關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨改變在不同骨關(guān)節(jié)炎動物模型中的特點

譚啟釗，牛國棟，趙振達(dá)，李思維，宋純理，冷慧杰*

(1. 北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京 100191； 2. 北京脊柱疾病重點實驗室，北京 100191)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種全球性的疾病，60歲以上的婦女的發(fā)病率為50%以上，已經(jīng)日益成為危害人類健康和加重社會負(fù)擔(dān)的重要因素[1]。骨關(guān)節(jié)炎最主要的特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的破壞缺損。然而，軟骨在關(guān)節(jié)中并不是孤立的組織，與其相連的組織均對其退變發(fā)揮著作用，尤其是軟骨下方直接相連的骨骼(軟骨下骨)，更是引起了學(xué)者們的注意，甚至有學(xué)者將軟骨和軟骨下骨作為一個整體來看待[2]。近年來越來越多的研究表明軟骨下骨代謝改變在OA進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，甚至有研究認(rèn)為軟骨下骨是OA治療的靶點[3-5]。創(chuàng)傷型OA模型，如前交叉韌帶切除術(shù)(anterior cruciate ligament transection, ACLT)，因為其成?？?，模型較成熟，目前很多關(guān)于軟骨下骨與OA關(guān)系的研究都是基于該模型展開[4]。OA的發(fā)病原因多樣，除了運動創(chuàng)傷病因外，還有退行性、激素改變等因素。軟骨下骨的改變在不同病因?qū)е碌腛A中表現(xiàn)和所發(fā)揮的作用還并不明確。文獻(xiàn)中常用的OA動物模型包括ACLT[6]、關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶(Papain)[7]、雙側(cè)卵巢切除術(shù)(ovariectomy, OVX)[8]等，它們代表了不同病因的OA。不同模型的OA軟骨退變進(jìn)程不一樣，同時，軟骨下骨代謝也有所不同。目前已經(jīng)有研究比較了創(chuàng)傷性O(shè)A模型和軟骨降解酶注射OA模型軟骨下骨的變化特征[9]。OVX-OA模型中軟骨下骨可能表現(xiàn)與其他模型不同，所發(fā)揮的作用可能也不相同。本研究假設(shè)不同類型OA中軟骨和軟骨下骨的病理改變機(jī)制不同，對不同病因的三種OA模型軟骨與軟骨下骨同時觀察，并進(jìn)行模型之間的橫向比較，希望有助于人們更深刻的認(rèn)識軟骨下骨對軟骨代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

6月齡SPF級雌性SD大鼠，24只，體重(250±15)g，來源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部【SCXK(京)2016-0010】，進(jìn)行編號，根據(jù)編號隨機(jī)抽取，分為4組：假手術(shù)對照組(Sham，n=6)，前交叉韌帶切除手術(shù)組(ACLT，n=6)，木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射組(Papain，n=6)，以及卵巢切除術(shù)組(OVX，n=6)。大鼠在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部【SYXK(京)2016-0041】進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(20±2)℃，相對濕度為40%～50%，12 h光照/12 h黑暗，自由活動。

1.1.2 主要試劑和實驗儀器

甲苯胺藍(lán)試劑(Amresco，美國)；木瓜蛋白酶試劑(美侖生物，中國)；EDTA脫鈣液(博士德，中國)；4%多聚甲醛(Biosharp，中國)；戊巴比妥鈉(北京嵐泰化工科技公司，中國)；抗生素(北京大學(xué)第三醫(yī)院藥房，中國)；micro-CT(Siemens，美國)；梯度自動脫水機(jī)(Leica，德國)；全景數(shù)字病理切片掃描分析裝置(濱松，日本)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備

