人源性的小細胞肺癌異種移植動物模型及耐藥模型的建立

朱亞如 黃衛(wèi)妹 吳源周 賈龍飛 李雅玲 陳瑞 郭琳瑯 陳群清

在全世界范圍內肺癌是癌癥患者死亡的首要原因，其中小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）占15%-18%[1]。SCLC是一種高代謝、高轉移腫瘤[2]，其致死率高，5年生存率僅約5%。在臨床上，EP方案（順鉑+依托泊苷）是SCLC最常用的化療方案[3]。盡管大多數病人在初始治療時對化療藥物敏感，但極易出現(xiàn)化療耐藥[4,5]。因此，尋找SCLC有效的治療手段，對延長SCLC患者的生存具有重要意義。人源腫瘤組織異種移植模型（patient-derived xenotransplantation, PDX）是指腫瘤患者的手術標本或穿刺標本不經過其他培養(yǎng)或處理而直接移植到免疫缺陷鼠皮下。相比于傳統(tǒng)的細胞系來源的腫瘤動物模型（cell line derived xenografts, CDX），PDX模型很好的保留了腫瘤的異質性及遺傳特性,更符合臨床病理特征[6]。PDX動物模型適用于評估臨床藥物的療效，也可用于研究腫瘤的生物標記分子，還可以為個體化治療研究提供實驗手段[7]。目前國內外研究機構成功構建PDX模型的腫瘤有乳腺癌[8]、肝癌、胰腺癌[9]、食管癌[10]、胃癌[11]、結直腸癌[12]、宮頸癌、膀胱癌[13]、非小細胞肺癌[14]、胸膜間皮瘤[15]、頭頸部鱗癌[16]、神經膠質細胞瘤[17]、小細胞肺癌[18]。由于SCLC早期容易發(fā)生轉移，大部分病人在診斷時就已失去手術機會，臨床標本難以獲得，給PDX模型的構建帶來了極大挑戰(zhàn)。本研究成功構建3例人源化的SCLC荷瘤B-NSG鼠動物模型及其耐藥模型，并可穩(wěn)定多次傳代于B-NSG鼠，移植瘤較好地保留了原發(fā)腫瘤的特性，為中國人SCLC的藥物評估和篩選及患者的個體化治療提供臨床前研究平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤標本來源 SCLC腫瘤標本來自南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、廣東省人民醫(yī)院和廣州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，標本的收集均取得患者知情同意，所有動物實驗通過了南方醫(yī)科大學和廣州醫(yī)科大學醫(yī)學動物研究倫理委員會的批準。

1.1.2 實驗動物 動物實驗所用小鼠N O DPrkdcscidIL2rgtm1/Bcgen（B-NSGTM）均為雌性，4周齡-6周齡，體質量17 g-20 g，購于百奧賽圖有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（蘇）2016-0004。BALB/C鼠購于中山大學實驗動物中心，全程飼養(yǎng)于無特定病原體（specific pathogen free, SPF）級動物實驗房空氣層流架內（室溫恒定于20 ℃-22 ℃，空氣濕度30%-50%），予以動物的飼料為鈷輻射滅菌過的小鼠專用顆粒飼料，約每2天-3天更換清潔籠子。

1.1.3 主要試劑 磷酸鹽緩沖液PBS購自美國Gibco公司；利多卡因購自美國Sigma公司；順鉑注射液（諾欣）購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司；依托泊苷注射液購自齊魯制藥（海南）有限公司；IHC試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司；突觸素（synaptophysin Syn）、CD56即神經細胞粘附因子（neural cell adhesion molecule NCAM）、腫瘤增殖標志物Ki67的抗體試劑均購自于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SCLC原代PDX動物模型的建立 收集SCLC患者手術標本3例及穿刺標本6例，放在盛有磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）的清潔離心管中，用冰盒運送至動物中心后（組織保存時間30 min-60 min），立即用無菌器械把腫瘤分割成大小約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的組織塊。用70%酒精消毒小鼠右側背部皮膚，在小鼠移植部位用0.5%利多卡因進行局部浸潤麻醉，在小鼠右下肢背部用剪刀剪開長約0.3 cm的小口，把分割的腫瘤組織1塊-2塊送至皮下，按壓約2 min，觀察至小鼠切口粘合，以防腫瘤塊脫出。此為原代PDX動物模型建立，稱為P0代。

