ABT-737逆轉(zhuǎn)EGFR T790M突變肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKIs耐藥的機(jī)制研究

應(yīng)希旺 李亞清 冷報(bào)浪

[摘要] 目的 通過(guò)細(xì)胞和在體研究探討ABT-737聯(lián)合吉非替尼對(duì)EGFR T790M突變肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKIs耐藥的逆轉(zhuǎn)機(jī)制。 方法 利用MTT和FCM 法檢測(cè)ABT-737聯(lián)合吉非替尼對(duì)RPC-9細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，以RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bim、Bak、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。以皮下異位移植法建立EGFR T790M突變肺腺癌裸鼠模型，對(duì)各組瘤體組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查、基因測(cè)序法檢測(cè)、Real-time PCR和免疫組織化學(xué)法分析Bim、Bak、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 ABT-737聯(lián)合吉非替尼對(duì)RPC-9細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用和凋亡作用，且在ABT-737濃度4 μmol/L范圍內(nèi)呈濃度依賴性，最大抑制率為（54.113±2.986）%，最大凋亡率為（55.042±3.151）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平隨著ABT-737濃度的升高而增加（P<0.05）。各組瘤體組織病理均為腺癌;ABT-737聯(lián)合吉非替尼灌胃組裸鼠瘤體體積較其他組?。≒<0.05），Bim、Bak、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平較其他組顯著增高（P<0.05）。 結(jié)論 ABT-737能增強(qiáng)吉非替尼促細(xì)胞凋亡作用，使耐藥細(xì)胞重新發(fā)生凋亡。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌;ABT-737;T790M突變;吉非替尼耐藥逆轉(zhuǎn);裸鼠模型

[中圖分類號(hào)] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）18-0009-06

[Abstract] Objective To investigate the reversal mechanism of ABT-737 combined with gefitinib in reversing EGFR-TKIs resistance of EGFR T790M mutant lung adenocarcinoma cells by cell and in vivo studies. Methods The effect of ABT-737 combined with gefitinib on proliferation and apoptosis of RPC-9 cells were detected by MTT and FCM. The expression levels of Bim， Bak and Caspase-3 mRNA were detected by RT-PCR. The nude mouse model of EGFR T790M mutant lung adenocarcinoma was established by subcutaneous ectopic transplantation. The expression levels of Bim， Bak and Caspase- 3 mRNA and protein were analyzed by histopathological examination， gene sequencing detection， Real-time PCR and immunohistochemical analysis. Results ABT-737 combined with gefitinib had growth inhibition and apoptosis effects on RPC-9 cells， and was concentration-dependent in the range of 4 μmol/L of ABT-737. The maximum inhibition rate was（54.113±2.986）%. The maximum apoptotic rate was（55.042±3.151）%， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The expression levels of Bim， Bak and Caspase-3 mRNA increased with the increase of ABT-737 concentration（P<0.05）. The histopathology of each group was adenocarcinoma. The volume of tumor in nude mice of ABT-737 combined with gefitinib intragastrical administration group was smaller than that of other groups（P<0.05）， and the expression levels of Bim， Bak and Caspase-3 mRNA and protein in this group were significantly higher than those of the other groups（P<0.05）. Conclusion ABT-737 can enhance the apoptosis of gefitinib and make the resistant cells re-apoptosis.

[Key words] Lung adenocarcinoma; ABT-737; T790M mutation; Gefitinib resistance reversal; Nude mouse model