(1)ACLT誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎模型

6只SD大鼠于造模前12 h禁食，用2%的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，用量為30 mg/kg，待其麻醉后進(jìn)行術(shù)前剃毛，常規(guī)消毒，鋪巾，在膝前正中切口切開，皮膚皮下組織，找到白色髕腱，沿其內(nèi)側(cè)切開關(guān)節(jié)束，同時使其膝關(guān)節(jié)過伸后屈曲膝關(guān)節(jié)找到前交叉韌帶，用眼科剪切斷，恢復(fù)其正常伸直位，之后進(jìn)行髕骨復(fù)位，逐層縫合關(guān)節(jié)囊，皮下組織和皮膚，在縫合前再一次消毒，并在術(shù)后進(jìn)行抽屜實驗驗證確實切斷了前交叉韌帶。在術(shù)后每天注射抗生素連續(xù)注射3 d，預(yù)防術(shù)后感染。

(2)木瓜蛋白酶注射模型

6只SD大鼠在造模前12 h禁食，手術(shù)時用2%的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，用量30 mg/kg，等待其麻醉后取仰臥位，在其膝關(guān)節(jié)髕骨下緣前內(nèi)側(cè)注射100 μL 2%的木瓜蛋白酶，在4,7 d分別再注射一次。

(3)卵巢切除動物模型

6只雌性SD大鼠在手術(shù)前12 h禁食，手術(shù)用2%戊比妥鈉腹腔麻醉，待其麻醉后，剔除其腰椎旁到股骨處毛發(fā)，取俯臥位，酒精消毒，脊柱旁1.5 cm處小切口切開背部皮膚，分離皮下脂肪，找到卵巢和子宮拉出后，緊貼卵巢下部結(jié)扎卵巢動脈，手術(shù)剪緊貼結(jié)扎線減掉卵巢，紗布適當(dāng)止血后，用生理鹽水沖洗傷口后，逐層縫合肌層和皮膚。術(shù)后每天注射抗生素連續(xù)注射3 d，預(yù)防術(shù)后感染。

1.2.2 標(biāo)本收取

在術(shù)后8周用10%過量麻醉法分別處死各組大鼠，取其膝關(guān)節(jié)，仔細(xì)剔除肌肉等周圍軟組織后，放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.2.3 Micro-CT掃描重建

對膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行掃描，掃描電壓與電流分別設(shè)置為80 kV，500 μA，掃描后進(jìn)行重建，重建好的圖像分辨率為13 μm。將脛骨平臺鈣化軟骨以下、骺線以上區(qū)域作為感興趣區(qū)域，對骨體積百分比、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分離度、軟骨下骨板厚度參數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.4 軟骨組織染色與OA評分

掃描重建完成后的標(biāo)本放入0.5 mol/L的EDTA溶液中脫鈣5周，每3 d換液一次，脫鈣后用手術(shù)刀沿冠狀位切取標(biāo)本，大小為1 cm × 0.5 cm × 0.5 cm，之后進(jìn)行流水沖洗10 h，酒精脫水。經(jīng)自動梯度脫水機(jī)進(jìn)行后續(xù)脫水。石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為5 μm，切片行甲苯胺藍(lán)染色。每個標(biāo)本隨機(jī)選擇3個切片，每個切片根據(jù)軟骨結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞排列方式、軟骨基質(zhì)染色、潮線情況等進(jìn)行Mankin法OA評分[10]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18對4組間進(jìn)行單因素方差分析，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗值為P，認(rèn)為P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨組織切片觀察和Mankin評分結(jié)果

如圖1所示，8周后對照組軟骨結(jié)構(gòu)比較完整，細(xì)胞排列整齊，未見明顯軟骨缺損(圖1A)。ACLT組軟骨邊緣出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破碎，表層出現(xiàn)毛糙，染色變淺。深層出現(xiàn)水平和垂直裂隙，染色缺失(圖1B)。木瓜蛋白酶組軟骨整體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，軟骨層變薄，有些部位近乎消失，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)大范圍缺失。軟骨部位出現(xiàn)肉芽組織，并且與骨髓腔相通(圖1C)。OVX組軟骨大體結(jié)構(gòu)完整，軟骨表面出現(xiàn)少量多糖流失及少量毛糙，透明軟骨表層稍有不平(圖1D)。