1.2.2 SCLC PDX模型的傳代移植 待P0代小鼠皮下瘤長至約1,000 mm3時頸椎脫臼法處死小鼠，鋪無菌巾，用70%酒精消毒小鼠背側皮膚，用無菌器械切開瘤周圍皮膚，剖出腫瘤放進無菌盤中，取部分組織置于4%中性甲醛溶液固定，剩余部分并用無菌器械分割腫瘤至大小約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的組織塊。取5只-10只5周齡B-NSG鼠，按照前述方法移植，此代為第1代PDX動物模型，稱為P1代。每周定期檢測小鼠的體質量及腫瘤的體積，繪制腫瘤生長曲線。待P1代B-NSG鼠皮下瘤長至大小約1,000 mm3時，按照此方法傳代移植，建立第2、3、4代PDX動物模型，稱為P2、P3、P4代。小鼠皮下瘤體積計算方法為：腫瘤體積計算方法：V（cm3）=長（cm）×寬2（cm）/2[18]。

1.2.3 誘導SCLC PDX耐藥模型 待PDX動物模型P1代（每例8只B-NSG鼠）皮下腫瘤體積大小約400 mm3時，腹腔注射化療藥物（EP方案，順鉑8 mg/kg八天一次+依托泊苷5 mg/kg兩天一次），連續(xù)注射8個周期后，挑選皮下腫瘤體積未明顯減小的荷瘤鼠進行傳代移植至P2（各例分別移植到5只BNS-G鼠），待其皮下瘤長至約400 mm3時，繼續(xù)用EP方案腹腔注射藥物8個周期。每一代移植設立對照組，對照組不用藥物干預。

1.2.4 生物學特性觀察 小鼠一般特征觀察每天觀察精神狀態(tài)、活動力、反應、飲食、體質量、毛色、毛順滑度及皮下瘤的生長情況。在接種后1周，每7天用游標卡尺測量皮下瘤長、短徑。大體解剖檢查：頸椎脫臼處死小鼠并解剖，觀察移植瘤形態(tài)、直徑、質地、活動度。

1.2.5 HE染色制備 將所取腫瘤組織用石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟脫水；入蘇木素染液染5 min；水洗返藍；依次入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min后入伊紅染液中染色5 min；無水乙醇脫水、二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.6 免疫組化制備 依次將切片放入二甲苯兩次各20 min、濃度為100%、95%、 80%、75%梯度的酒精各10 min后置于蒸餾水；高溫高壓抗原修復；切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育20 min，將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；滴加一抗（Syn 1:200, CD56 1:200, Ki67 1:500）。切片平放于濕盒內4 °C孵育過夜；玻片置于PBS（pH7.4）中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50 min；玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯色后自來水沖洗切片終止；蘇木素復染3 min，水洗返藍；將切片依次放入70%、80%、90%、95%酒精濃度梯度各5 min；無水乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片。

1.2.7 免疫組化半定量分析方法 陽性細胞判斷標準：Syn、CD56表達陽性為細胞漿著色，Ki67表達陽性為細胞核著色，陽性表達為淺黃色或棕黃色；免疫組化著色基于著色細胞百分比和強度：染色強度為0-3（0=陰性，1=弱陽性，2=中等強陽性，3=強陽性）。半定量計分系統(tǒng)H-score：（0×陰性細胞/100）+（1×弱陽性細胞/100）+（2×中等強陽性細胞/100）+（3×強陽性細胞/100），H-score得分范圍為0-300。計算范圍為光鏡下小細胞肺癌的所有腫瘤細胞。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件包處理，計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SCLC PDX模型的建立及傳代 本研究共收集并移植9例SCLC腫瘤標本，其中3例為手術標本，6例為穿刺標本。如圖1所示，第1號病例即#1，P0代成瘤率為20%（1/5）；P10%（0/5）。第2號病例即#2，P0代成瘤率為37.5%（3/8） ；P1代成瘤率為83.3%（10/12）；P2代成瘤率為100%（10/10）。第3號病例即#3，P0代成瘤率為0%（0/5）。第4號病例即#4，P0代成瘤率為100%（2/2）；P1代成瘤率為0%（0/5）。第5號病例即#5，P0代成瘤率為80%（4/5）；P1代成瘤率為100%（10/10）；P2代成瘤率100（8/8）。第6號病例即#6，P0代成瘤率為100%（4/4）；P1代成瘤率為0%（0/10）。第7號病例即#7，P0代成瘤率為80%（4/5）；P1代成瘤率為80%（10/10）；P2代成瘤率100（7/7）。第8號病例即#8，P0代成瘤率為100%（2/2）。第9號病例即#9，P0代成瘤率為80%（4/5）。

