng)調(diào)節(jié)劑[18]。Agr系統(tǒng)依賴(lài)于細(xì)胞密度和自誘導(dǎo)物信號(hào)分子的積累。在S.aureus中，AIP在培養(yǎng)基中積累，當(dāng)其濃度達(dá)到一定的閾值時(shí)，就會(huì)結(jié)合并激活組氨酸激酶AgrC，AgrC激活后磷酸化AgrA，AgrA再激活P3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生調(diào)控RNA分子(RNA III)，調(diào)節(jié)幾種毒力因子和生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)[19]。Agr基因?qū)ι锉荒さ恼{(diào)控是多方面的，主要參與生物被膜的附著、黏附、增殖、成熟和分散階段。在已經(jīng)建立的生物被膜中，添加AIP可以重新激活agr，并通過(guò)增加細(xì)胞外蛋白酶的分泌促進(jìn)生物被膜的分離，AgrA調(diào)控PSM表達(dá)并參與生物被膜解離，當(dāng)PSM為單體時(shí)，其促進(jìn)生物被膜的解離，但當(dāng)其聚合形成淀粉樣纖維時(shí)，則促進(jìn)生物被膜的形成[20]。AgrB可以調(diào)節(jié)生物被膜的分散，因?yàn)樯锉荒ど锪?細(xì)胞、細(xì)胞外聚合物質(zhì)和eDNA)與agrB的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[21]。RNAIII控制生物被膜形成和積累，并且高RNAIII被認(rèn)為具有抗生物被膜效應(yīng)[22]。

AI-2信號(hào)分子是由4,5-二羥基-2,3-戊二酮(DPD)衍生的，由LuxS酶催化合成，目前已有研究表明LuxS/AI-2系統(tǒng)參與細(xì)菌生物被膜的形成。有研究顯示，LuxS/AI-2系統(tǒng)可以通過(guò)激活S.aureus中的icaR來(lái)抑制icaA基因的轉(zhuǎn)錄[23]，隨后在Ma R等研究中顯示，luxS突變體中icaR基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，icaA的表達(dá)量顯著增加，在luxS突變體中補(bǔ)充DPD，luxS突變體又恢復(fù)抑制生物被膜形成的能力，表明AI-2信號(hào)激活icaR基因，再降低icaA操縱子轉(zhuǎn)錄。LuxS/AI-2系統(tǒng)通過(guò)抑制S.aureus中rbf基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)PIA依賴(lài)性生物被膜的形成，這主要是因?yàn)镽bf通過(guò)直接結(jié)合sarX啟動(dòng)子來(lái)上調(diào)sarX的轉(zhuǎn)錄，而sarX又下調(diào)icaR的表達(dá)[24]，因此，LuxS抑制rbf基因的表達(dá)，降低icaA基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而使PIA依賴(lài)性的生物被膜形成減少。

3.2 全局調(diào)控因子 Sar基因座編碼DNA結(jié)合蛋白SarA，其是一種14.7 ku翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控S.aureus主要毒力基因的表達(dá)，同時(shí)也調(diào)控生物被膜的形成。研究顯示，SarA可以影響120個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，其中SarA可以促進(jìn)agr基因的表達(dá)，若agr突變，S.aureus生物被膜形成能力會(huì)增加[25]，在agr基因座的P2和P3間隔區(qū)具有SarA的結(jié)合位點(diǎn)，SarA與該區(qū)域結(jié)合，影響生物被膜的形成[26]。Valle等研究顯示，SarA突變能夠抑制ica基因的轉(zhuǎn)錄，使PIA的表達(dá)量下降，從而影響細(xì)菌生物被膜的形成[27]。Tormo等研究表明，ica啟動(dòng)子序列間存在多個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)，SarA易與ica操縱子中的DNA位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)ica操縱子的表達(dá)，SarA還可以上調(diào)icaR基因的表達(dá)，從而抑制PIA依賴(lài)性生物被膜的生成[28]。除此之外，SarA與Bap啟動(dòng)子特異性的結(jié)合，促進(jìn)Bap基因的表達(dá)，從而促進(jìn)生物被膜的形成[29]。