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中約80%是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。癌癥早期患者主要通過(guò)手術(shù)治療，但是仍然存在很高的復(fù)發(fā)率[3]。靶向藥物的出現(xiàn)明顯延長(zhǎng)晚期NSCLC患者的生存時(shí)間[4]，但又面臨廣泛的耐藥問(wèn)題。EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factorreceptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKIs）可阻斷EGFR分子內(nèi)酪氨酸的自磷酸化及酪氨酸激酶活化，抑制EGFR激活，因此抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[4，5]。EGFR-TKIs耐藥機(jī)制主要有T790M基因突變、Bim多態(tài)性缺失、C-Met基因擴(kuò)增等，而EGFR基因20外顯子T790M 的二次突變，約占50%[6]。吉非替尼是第一代EGFR-TKIs，取得良好的治療效果的同時(shí)也面臨嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題。Bim屬于Bcl-2家族促生存成員的死亡配體，主要通過(guò)線粒體途徑激活Bax/Bak誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。有報(bào)道顯示，EGFR突變NSCLC患者在吉非替尼等靶向藥物治療時(shí)，Bim表達(dá)缺失與耐藥性相關(guān)[8-10]。ABT-737是Bim高效模擬物，本研究將通過(guò)細(xì)胞和在體研究ABT-737和EGFR T790M突變?cè)谌朔蜗侔〦GFR-TKI耐藥機(jī)制中的作用，為解決肺腺癌EGFR-TKI耐藥問(wèn)題提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 ABT-737逆轉(zhuǎn)EGFR T790M突變所致EGFR-TKIs耐藥的細(xì)胞研究

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源? 對(duì)吉非替尼敏感的人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9從美國(guó)ATCC公司購(gòu)買(mǎi)獲得。參考Ogino A等[11]報(bào)道方法并改進(jìn)，對(duì)PC-9細(xì)胞應(yīng)用大劑量吉非替尼沖擊結(jié)合逐步遞增濃度體外誘導(dǎo)法建立對(duì)吉非替尼耐藥的EGFR T790M突變細(xì)胞株RPC-9（實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2016年2月20日～12月25日）。

1.1.2 MTT法? 將RPC-9細(xì)胞加入96孔板中，置于培養(yǎng)箱24 h后換液，Ⅰ組加入相應(yīng)濃度的ABT-737，Ⅱ組加入ABT-737和吉非替尼，ABT-737濃度（0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L）依次遞增，吉非替尼終濃度為10 μmol/L;每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)終止前4 h加入20 mL MTT液，離心倒掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO終止反應(yīng)，置于37℃振蕩1～5 min，鏡下觀察結(jié)晶全部溶解。在自動(dòng)酶標(biāo)儀上以測(cè)定波長(zhǎng)570 nm測(cè)定各孔吸光度值（OD值）。取各孔吸光度平均值，計(jì)算兩組細(xì)胞抑制率。結(jié)果來(lái)自于3 次實(shí)驗(yàn)。公式：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-本底OD值）/（對(duì)照組OD值-本底OD值）×100%。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-細(xì)胞存活率。

1.1.3 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡? 將RPC-9細(xì)胞加入12孔板中，置于培養(yǎng)箱24 h后換液，實(shí)驗(yàn)組加入ABT-737和吉非替尼，ABT-737濃度（0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L）依次遞增，而吉非替尼終濃度始終為10 μmol/L;對(duì)照組加入相應(yīng)濃度的ABT-737 24 h后，收集用藥物處理過(guò)的細(xì)胞，懸浮細(xì)胞，收集（1～5）×105細(xì)胞，加入500 μL的Binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL 7-AAD染液，用流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson 公司）檢測(cè)。

1.1.4 RNA提取和Real-time RT-PCR? RT-PCR檢測(cè)Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表達(dá)：將RPC-9細(xì)胞加入12孔板中，置于培養(yǎng)箱24 h后換液，實(shí)驗(yàn)組加入ABT-737和吉非替尼，ABT-737濃度（0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L）依次遞增，而吉非替尼終濃度始終為10 μmol/L;對(duì)照組加入相應(yīng)濃度的ABT-737。24 h后，收集用藥物處理過(guò)的細(xì)胞，以TRIzol提取總RNA;按Takala試劑盒說(shuō)明合成cDNA：按照SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)Bim、Bak、Caspase-3 mRNA表達(dá)差異。見(jiàn)表1。