注：A. 假手術(shù)對照組；B. ACLT手術(shù)組；C.木瓜蛋白酶組；D. 卵巢切除組(bar=250 μm)。圖1 軟骨甲苯胺藍(lán)染色(箭頭指示了軟骨表面區(qū)域)Note. A.Sham, B. ACLT, C. Papain, D. OVX(bar=250 μm).Figure 1 Histological changes of articular cartilage in the rats(Toluidine blue staining)

根據(jù)Mankin法對手術(shù)后8周的各組軟骨切片進(jìn)行評分，各組的各分項評分如圖表1所列，總分如圖2所示。對于不同的OA模型，術(shù)后8周時，木瓜蛋白酶注射組Mankin評分最高，軟骨破壞最為嚴(yán)重，OVX組Mankin評分最低。各實驗組除OVX組外，與Sham組相比較，均有顯著性差異。

2.2 不同OA模型脛骨平臺軟骨下骨骨小梁參數(shù)

OVX組與正常對照組相比BV/TV減低，較ACLT組也減低，且均有統(tǒng)計學(xué)差異。OVX組與對照組和ACLT手術(shù)組相比骨小梁分離度增大，兩者均有顯著性差異。骨小梁厚度ACLT手術(shù)組較對照組稍高，OVX組稍低，木瓜蛋白酶注射組與對照組基本相等，三組與對照組相比差異無顯著性。OVX組骨小梁數(shù)量與其他三組相比降低，且差異有顯著性。ACLT組骨小梁容積百分比、骨小梁數(shù)量顯著高于Papain組，骨小梁分離度顯著小于Papain組。三個實驗組與對照組相比軟骨下骨板厚度都減少，差異有顯著性。(圖3，圖4)

表1 各組Mankin方法OA評分Table 1 OA scores of all groups by Mankin’s histological grading

注：*P < 0.05。(下圖同)圖2 各組關(guān)節(jié)Mankin OA評分Note.*P < 0.05. (The same in the following figures)Figure 2 Mankin OA scores of articular cartilages in all groups

注：A. 假手術(shù)對照組；B. ACLT手術(shù)組；C.木瓜蛋白酶組；D. 卵巢切除組。圖3 脛骨平臺軟骨下骨Micro-CT圖像Note. A.Sham, B. ACLT, C. Papain, D. OVX.Figure 3 Micro-CT images of subchondral bonesof different rat groups

3 討論

本研究關(guān)注軟骨下骨在OA進(jìn)展中的作用這一熱點問題，通過選取不同大鼠OA模型來探討不同病理因素導(dǎo)致OA情況下，軟骨以及軟骨下骨在OA進(jìn)展中的變化特點。研究顯示，代表不同病理的OA模型在造模8周時，軟骨缺損和軟骨下骨微結(jié)構(gòu)變化程度不同，提示軟骨下骨可能發(fā)揮不同作用。

軟骨是OA中最被人們所關(guān)注的部位。我們的研究發(fā)現(xiàn)，同樣造模8周，軟骨缺損程度OVX組最弱，僅出現(xiàn)了類似蛋白聚糖流失的表面退變；ACLT組軟骨缺損相對比較嚴(yán)重，某些部位已經(jīng)出現(xiàn)了表層以及深層的缺損與破壞；Papain組最為嚴(yán)重，軟骨已經(jīng)近乎完全破壞，肉芽組織增生。這三種OA模型的軟骨缺損結(jié)果與文獻(xiàn)中觀察基本一致[8-12]。有一點值得注意，OVX組的OA評分雖然均值高于Sham組，但沒有統(tǒng)計性差異。這是因為OVX-OA表征OA的最初期變化，其軟骨缺損主要表現(xiàn)為軟骨表層蛋白多糖的流失，尚未造成結(jié)構(gòu)的顯著改變，對經(jīng)典的OA評分系統(tǒng)不敏感。Hoegh-Andersen等[8]認(rèn)為宜采用表面缺損評分系統(tǒng)來評價此類初期OA。

