益腎化濁方對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬神經(jīng)元及相關(guān)炎癥因子的影響

孫偉明 崔遠(yuǎn)武 王凱 郭威 程汝珍 張玉蓮

摘要：目的? 觀察益腎化濁方對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法? 將7月齡SAMP8小鼠隨機(jī)分為SAMP8組和益腎化濁方低、中、高劑量組，選擇SAMR1小鼠作為對(duì)照;益腎化濁方低、中、高劑量組分別給予3.12、6.24、12.48 g/kg益腎化濁方藥液灌胃，SAMR1組和SAMP8組給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)4周;采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，尼氏染色觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化，免疫組化檢測(cè)小鼠海馬CA1區(qū)TNF-α和NF-κB的表達(dá)。結(jié)果? 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠平均游泳速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與SAMR1組比較，SAMP8組小鼠逃避潛伏時(shí)間顯著增加、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P<0.05）;與SAMP8組比較，益腎化濁方中劑量組小鼠逃避潛伏時(shí)間顯著減少、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.05）。尼氏染色結(jié)果顯示，與SAMR1組比較，SAMP8組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P<0.05）;與SAMP8組比較，益腎化濁方中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P<0.05）。免疫組化染色結(jié)果顯示，與SAMR1組比較，SAMP8組小鼠海馬CA1區(qū)TNF-α和NF-κB表達(dá)顯著增加（P<0.05）;與SAMP8組比較，益腎化濁方中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)TNF-α和NF-κB表達(dá)顯著減少（P<0.05）。結(jié)論? 中劑量益腎化濁方可有效改善7月齡SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，該作用機(jī)制可能與其減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失、抑制炎癥因子TNF-α、NF-κB的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：益腎化濁方;阿爾茨海默病;學(xué)習(xí)記憶;海馬神經(jīng)元;腫瘤壞死因子-α;核因子-κB;小鼠

中圖分類號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）07-0060-06

Abstract： Objective To investigate the effects of Yishen Huazhuo Decoction on learning and memory ability， hippocampus neurons， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and nuclear factor-κB （NF-κB） of senescence accelerated mouse prone 8 （SAMP8） and its possible mechanism. Methods 7-month old SAMP8 mice were randomly divided into SAMP8 group， Yishen Huazhuo Decoction low-， medium-， and high-dosage groups. Senescence accelerated mouse resistant 1 （SAMR1） were selected as control group. Mice in Yishen Huazhuo Decoction low-， medium-， and high-dosage groups received 3.12， 6.24， 12.48 g/kg respectively for gavage. The SAMR1 group and the SAMP8 group were given an equal volume of distilled water once a day for 4 weeks. Morris water maze test was used to evaluate the learning and memory ability of mice. Nissl staining was used to observe the changes of neurons in hippocampal CA1 region of mice， and the expressions of TNF-α and NF-κB in hippocampus of mice was detected by immunohistochemistry. Results The results of water maze test showed that there was no significant difference in the average swimming speed among the groups （P>0.05）. Compared with the SAMR1 group， the escape latency of theSAMP8 group significantly increased， and the number of crossing platforms was significantly reduced （P<0.05）. Compared with the SAMP8 group， the escape latency of the mice in the Yishen Huazhuo Decoction medium-dosage group was significantly reduced， and the number of crossing platforms significantly increased （P<0.05）. Nissl staining showed that the number of neurons in hippocampal CA1 region of SAMP8 group significantly decreased compared with SAMR1 group （P<0.05）. Compared with the SAMP8 group， the number of neurons in the hippocampal CA1 region of the Yishen Huazhuo Decoction medium-dosage group significantly increased （P<0.05）. Immunohistochemical staining showed that compared with SAMR1 group， the expressions of TNF-α and NF-κB in hippocampal CA1 region of SAMP8 group significantly increased （P<0.05）. Compared with the SAMP8 group， the expression of TNF-α and NF-κB in the hippocampal CA1 region of Yishen Huazhuo Decoction medium-dosage group significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Medium-dose Yishen Huazhuo Decoction can effectively improve the learning and memory ability of 7-month old SAMP8 mice， which may be related to the reduction of neuron loss in hippocampal CA1 region and the inhibition of inflammatory factors TNF-α and NF-κB.