2.2 PDX模型腫瘤生長曲線 移植后每7天測量皮下腫瘤長徑及短徑。各例患者標本所建動物模型P0代皮下瘤體積生長曲線見圖2。結果顯示PDX動物模型皮下瘤在觀察時間內P1代比P0代生長速度更快。如圖3，以第2例標本所建模型為例繪制P0、P1代腫瘤生長曲線（P=0.012，兩者之間有統(tǒng)計學差異）。

2.3 誘導PDX化療耐藥模型 如圖4所示，分別以第2例患者（圖4A）、第5例患者（圖4B）腫瘤標本所建PDX動物模型誘導其耐藥。分別給予P1代及P2代荷瘤B-NSG鼠注射化療藥物后測量腫瘤體積并繪制體積變化曲線。圖4A中示成功移植的P1代8只小鼠，其中3只小鼠腫瘤體積明顯減小，2只小鼠死亡，另3只小鼠腫瘤體積減小后又增長。選擇腫瘤體積最大的B-NSG鼠進行P2代移植，繼續(xù)化療藥物處理后觀察并繪制腫瘤體積變化曲線。圖4B示第5例患者來源腫瘤所建的PDX模型，P1代（n=4）及P2代（n=5）荷瘤B-NSG鼠給予化療藥物后存活率均為100%。結果表明隨著化療藥物誘導的代數增加，PDX表現(xiàn)出更強的化療抵抗性。圖4C簡示PDX耐藥模型的誘導流程。

圖1 小細胞肺癌PDX動物模型成瘤率。PDX：patient-derived xenotransplantation P0：初次移植患者標本至B-NSG鼠皮下的代數。P1：P0代鼠皮下腫瘤移植至B-NSG鼠皮下的代數。P2:P1代鼠皮下腫瘤移植至B-NSG鼠皮下的代數Fig 1 Tumor formation rate of SCLC PDX models.SCLC: small cell lung cancer.

圖2 小細胞肺癌PDX動物模型P0代皮下瘤生長曲線Fig 2 The growth curves of tumor in P0 of SCLC PDX models

圖3 小細胞肺癌PDX動物模型P0、P1代鼠皮下瘤生長曲線（P=0.012）Fig 3 The growth curves of tumor in P0、P1 of SCLC PDX models (P=0.012)

圖4 給予以2號、5號患者所構建PDX動物模型（圖A、圖B）荷瘤B-NSG鼠腹腔注射化療藥物后P1代、P2代B-NSG鼠皮下瘤的體積變化。A圖P1代未化療鼠n=5（虛線），化療鼠n=8（實線）；P2代未化療鼠n=3（虛線），化療鼠n=5（實線）。B圖P1代未化療鼠n=5（虛線），化療鼠n=5（實線）；P2代未化療鼠n=3（虛線），化療鼠n=5（實線）。C圖構建小細肺癌PDX耐藥模型模式圖。Fig 4 Changes of tumor volume in P1, P2 mice treated chemotherapy drugs (#2, #5).A: P1 naive n=5 (dotted), EP n=8 (solid line); P2: naive n=3(dotted), EP n=5 (solid line); B: P1 naive n=5 (dotted), EP n=5 (solid line); P2: naive n=3 (dotted), EP n=5 (solid line).C: workflow of modeling acquired resistance C/E in SCLC.C/E: cisplatin and etoposide.

2.4 SCLC PDX模型腫瘤的實體照片 SCLC PDX動物模型建模成功后進行傳代移植，圖5A示第2例患者來源的PDX模型P0腫瘤，圖5B示其P2代腫瘤。圖5C示P2代PDX模型化療抵抗腫瘤（左）和化療敏感腫瘤（右）。

2.5 SCLC PDX動物模型皮下移植瘤大體形態(tài) 切開皮膚，保持皮下瘤完整，可見腫瘤表面光滑，可見清晰血管紋理，瘤整體呈紅色或白色，瘤表面質韌，切開后，瘤中心呈乳白色，質軟。

2.6 HE染色比較PDX腫瘤組織與患者腫瘤組織的病理形態(tài) 光鏡可見可瘤細胞胞漿少，核大、深染，輕到中度異形，核仁不明顯，呈巢狀分布。PDX腫瘤組織與SCLC患者來源組織病理形態(tài)一致。以第2例患者為例見圖6。

2.7 免疫組化比較PDX腫瘤組織與患者腫瘤組織的SCLC標記物表達 觀察SCLC腫瘤標志物突觸素（synaptophysin,Syn）、CD56及腫瘤增殖標志物Ki67在患者腫瘤組織及移植瘤組織的表達結果，可見腫瘤組織及各代PDX模型均陽性表達。如圖7所示以第2號病例患者腫瘤標本及移植瘤組織免疫組化圖及H-score評分（每例標本做5張切片）。

圖5 #2小細胞肺癌人源性異種移植長出腫瘤的小鼠及皮下瘤摘除實體照片。A：P0代荷瘤B-NSG鼠（n=3）；B：P2代荷瘤B-NSG鼠（n=10）；C：給予化療藥物后皮下瘤摘除照片（n=3）。Fig 5 Images of SCLC PDX model and subcutaneous tumors of model #2.A:P0 tumor-bearing mouse (n=3); B: P2 tumor-bearing mouse (n=10); C: Picture of subcutaneous tumor after chemotherapy drug administration (n=3).