1.2 ABT-737逆轉(zhuǎn)EGFR T790M突變所致EGFR-TKIs耐藥的在體研究

1.2.1 構(gòu)建RPC-9細(xì)胞裸鼠移植瘤模型? 將RPC-9細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×107個(gè)/mL;SPF（specific pathogen-free）級(jí)BALB/C-nu裸小鼠28只由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心在SPF級(jí)屏障系統(tǒng)中分籠飼養(yǎng)。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)時(shí)間為 2017年3月2日～3月30日）。在SPF級(jí)屏障系統(tǒng)中用75%酒精消毒裸鼠右肩背部皮膚，皮下注射 0.3 mL RPC-9細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞數(shù)為 3×106個(gè)/只。移植瘤長(zhǎng)徑及短徑以公式（V=πab2/6）計(jì)算腫瘤體積。接種后第7天裸鼠背部移植瘤長(zhǎng)至約100 mm3，隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)。將裸鼠隨機(jī)分為Ⅰ空白對(duì)照組、Ⅱ吉非替尼組、ⅢABT-737組、ⅣABT-737+吉非替尼組，每組7只。每隔2日灌胃給藥1次，共給藥8次。

Ⅰ空白對(duì)照組：每隔2日灌胃生理鹽水300 μL/只。Ⅱ吉非替尼組：每隔2日灌胃給藥300 μL/只，吉非替尼22.2 mg/kg。ⅢABT-737組：每隔2日灌胃給藥300 μL/只，ABT-737 22.2 mg/kg。ⅣABT-737+吉非替尼組：每隔2日灌胃給藥300 μL/只，ABT-737+吉非替尼分別22.2 mg/kg。共給藥 8次。

1.2.2? 測(cè)定裸鼠移植瘤大小? 觀察裸鼠一般情況。每次灌胃前測(cè)量裸鼠腫瘤長(zhǎng)短徑。于末次灌胃給藥后次日，脫頸處死裸鼠，剝離移植瘤，并計(jì)算移植瘤體積。 1.2.3 RT-PCR法? 檢測(cè)移植瘤組織中 Bim、Bak、Caspase-3表達(dá)（方法同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）。

1.2.4 組織病理學(xué)檢測(cè)? 將裸鼠瘤體組織石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，行蘇木素-伊紅（HE）染色：烤片，二甲苯透明、經(jīng)梯度乙醇脫水置換后，HE染色，二甲苯透明后封片。圖文分析儀分析每例切片。

1.2.5 免疫組化法? 裸鼠瘤體組織石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，3% H2O2室溫封閉，高壓抗原修復(fù)，山羊血清封閉液封閉，稀釋的Bim、Bak及Caspase-3抗體4℃過(guò)夜，24 h后辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG 聚合物孵育30 min，后DAB染色，蘇木素復(fù)染，鏡像觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABT-737逆轉(zhuǎn)EGFR T790M突變所致EGFR-TKIs耐藥的細(xì)胞研究

2.1.1 RPC-9細(xì)胞EGFR基因檢測(cè)? RPC-9細(xì)胞EGFR基因E20發(fā)生突變，核苷酸變化c.2369C>CT;氨基酸變化790T>T/M（圖1）。

A.EGFR-E19參考峰;B.RPC-9細(xì)胞EGFR-E19測(cè)序峰;C.EGFR-E20參考峰;D.RPC-9細(xì)胞EGFR-E20測(cè)序峰。RPC-9細(xì)胞EGFR-E20核苷酸變化c.2369C>CT;氨基酸變化790T>T/M

2.1.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率? Ⅰ組各種濃度的ABT-737和Ⅱ組ABT-737聯(lián)合吉非替尼組（10 μmol/L）均能抑制RPC-9細(xì)胞增殖，24 h細(xì)胞增殖抑制率ABT-737聯(lián)合吉非替尼組明顯高于單一ABT-737用藥組（表2），在4 μmol/L范圍內(nèi)均呈濃度依賴性，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L濃度組內(nèi)及組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著濃度的繼續(xù)升高，4 μmol/L、8 μmol/L及16 μmol/L，ABT-737聯(lián)合吉非替尼（4 μmol/L）對(duì)RPC-9細(xì)胞的增殖抑制率無(wú)明顯繼續(xù)提高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2、圖2。