Keywords： Yishen Huazhuo Decoction; Alzheimer disease; learning and memory; hippocampal neurons; TNF-α; NF-κB; mice

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）臨床上以進(jìn)行性認(rèn)知功能下降為主要特點(diǎn)，大多發(fā)病年齡大于65歲，占癡呆總數(shù)的60%～80%[1]。我國(guó)AD患者超過(guò)1000萬(wàn)，是歐洲國(guó)家癡呆人數(shù)的總和[2]。AD病理上主要表現(xiàn)為海馬區(qū)萎縮、神經(jīng)元丟失、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和以β-淀粉樣蛋白（amyloid β protein，Aβ）為核心的神經(jīng)炎性斑[3]，其中神經(jīng)元丟失與認(rèn)知功能下降直接相關(guān)，是腦萎縮的病理基礎(chǔ)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ會(huì)導(dǎo)致中樞微環(huán)境中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平明顯上升[5]，二者均可激活神經(jīng)元核因子-κB（NF-κB），活化的NF-κB入核后可進(jìn)一步增加Aβ的生成[6]。SAMP8小鼠為AD常用動(dòng)物模型，與其他模型比較，更側(cè)重于衰老過(guò)程[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方可改善輕度AD患者臨床癥狀，提高認(rèn)知和日常生活能力，保護(hù)AD模型大鼠神經(jīng)元與突觸超微結(jié)構(gòu)，提高記憶相關(guān)蛋白的表達(dá)[9-10]。在此基礎(chǔ)上，本研究選取7月齡SAMP8小鼠作為研究對(duì)象，觀察益腎化濁方對(duì)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的作用及相關(guān)炎癥因子TNF-α、NF-κB表達(dá)的影響。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動(dòng)物

7月齡雄性健康SPF級(jí)SAMP8小鼠40只，體質(zhì)量25～30 g，7月齡雄性SPF級(jí)SAMR1小鼠10只，體質(zhì)量25～30 g，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（津）2015-0003。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h光照，溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

益腎化濁方（淫羊藿10 g，女貞子10 g，制首烏6 g，肉蓯蓉10 g，石菖蒲6 g，川芎6 g），參照文獻(xiàn)計(jì)算臨床等效劑量小鼠給藥為6.24 g/kg[11]，設(shè)為中劑量，低、高劑量給藥劑量分別為3.12、12.48 g/kg，飲片由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供并制備，水煎3次，每次30 min，混合后濃縮至1.248 g/mL（益腎化濁方高劑量藥物濃度），4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 主要試劑與儀器

NF-κB單克隆抗體（Abcam公司，ab32360），TNF-α抗體（Abcam公司，ab6671），組化試劑盒（Servicebio公司，GDP1001）。Morris水迷宮和數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，ZS-001），脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，JJ-12J），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，RM2016），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，NIKON ECLIPSE CI），成像系統(tǒng)（日本尼康，NIKON DS-U3）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 分組和給藥

40只SAMP8小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為SAMP8組和益腎化濁方低、中、高劑量組。益腎化濁方高劑量組給予1.248 g/mL藥液灌胃，采用蒸餾水將高劑量藥液稀釋至0.312、0.624 g/mL，分別作為低、中劑量組干預(yù)用藥;SAMP8組和SAMR1組給予蒸餾水干預(yù)。給藥體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)4周。

2.2? Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮直徑120 cm×高50 cm×水深30 cm，水溫控制在20～22 ℃，平臺(tái)直徑10 cm，位于第一象限水面下1 cm。加入黑色食用色素，使水變成不透明的黑色。

2.2.1? 定向航行實(shí)驗(yàn)

參考Vorhees等[12]實(shí)驗(yàn)方案：每日每只小鼠連續(xù)檢測(cè)4次，持續(xù)5 d。小鼠入水后，攝像機(jī)同時(shí)開(kāi)始記錄。若65 s內(nèi)小鼠找到平臺(tái)，記錄實(shí)際所用時(shí)間，保持小鼠在平臺(tái)處停留15 s;若65 s內(nèi)無(wú)法找到平臺(tái)，記錄逃避潛伏時(shí)間為65 s，引導(dǎo)其找到平臺(tái)，停留15 s。

2.2.2? 空間探索實(shí)驗(yàn)