圖6 #2患者標本組織及小鼠皮下瘤組織結構（HE, ×400）。A：小細胞肺癌患者腫瘤組織；B：P0小細胞肺癌PDX動物腫瘤組織；C：P2代小細胞肺癌PDX動物腫瘤組織。可見瘤細胞胞漿少，核大、深染，輕到中度異形，核仁不明顯，呈巢狀分布。Fig 6 The tissue structure of patient sample tissues and PDX model of model 2 (HE, ×400).A: Tumor tissue of small cell lung cancer patient; B: The tumor tissue in P0 of SCLC PDX model; C: The tumor tissue in P2 of SCLC PDX model.It can be seen that tumor cell cytoplasm is small, the nucleus is large, deeply infected, and light to moderate heteromorphism, the nucleoli are not obvious, and nest-shaped.

3 討論

目前常用于研究腫瘤的動物模型有細胞源性異種移植（cell line-derived xenograft, CDX）模型和人源腫瘤異種移植（patient-derived xenograft, PDX）模型。CDX動物模型即把人來源的腫瘤細胞株注射到免疫缺陷小鼠皮下，用于評估化療藥物的療效或進行腫瘤相關分子機制的研究。此種方法建立動物模型快捷，成瘤時間短，成瘤率高，在評估耐藥機制方面有重大意義。但是CDX動物模型在臨床結果預測方面具有局限性[19]。既往研究表明細胞培養(yǎng)傳代時間越長，變異越大，和親代腫瘤差異越大。Knudsen等[20]構建了54例胰腺癌PDX動物模型和56例CDX動物模型，發(fā)現(xiàn)CDX動物模型的腫瘤在建立和傳代過程中會發(fā)生一定程度的基因突變。而在PDX動物模型的腫瘤基因高度保守，與親代腫瘤相比基因遺傳具有一致性，并可傳至至少40代以上，基質細胞穩(wěn)定性可保持3代以上。

圖7 #2患者標本組織及PDX動物模型皮下瘤組織Syn、CD56、Ki67表達（×400）。#2患者腫瘤組織及PDX動物模型P0、P2代PDX腫瘤標志物CD56和Syn抗體以及腫瘤增殖標志物ki67表達陽性，每個樣本5張組化片計分，H-score評分。P＞0.05，獨立樣本T檢驗，可見無明顯差異。Fig 7 Expression of Syn, CD56 and Ki67 in SCLC patient's tissues and the PDX tumor tissues of model #2 (×400).Expression of Syn, CD56 and Ki67 in SCLC patient's tissues and the PDX tumor tissues in P0, P2 mice of of model 2 were positive, H-score.n=5 per group.P＞0.05: Independent samples t-test; non-significant.

PDX動物模型最早是Fiebig等[21]建成，Mattern等[22]應用于化療藥物的研究，發(fā)現(xiàn)PDX動物對生物堿類藥物和抗代謝藥物的反應和人相似。PDX動物模型避免了對優(yōu)勢克隆、表觀遺傳及基因修飾的自然選擇，并保留親代細胞的物種專一性及腫瘤細胞和基質細胞間的作用關系。PDX動物模型是直接從患者腫瘤標本接種到免疫缺陷鼠身上，未經過體外處理，避免了體外環(huán)境的選擇，和CDX動物模型相比，與患者腫瘤特征更保持一致性，因此對藥物療效評估更接近臨床效果[23]。Swick等[24]成功構建了27例頭頸鱗癌的PDX模型，發(fā)現(xiàn)兩者成瘤的組織學特性并無明顯差別。Anderson等[25]用穿刺組織成功構建了SCLC PDX動物模型，并進行了HE及免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)在組織學及化療敏感性方面與親代腫瘤相似。在本實驗所建立的PDX動物模型，患者腫瘤組織和B-NSG鼠皮下移植瘤組織HE染色結果示兩者無明顯差異，可見瘤細胞胞漿少，核大、深染，輕到中度異形，核仁不明顯，呈巢狀分布，符合SCLC病理特點。SCLC又稱小細胞神經內分泌癌，突觸素（synaptophysin Syn）是位于突觸前囊泡內的糖蛋白，存在于中樞和外周神經系統(tǒng)所有神經末梢，是目前診斷神經內分泌瘤的特異性標志物[26]。CD56即神經細胞粘附因子( neural cell adhesion molecule,NCAM)，它是一種跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員，在神經、神經外胚層、神經內分泌組織及其來源的腫瘤中可見特異性表達，在SCLC中的表達明顯高于非小細胞肺癌[27]，因此CD56可作為SCLC腫瘤標志物之一。本研究中比較了Syn和CD56在SCLC患者腫瘤組織及PDX動物模型移植瘤組織中的免疫組化結果，結果可見均呈陽性，也觀察了腫瘤增殖標志物Ki67在患者組織及移植瘤組織中的表達，可見呈陽性，說明PDX動物模型在免疫組化學方面保持穩(wěn)定性，構建模型成功。