SigB調(diào)節(jié)子參與調(diào)節(jié)S.aureus的毒力、色素沉著以及生物被膜的形成，SigB突變減弱了SigB蛋白和nuc基因啟動(dòng)子之間的直接相互作用，從而降低nuc的表達(dá)并增強(qiáng)生物被膜的形成[30]。目前已有研究表明sigB和agr不是直接調(diào)節(jié)一些蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，而是需要中間參與者，其中最重要的一個(gè)是毒素抑制劑(Rot)[31]。Rot來(lái)自SarA金黃色葡萄球菌家族的DNA結(jié)合蛋白，具有雙重調(diào)控作用，因?yàn)槠浯龠M(jìn)編碼表面蛋白和免疫調(diào)節(jié)劑(如蛋白A和超抗原樣蛋白)基因的表達(dá)，并抑制編碼外毒素和胞外酶的基因表達(dá)。研究表明，Rot在agr下游起作用并抑制毒素和胞外酶的產(chǎn)生，當(dāng)agr被激活時(shí)，RNA III水平升高并阻止Rot蛋白的翻譯，減輕Rot抑制效應(yīng)[32]，因此，Rot也是S.aureus生物被膜形成的必要調(diào)節(jié)因子。

3.3 其它調(diào)控系統(tǒng) 目前發(fā)現(xiàn)了一種新的msaABCR操縱子，其中msa C和msa R對(duì)msaABCR操縱子表達(dá)至關(guān)重要。msaABCR不僅能夠調(diào)控S.aureus的生物被膜形成與毒力，而且還調(diào)節(jié)sarA、agr和sigB基因的表達(dá)[33]。經(jīng)生物信息學(xué)工具I-TASSER預(yù)測(cè)msaA是一種保守的假想蛋白，與雙精氨酸信號(hào)結(jié)合蛋白有很高的相似性，對(duì)其結(jié)構(gòu)分析還表明，其可能位于細(xì)胞質(zhì)中，可能參與小GTPase介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[34-35]。在msaA缺失突變體中，由于msaA基因的刪除，導(dǎo)致agr、sarA和sigB的表達(dá)量減少，在msaC缺失突變體中，sarA在生物被膜生長(zhǎng)期間表達(dá)減少，上游基因(msaA、masB)的表達(dá)量下降[36]。msaB基因序列分析顯示，其在S.aureus中編碼一種冷休克蛋白，msaB基因調(diào)節(jié)細(xì)菌色素沉著減少，蛋白酶活性增加，細(xì)胞死亡增加，生物被膜形成減少[37]。Sahukhal等研究表明，msaABCR操縱子調(diào)控4種細(xì)胞外蛋白酶(Aur、Scp、Ssp、Spl)在各種生長(zhǎng)條件中的表達(dá)，包括在生物被膜中，這些蛋白酶可以調(diào)節(jié)atl基因的活性、穩(wěn)定性和易位，并影響S.aureus生物被膜的自溶與發(fā)育[38]。所以，msaABCR操縱子在維持生物被膜內(nèi)自溶和生長(zhǎng)間的平衡具有關(guān)鍵作用。

4 展望

隨著耐藥細(xì)菌的逐年增加，越來(lái)越多的細(xì)菌能夠形成生物被膜，形成生物被膜是S.aureus慢性感染持續(xù)存在的重要因素。本實(shí)驗(yàn)室從寧夏地區(qū)奶牛乳房炎中分離出234株S.aureus，生物被膜陽(yáng)性率為79.06%，并且生物被膜陽(yáng)性菌株耐藥性均高于生物被膜陰性菌株，通過(guò)對(duì)生物被膜相關(guān)基因檢測(cè)分析顯示，其相關(guān)基因在生物被膜的形成過(guò)程中具有一定的作用，但在其陰性菌中也有相關(guān)基因的存在，這可能是受到環(huán)境或轉(zhuǎn)錄水平的影響，由此表明，S.aureus生物被膜的形成以及解離非常復(fù)雜且受到多種基因及調(diào)控系統(tǒng)的影響，需要進(jìn)一步深入地研究。目前研究中藥、聯(lián)合抗生素及一些微生態(tài)制劑干預(yù)S.aureus生物被膜感染的較多，而針對(duì)生物被膜的調(diào)節(jié)基因靶向抑制劑的研究很少。因此，深入研究S.aureus生物被膜形成及調(diào)控機(jī)制是非常有必要的，有助于發(fā)現(xiàn)生物被膜的特異性藥物干預(yù)靶點(diǎn)。從Agr、SarA、SigB、Rot等調(diào)控系統(tǒng)特異性靶向干預(yù)生物被膜的形成機(jī)制研究為抗細(xì)菌生物被膜藥物的研發(fā)提供新的思路。