定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日進(jìn)行檢測(cè)，每只小鼠檢測(cè)1次。將平臺(tái)撤除，從第三象限桶壁中點(diǎn)投入小鼠，記錄65 s內(nèi)在平臺(tái)區(qū)域的穿越次數(shù)。

2.3? 尼氏染色

水迷宮檢測(cè)結(jié)束后，小鼠腹腔注射5%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，開(kāi)放胸腔，剪開(kāi)右心耳，將灌注針由心尖處刺入，到達(dá)主動(dòng)脈，先后灌注0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛;取全腦于4%多聚甲醛固定24 h，選取視交叉至丘腦后側(cè)區(qū)域，冠狀切塊得到標(biāo)本，脫水石蠟包埋，切片（厚度約4 μm），甲苯胺藍(lán)染色，封片。400倍顯微鏡下分別選取雙側(cè)海馬CA1區(qū)各3個(gè)區(qū)域拍照，照片采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

2.4? 免疫組化染色

標(biāo)本制備方法同“2.3”項(xiàng)?？乖⒉ㄐ迯?fù)，中火8 min，停火8 min，中低火7 min;血清封閉，滴加抗體（TNF-α 1∶200，NF-κB 1∶400），4 ℃孵育過(guò)夜;加二抗，室溫孵育50 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min;脫水，封片。400倍顯微鏡下分別選取雙側(cè)海馬CA1區(qū)各3個(gè)區(qū)域拍照，照片采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以—x±s表示;多組間比較采用方差分析，連續(xù)變量比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析;偏態(tài)分布數(shù)據(jù)計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 一般狀況

SAMR1組小鼠情緒穩(wěn)定，毛順滑、光澤度較好;SAMP8組小鼠情緒暴躁易激惹，行走時(shí)左右搖擺，部分小鼠皮膚可見(jiàn)破潰，毛色略發(fā)黃;益腎化濁方低劑量組小鼠易激惹，行走不穩(wěn)但好于SAMP8組，部分小鼠皮膚可見(jiàn)破潰，毛色略發(fā)黃。益腎化濁方中劑量組小鼠情緒較穩(wěn)定，行走較穩(wěn)，皮膚無(wú)破潰，毛色略發(fā)黃;益腎化濁方高劑量組小鼠易激惹，行走較穩(wěn)，部分小鼠皮膚可見(jiàn)破潰，毛色略發(fā)黃;SAMR1組小鼠未出現(xiàn)死亡，SAMP8組和益腎化濁方低、中劑量組給藥過(guò)程小鼠各死亡2只，益腎化濁方高劑量組給藥過(guò)程小鼠死亡6只。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)部分胸腺異常腫大，心臟縮小，考慮死因?yàn)樾呐K受壓迫導(dǎo)致的循環(huán)衰竭，其中益腎化濁方高劑量組小鼠肝脾質(zhì)地柔軟，有瘀血，輕度腫大，伴有散在紫黑色瘀斑;益腎化濁方低、中劑量組小鼠肝脾質(zhì)地柔軟，顏色均一，呈暗紅色，未見(jiàn)明顯瘀斑。

4.2? 益腎化濁方對(duì)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

4.2.1? 搜索模式

經(jīng)過(guò)5 d訓(xùn)練學(xué)習(xí)，SAMR1組為趨向式或直線式，SAMP8組多為邊緣式或隨機(jī)式，益腎化濁方低、中、高劑量組趨向式模式逐漸增加。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.2.2? 平均游泳速度

經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，主體間效應(yīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明各組小鼠體質(zhì)基本一致，可排除游泳速度對(duì)潛伏時(shí)間的影響。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2.3? 逃避潛伏時(shí)間

經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，數(shù)據(jù)通過(guò)球形檢驗(yàn)（P>0.05），說(shuō)明重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)之間無(wú)相關(guān)性，可用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的單變量方差分析處理資料;主體內(nèi)效應(yīng)檢驗(yàn)顯示：時(shí)間因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明測(cè)量指標(biāo)（逃避潛伏時(shí)間）有隨時(shí)間變化的趨勢(shì);但時(shí)間和分組交互作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明時(shí)間因素的作用并不隨著分組的不同而不同。主體間效應(yīng)檢驗(yàn)顯示：分組因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明各組間逃避潛伏時(shí)間不同。事后比較采用LSD法：與SAMR1組比較，SAMP8組小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.05）;與SAMP8組比較，益腎化濁方中劑量組小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.2.4? 穿越平臺(tái)次數(shù)