2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡? ABT-737聯(lián)合吉非替尼（10 μmol/L）作用RPC-9細(xì)胞24 h后，不同濃度的ABT-737各組細(xì)胞均發(fā)生不同程度的凋亡（表3），凋亡率在4 μmol/L內(nèi)隨ABT-737濃度升高而升高，呈劑量依賴性。0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L ABT-737聯(lián)合吉非替尼（10 μmol/L）藥物濃度比較細(xì)胞凋亡率上升明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨著藥物濃度提高至8 μmol/L及16 μmol/L時(shí)，細(xì)胞已大部分發(fā)生凋亡及壞死，凋亡率較4 μmol/L濃度組無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

2.1.4 RT-PCR檢測(cè)Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表達(dá)? 0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L ABT-737聯(lián)合吉非替尼（10 μmol/L）藥物濃度兩兩比較Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表達(dá)上升明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨著藥物濃度提高至8 μmol/L及16 μmol/L時(shí)，Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4、圖4。

2.2 ABT-737逆轉(zhuǎn)EGFR T790M突變所致EGFR-TKIs耐藥的在體研究

2.2.1 裸鼠移植瘤大小測(cè)定? 接種12 d后Ⅳ組裸鼠移植瘤體積明顯低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ⅱ、Ⅲ組較Ⅰ組裸鼠移植瘤體積稍小，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5，圖5、6。

Ⅳ組裸鼠移植瘤體積明顯小于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組裸鼠移植瘤體積在接種后12 d后生長(zhǎng)速度加快，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組裸鼠移植瘤體積組間差異不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2.2 檢測(cè)裸鼠移植瘤組織Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表達(dá)? Ⅳ組裸鼠移植瘤組織Bim、Bak及Caspase-3 mRNA表達(dá)上升明顯，與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅱ、Ⅲ組較Ⅰ組稍增高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表6、圖7。

2.2.3 組織病理學(xué)檢測(cè)? 各組裸鼠移植瘤組織病理均為低分化腺癌，且腫瘤組織包膜完整，腫瘤細(xì)胞呈彌散片狀分布、排列緊密，呈腺樣或條索狀排列，見(jiàn)局灶性壞死。腫瘤細(xì)胞核大深染，呈圓形，核仁明顯，見(jiàn)核分裂象，胞質(zhì)豐富（封三圖2）。

2.2.4 免疫組化法檢測(cè)Bim、Bak及Caspase-3蛋白表達(dá)? ?細(xì)胞漿Bim、Bak及Caspase-3蛋白著黃棕色，為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞漿未著色為陰性。采用半定量方法測(cè)定Bim、Caspase-3蛋白表達(dá)。選取5個(gè)高倍鏡視野（200倍）計(jì)數(shù)瘤體組織中Bim、Bak及Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，分為以下4個(gè)等級(jí)：0級(jí)≤5%，5%<1級(jí)≤25%，26%<2級(jí)≤60%，3級(jí)>60%。陽(yáng)性強(qiáng)度淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩個(gè)相乘，0～3分為陰性（-），4～l2分為陽(yáng)性（+）。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為陽(yáng)性，Ⅰ組為陰性（封三圖3、4、5）。