圖4 脛骨平臺軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Figure 4 Trabecular analysis of subchondral bone by Micro-CT imaging

軟骨下骨在OA進(jìn)程中發(fā)揮的作用越來越受到人們重視，不過目前還沒有研究對不同病理OA情況下軟骨下骨的作用進(jìn)行比較。研究結(jié)果顯示，OVX組相對于Sham對照組，軟骨下骨微結(jié)構(gòu)顯著疏松，而ACLT組與Papain組相對于Sham對照組，軟骨下骨微結(jié)構(gòu)沒有顯著差異，但相對于OVX組，有統(tǒng)計性差異。在我們研究的三種OA模型中，ACLT組通過手術(shù)手段令軟骨所處的力學(xué)環(huán)境失穩(wěn)，從而造成軟骨磨損加劇，快速缺損。Papain組通過關(guān)節(jié)腔直接注射木瓜蛋白酶，通過化學(xué)刺激，直接令軟骨降解，極速缺損。ACLT和Papain這兩種模型直接針對軟骨組織，因此軟骨缺損快。兩者相比較，ACLT是力學(xué)作用，相對較慢；Papain是化學(xué)作用，相對更快。這兩種模型中軟骨下骨處于相對被動地位，在第8周時，并未發(fā)生顯著變化，因此可能沒有對軟骨的退變起到關(guān)鍵作用。而OVX-OA模型的主要手段是降低雌激素水平，而雌激素缺乏直接導(dǎo)致骨量流失和骨質(zhì)疏松[13]，因此研究發(fā)現(xiàn)軟骨下骨微觀結(jié)構(gòu)的改變顯著高于其他兩個模型，而軟骨缺損輕微。OVX-OA中，軟骨下骨的改變可能對軟骨造成力學(xué)與生物學(xué)環(huán)境的改變，從而對軟骨的缺損起到更重要的作用。在大多數(shù)OA人群中，Papain和ACLT類似的OA只占少數(shù)，因此在臨床實踐中，軟骨下骨對OA中的作用不容忽視。

有趣的是，軟骨下骨骨板厚度這一指標(biāo)在不同OA動物模型中均相對于Sham組顯著減少。這個結(jié)果與Femke 等的研究結(jié)果相似，他發(fā)現(xiàn)在ACLT和軟骨破壞OA模型早期軟骨下骨板厚度即可出現(xiàn)減少。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)軟骨下骨板厚度改變和軟骨破壞有關(guān)系，軟骨下骨骨板在OA中變薄可能是面對軟骨持續(xù)缺損的調(diào)節(jié)改變[14-16]。我們研究發(fā)現(xiàn)OVX-OA軟骨下骨板同樣變薄。因為OVX-OA軟骨缺損并不顯著，因此骨板變薄的機(jī)理可能與其他兩個模型不一樣，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。我們的研究發(fā)現(xiàn)軟骨下骨板在不同模型中變化趨勢一致，而骨小梁結(jié)構(gòu)變化趨勢不一致，可能也說明軟骨下骨板在OA進(jìn)程中可能會起一個更重要的作用。

綜合文獻(xiàn)中的研究和本研究的結(jié)果看,不同的OA造模方法可以造成軟骨損傷與軟骨下骨結(jié)構(gòu)變化的差異，這可能是由于不同的OA模型代表了不同的OA發(fā)病機(jī)制。其中，關(guān)節(jié)腔注射膠原蛋白降解酶類的OA模型造模速度快，但與臨床常見OA情況有所差異；ACLT與OVX模型在臨床上有對應(yīng)的患者人群，尤其是OVX-OA對應(yīng)的絕經(jīng)后婦女的OA的患者人群相對較大。我們在實驗研究中要根據(jù)研究目的選擇合適的OA模型；在臨床OA診斷治療中，要具體問題具體分析，找準(zhǔn)靶點，在合理的時間點進(jìn)行合理的治療干預(yù)。