經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較結(jié)果顯示，與SAMR1組比較，SAMP8組和益腎化濁方低、高劑量組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P<0.05）;與SAMP8組，益腎化濁方中劑量組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.05）;與益腎化濁方低、高劑量組比較，益腎化濁方中劑量組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

4.3? 益腎化濁方對(duì)模型小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響

SAMR1組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元整體排列有序，可見(jiàn)部分缺失，神經(jīng)元形態(tài)較好無(wú)明顯腫脹及固縮現(xiàn)象;SAMP8組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失嚴(yán)重，可見(jiàn)較大空泡，神經(jīng)元間隙明顯增寬，部分神經(jīng)元固縮較明顯;益腎化濁方低劑量組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元部分缺失，神經(jīng)元間隙增寬，部分神經(jīng)元固縮;益腎化濁方中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元整體排列較好，可見(jiàn)部分缺失，神經(jīng)元間隙略增寬，部分神經(jīng)元固縮，見(jiàn)圖2。各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量經(jīng)方差分析，與SAMR1組比較，SAMP8組和益腎化濁方低、中劑量組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（P<0.05）;與SAMP8組、益腎化濁方低劑量組比較，益腎化濁方中劑量組神經(jīng)元數(shù)量明顯增加（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

4.4? 益腎化濁方對(duì)模型小鼠海馬CA1區(qū)腫瘤壞死因子-α和核因子-κB表達(dá)的影響

經(jīng)方差分析，兩兩比較結(jié)果顯示，與SAMR1組比較，SAMP8組和益腎化濁方中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)TNF-α和活化的NF-κB表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與SAMP8組比較，益腎化濁方中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)TNF-α和活化的NF-κB表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5、圖3和圖4。

5? 討論

中醫(yī)學(xué)關(guān)于AD的論述見(jiàn)于“善忘”“文癡”等病癥中，根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)與臨床表現(xiàn)屬中醫(yī)學(xué)“呆證”范疇。AD病機(jī)根本在于腎精不足，兼有痰瘀內(nèi)擾。腎藏精，精充骨而生髓，髓聚而為腦，髓滿而腦髓充，精脫而腦髓消，腎中精氣作為構(gòu)成人體最基本的物質(zhì)基礎(chǔ)，其盛衰直接影響人體生命的全過(guò)程。益腎通淋方中淫羊藿、肉蓯蓉充腎精、溫腎陽(yáng)，女貞子、何首烏益精髓、滋肝腎，以應(yīng)“陰中求陽(yáng)，陽(yáng)中求陰”之意;石菖蒲開(kāi)竅化濕、寧神安智，川芎為血中氣藥，活血祛瘀，二者合用有化濁蠲飲之功效。

加速老化小鼠（SAM）是由AKR/J小鼠培育而來(lái)[8]，其中SAMP8小鼠具有與AD類似的臨床與病理表現(xiàn)[13]，研究發(fā)現(xiàn)，4～6月齡小鼠開(kāi)始進(jìn)入快速老化期，逐步表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力下降、脫毛、皮膚潰損、脊柱后凸變形、情緒不穩(wěn)定等衰老狀態(tài)[14]，這與中醫(yī)腎虛證的部分特點(diǎn)及腎虛模型具有相似性[15]。海馬是AD中最早損傷的區(qū)域之一，是記憶形成與存儲(chǔ)的關(guān)鍵區(qū)域，其中CA1區(qū)神經(jīng)元作用尤為重要[16];在評(píng)價(jià)AD模型中Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)為經(jīng)典的方案[17];AD患者尸檢發(fā)現(xiàn)海馬和內(nèi)嗅皮層區(qū)活化的NF-κB表達(dá)增強(qiáng)[18]，在NF-κB眾多的激活物質(zhì)中，TNF-α是目前研究較為完善的炎癥因子[6]。因此，本研究選取7月齡SAMP8小鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力，尼氏染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量的變化情況，免疫組化檢測(cè)海馬CA1區(qū)TNF-α及活化的NF-κB的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與SAMR1小鼠比較，SAMP8小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降、走路搖擺、情緒暴躁易激惹、皮膚潰損和脫毛等行為學(xué)變化，與既往研究一致[14]，采用益腎化濁方干預(yù)后可改善上述癥狀。對(duì)死亡小鼠解剖發(fā)現(xiàn)部分胸腺腫大，壓迫心臟，考慮SAM與AKR/J小鼠具有相似的基因背景[8]，而AKR/J小鼠常用做胸腺瘤模型。益腎化濁方高劑量組小鼠死亡數(shù)量高于其他組別，解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)肝脾存在散在瘀斑。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)何首烏具有一定的肝毒性，其損傷作用隨劑量增加而愈發(fā)明顯[19]。因此，考慮高劑量益腎化濁方（臨床實(shí)際用量的18.2倍）具有潛在的藥理毒性。