3 討論

Bim在人體多種組織中均有不同程度的表達(dá)，在預(yù)防自身免疫、維持造血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及調(diào)控腫瘤的發(fā)生中均起著重要作用[12-14]。人們研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤細(xì)胞中，Bim表達(dá)的下降會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡作用，從而加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-17]。許多研究表明Bim在肺癌靶向治療效果顯著主要是在腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。EGFR TKIs的繼發(fā)性耐藥是分子靶向治療所面臨的最嚴(yán)重問(wèn)題。Ng等[18]通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chainreaction，PCR）證實(shí)在EGFR-TKIs耐藥的EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌HCC2279細(xì)胞中存在Bim基因的缺失多態(tài)性。學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)在吉非替尼等靶向藥物治療敏感的EGFR突變NSCLC患者中，Bim表達(dá)明顯上調(diào)，而對(duì)治療不敏感者Bim表達(dá)無(wú)上調(diào)，Bim基因敲除后阻斷吉非替尼對(duì)突變細(xì)胞的凋亡作用[19，20]。我們?cè)谇捌谠囼?yàn)中成功培養(yǎng)了EGFR T790M突變致吉非替尼耐藥肺腺癌細(xì)胞RPC-9，基因測(cè)序法檢測(cè)顯示EGFR基因E20發(fā)生突變，E20核苷酸變化為：c.2369C>CT;氨基酸變化為：790T>T/M。本研究中，ABT-737單獨(dú)用藥能夠?qū)PC-9細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制作用[最大抑制率（11.036±0.992）%]，而且呈濃度依賴性，但是作用效果有限。當(dāng)ABT-737聯(lián)合吉非替尼（10 μmol/L）作用細(xì)胞時(shí)，對(duì)RPC-9細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用[最大抑制率（57.594±3.271）%]明顯強(qiáng)于ABT-737單獨(dú)用藥。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了ABT-737聯(lián)合吉非替尼（10 μmol/L）對(duì)RPC-9細(xì)胞的促凋亡作用，發(fā)現(xiàn)不同濃度的ABT-737聯(lián)合吉非替尼對(duì)RPC-9細(xì)胞均有作用，在4 μmol/L范圍時(shí)，呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨著藥物濃度提高至8 μmol/L及16 μmol/L時(shí)，細(xì)胞已大部分發(fā)生凋亡及壞死，凋亡率較4 μmol/L濃度組無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本文還通過(guò)RT-PCR檢測(cè)RPC-9細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ABT-737聯(lián)合吉非替尼組較ABT-737單獨(dú)用藥組Bim、Bak、Caspase-3 mRNA表達(dá)均顯著升高。

本研究通過(guò)皮下移植法成功建立EGFR T790M突變肺腺癌裸鼠模型，為進(jìn)一步研究肺腺癌EGFR TKIs的繼發(fā)性耐藥機(jī)制提供工具。本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吉非替尼灌胃組（Ⅱ組）、ABT-737灌胃組（Ⅲ組）較空白對(duì)照組（Ⅰ組）裸鼠瘤體體積稍小，裸鼠食欲、活動(dòng)能力也較強(qiáng);而ABT-737聯(lián)合吉非替尼灌胃組（Ⅳ組）裸鼠食欲、活動(dòng)能力較其他各組明顯更強(qiáng)，瘤體體積也較其他組小，其中3只裸鼠瘤體體積較自身灌胃前稍有變小，其余4只裸鼠瘤體體積生長(zhǎng)也較其他組裸鼠瘤體明顯變小。我們通過(guò)裸鼠瘤體組織RT-PCR和免疫組化發(fā)現(xiàn)，Ⅳ組裸鼠瘤體組織中Bim、Bak、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)最高，Ⅱ、Ⅲ組次之（差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05），Ⅰ組最低，其結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，我們認(rèn)為，可能是由于ABT-737使RPC-9細(xì)胞內(nèi)凋亡通路中Bim的表達(dá)顯著升高，促進(jìn)EGFR-MAPK-ERK信號(hào)途徑的抑制，增加了吉非替尼的促細(xì)胞凋亡的作用，引起促凋亡蛋白Bak的釋放，Caspase系統(tǒng)的激活，最終使原先發(fā)生EGFR-TKIs耐藥的RPC-9細(xì)胞重新死亡，從而逆轉(zhuǎn)了EGFR T790M突變所致的EGFR-TKIs的耐藥作用。

有研究發(fā)現(xiàn)[21]BH3模擬物聯(lián)合二代TKIs在增強(qiáng)治療效果的同時(shí)可減少耐藥性和不良反應(yīng)，這提示BH3模擬物聯(lián)合TKIs有望成為一種新型的治療方法。NSCLC將來(lái)的治療，我們可以將Bim作為臨床治療NSCLC的分子靶點(diǎn)或聯(lián)合其他藥物治療吉非替尼耐藥的新思路。采用不同途徑、多個(gè)靶點(diǎn)的聯(lián)合治療，最大發(fā)揮藥物療效同時(shí)減少耐藥的發(fā)生。

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（收稿日期：2019-03-12）