SCLC治療早期對放療及化療很敏感，但是很容易出現(xiàn)耐藥，因此，SCLC耐藥是臨床治療的巨大瓶頸。本研究中按EP方案（順鉑8 mg/kg八天一次+依托泊苷5 mg/kg兩天一次，腹腔注射）給予荷瘤B-NSG鼠化療藥物，注射8個周期后，對瘤體積最大的B-NSG鼠傳代移植，繼續(xù)按此方法注射化療藥物8個周期，可見皮下瘤體積增大，說明對化療藥物不敏感，出現(xiàn)耐藥，構建SCLC耐藥模型成功。把耐藥組腫瘤及敏感組腫瘤分別移植到5只B-NSGTM小鼠，耐藥組皮下成瘤時間為1個月，而敏感組為3個月，耐藥組成瘤時間及皮下瘤生長速度均快于敏感組，表現(xiàn)出較高的侵襲性。成功構建SCLC耐藥模型，為研究SCLC耐藥機制及治療方法提供良好平臺。

Kubota等[28]在20世紀八九十年代最初報道了SCLC PDX動物模型，他們選擇的是BALB/c免疫缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)盡管在宿主小鼠身上腫瘤細胞的動力學有些改變，但小細胞肺癌細胞的特性及總體參數仍具有穩(wěn)定性。在本實驗中發(fā)現(xiàn)移植小鼠的種類對小鼠成瘤率及生長情況有很大的影響，目前移植小鼠的種類有（1）裸鼠：不含T淋巴細胞，可能含有B淋巴細胞、組織粒細胞，含有自然殺傷細胞、樹突狀細胞的免疫缺陷小鼠。（2）SCID鼠（Severe combined immunodeficient mice）：不含T淋巴細胞及B淋巴細胞，含有自然殺傷細胞，組織粒細胞及樹突狀細胞。（3）NOD-SCID鼠：不含T淋巴細胞及B淋巴細胞，可能含有自然殺傷細胞，組織粒細胞及樹突狀細胞。與SCID鼠比較，NK細胞活性較低，免疫缺陷度較高。（4）B-NSGTM鼠（NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Sug/Jic or NOD/Shi-scid IL-2Rγnull）：NOD-SCID遺傳背景，敲除IL-2rg，缺乏成熟的T細胞、B細胞、NK細胞，免疫缺陷度更高。在本實驗中選擇B-NSGTM重度免疫缺陷小鼠構建SCLC PDX動物模型，相較BALB/c鼠，B-NSGTM重度免疫缺陷小鼠成瘤時間為3個月-4個月，腫瘤生長速度快。另在移植過程中發(fā)現(xiàn)，移植部位對成瘤也有影響。我們發(fā)現(xiàn)移植在靠近右下肢部位更容易成瘤，考慮此部位比背部血液供應豐富，腫瘤組織更容易生長。但此部位會受小鼠活動影響，致使剛移植的腫瘤組織脫出，成瘤后也影響小鼠活動。目前我們選擇的移植部位是右側背部，受小鼠活動影響較小，即小鼠活動不會造成腫瘤組織脫出，腫瘤長大后不會影響小鼠活動。

SCLC為高度侵襲性腫瘤，大部分患者確診已處于晚期，失去手術治療時機，構建模型主要通過穿刺收集少許組織標本。標本量少增加了PDX動物模型構建的難度，也極大限制了對SCLC發(fā)病和耐藥機制的研究，本研究中動物模型成瘤率為33%，構建SCLC PDX動物模型及耐藥模型具有重要意義，為SCLC的藥物研究評估及篩選、SCLC患者的個體化治療以及SCLC耐藥機制、研究靶向藥物提供良好的模型。