水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)結(jié)果提示，益腎化濁方中劑量可顯著改善SAMP8小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力及空間記憶的較長(zhǎng)時(shí)間維持[20]，同時(shí)該組小鼠搜索模式由最初的隨機(jī)式逐漸轉(zhuǎn)向趨向式，說(shuō)明其學(xué)習(xí)能力得到改善;而益腎化濁方高、低劑量組小鼠雖經(jīng)藥物干預(yù)后搜索模式有一定變化，逃避潛伏時(shí)間也有下降趨勢(shì)，但穿越平臺(tái)次數(shù)變化不明顯，說(shuō)明兩者在改善和維持學(xué)習(xí)記憶能力方面尚有不足。同時(shí)考慮高劑量益腎化濁方長(zhǎng)期連續(xù)服用具有潛在毒性，在研究益腎化濁方對(duì)海馬神經(jīng)元的影響時(shí)未再涉及益腎化濁方高劑量組。

尼氏染色結(jié)果顯示中劑量益腎化濁方（臨床實(shí)際用量的9.1倍）對(duì)減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失作用明顯，且好于低劑量益腎化濁方（臨床實(shí)際用量的4.55倍），CA1區(qū)神經(jīng)元在調(diào)節(jié)新記憶形成以及長(zhǎng)期記憶的維持具有重要作用[21]，因此，該結(jié)果提示益腎化濁方中劑量可通過(guò)保護(hù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元從而改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)合水迷宮實(shí)驗(yàn)與尼氏染色結(jié)果低劑量對(duì)SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元的改善作用不明顯，因此在可能涉及的機(jī)制研究中不再涉及該組。

Aβ是AD的病理因素中重要驅(qū)動(dòng)因子[22]，來(lái)源于淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP），經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶連續(xù)水解產(chǎn)生。Aβ可選擇性地將NF-κB亞基p65、p50進(jìn)行核轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)神經(jīng)元凋亡基因的表達(dá)[23]，誘導(dǎo)神經(jīng)元丟失;同時(shí)Aβ也可間接通過(guò)增加腦區(qū)TNF-α的釋放，激活NF-κB?；罨腘F-κB可增加β分泌酶，從而進(jìn)一步增加Aβ含量。前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方可降低SAMP8小鼠APP、PS1基因的表達(dá)，從而減少Aβ的生成[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，該方可降低SAMP8小鼠TNF-α的表達(dá)與NF-κB的入核活化。

綜上，益腎化濁方中劑量可改善7月齡SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與該方具有降低海馬CA1區(qū)TNF-α的表達(dá)與NF-κB的入核活化，從而減少神經(jīng)元丟失的作用有關(guān)。此外，發(fā)現(xiàn)高劑量益腎化濁方存在潛在的藥物毒性，雖然益腎化濁方中劑量組動(dòng)物死亡數(shù)量未出現(xiàn)顯著增多，但對(duì)于中劑量的藥物用量與服用時(shí)間等問(wèn)題仍需通過(guò)對(duì)肝腎功能等方面指標(biāo)檢測(cè)，進(jìn)一步評(píng)估其安全性以優(yōu)化組方。同時(shí)，鑒于影響NF-κB活化的因素眾多，以及活化后NF-κB會(huì)參與突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)調(diào)控、影響記憶相關(guān)蛋白CREB等多種因子的表達(dá)[6]，因此，益腎化濁方對(duì)NF-κB的調(diào)控作用及具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究明確。

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