補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影響

胡煬 虞堅(jiān)爾 張國(guó)棟 黃亦琦 薛征

摘要：目的? 觀察補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影響，探討其作用機(jī)制。方法? 將60只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、玉屏風(fēng)組和補(bǔ)腎固表高、中、低劑量組，除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/（kg·d），連續(xù)3 d，建立免疫抑制動(dòng)物模型，各給藥組給予相應(yīng)藥物，連續(xù)28 d。末次給藥后眼球取血，脫頸處死小鼠后無(wú)菌取出脾臟，MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖，LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞活力，ELISA檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-2（IL-2）和干擾素-γ（IFN-γ）水平。結(jié)果? 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活力、IL-2和IFN-γ水平均明顯降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，補(bǔ)腎固表各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活力、IL-2和IFN-γ水平均明顯增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01，P<0.001），脾臟質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況亦有改善。結(jié)論? 補(bǔ)腎固表顆粒通過(guò)增強(qiáng)免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和殺傷能力，提高血清IL-2和IFN-γ分泌水平，從而改善機(jī)體的免疫功能。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎固表顆粒;白細(xì)胞介素-2;干擾素-γ;NK細(xì)胞活力;脾淋巴細(xì)胞增殖;小鼠

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）07-0052-04

Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Gubiao Granules on the immune function of immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide; To explore the mechanism of immune function regulation. Methods Totally sixty ICR male mice were randomly divided into blank control group， model group， Yupingfeng group， Bushen Gubiao Granules high-， medium- and low-dosage groups. Except for the blank control group， the other groups were injected cyclophosphamide 50 mg/（kg·d） intraperitoneally for 3 consecutive days to establish an animal model of immunosuppression. Each administration group was given the corresponding medicine for gavage for 28 days. After the last administration， the eyeballs were bled; the mice were sacrificed by cervical dislocation; the spleens were aseptically removed. The proliferation of spleen lymphocytes was detected by MTT colorimetry. The killing activity of NK cells was detected by LDH method. Serum levels of IL-2 and IFN-γ were detected by ELISA. Results Compared with the blank control group， the spleen lymphocyte proliferation， NK cell activity， IL-2 and IFN-γ levels in the model group were significantly lower （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， Bushen Gubiao Granules high-， medium- and low-dosage groups could significantly enhance the proliferation of mouse spleen lymphocytes and NK cell killing activity， and increase serum IL-2 and IFN-γ levels （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. The

補(bǔ)腎固表顆粒由補(bǔ)骨脂、黃芪、柴胡、防風(fēng)、白術(shù)、烏梅按1∶2∶1∶1∶1比例制成，具有補(bǔ)腎固表、健脾益肺、和解祛邪功效。原方是虞堅(jiān)爾教授根據(jù)小兒肺腎不足的生理特點(diǎn)創(chuàng)制，臨床主要運(yùn)用于小兒反復(fù)呼吸道感染緩解期的治療，療效顯著，尤其對(duì)患兒汗多、食少等癥狀有明顯的改善作用[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎固表方對(duì)氫化可的松所致免疫功能低下小鼠免疫指標(biāo)及血清皮質(zhì)醇水平均有顯著改善[2]。玉屏風(fēng)顆粒在兒童呼吸系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用已形成專(zhuān)家共識(shí)，在免疫學(xué)方面，動(dòng)物體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明，其可顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，提高地塞米松所致免疫功能低下小鼠模型淋巴細(xì)胞活力、抑制淋巴細(xì)胞凋亡，增加NK細(xì)胞活力[3-5]。本實(shí)驗(yàn)以玉屏風(fēng)顆粒作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）及NK細(xì)胞活力，脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響，探討其對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動(dòng)物

雄性健康ICR小鼠60只，SPF級(jí)，3～4周齡，體質(zhì)量18～22 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SOXK（滬）2007-0005。分籠飼養(yǎng)于廈門(mén)市醫(yī)藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，通風(fēng)良好，每日光照12 h，晝夜交替。

1.2? 藥物

補(bǔ)腎固表顆粒，廈門(mén)市醫(yī)藥研究所制劑室制備，批號(hào)20180425;玉屏風(fēng)顆粒，廣東環(huán)球制藥有限公司，批號(hào)170918;環(huán)磷酰胺粉末（98%）100 mg，上海麥克林科技有限公司，批號(hào)C10196709。

1.3? 主要試劑與儀器

YAC-1小鼠淋巴瘤細(xì)胞，上海富祥生物科技有限公司;刀豆蛋白A，Sigma公司，貨號(hào)C5275-5MG;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)20180419;乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-2、IFN-γ ELISA試劑盒，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。Nikon倒置顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司;SpectraMax M3全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司;Universal320高速離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，新加坡Esco公司;梅特勒-托利多電子天平。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 分組及造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只ICR小鼠分為空白對(duì)照組、模型組、玉屏風(fēng)組和補(bǔ)腎固表高、中、低劑量組，每組10只。除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠參照文獻(xiàn)[4-5]方法，腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/（kg·d），連續(xù)3 d，建立免疫抑制動(dòng)物模型。

2.2? 給藥

于造模結(jié)束后次日灌胃給藥，補(bǔ)腎固表高、中、低劑量組給藥劑量分別為36、18、9 g/（kg·d），玉屏風(fēng)組給藥劑量為2.25 g/（kg·d），空白對(duì)照組予等量生理鹽水。給藥體積均為0.5 mL/只，每日1次，連續(xù)28 d。

2.3? 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

給藥結(jié)束后次日，稱(chēng)取小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血制備血清。快速打開(kāi)腹腔，無(wú)菌條件下摘取脾臟，用無(wú)菌紙吸干臟器表面血跡，電子天平稱(chēng)重，記錄，制備脾淋巴細(xì)胞懸液。

2.3.1? 脾淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖能力。吸取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，每份樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔，前3個(gè)分別加入50 μL刀豆蛋白A（終濃度為5 μg/mL），后3個(gè)為對(duì)照孔，每孔加入50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，結(jié)果以刺激指數(shù)（SI）表示。SI=試驗(yàn)孔OD490值÷對(duì)照孔OD490值。

2.3.2? NK細(xì)胞活力檢測(cè)

LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞活力。取傳代培養(yǎng)24～28 h、生長(zhǎng)良好的YAC-1細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，1000 r/min離心5 min。再以10%RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，然后懸浮，調(diào)整濃度至1×105/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，試驗(yàn)孔加入效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞各100 ?L，每份樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔（100 ?L靶細(xì)胞+100 ?L培養(yǎng)液）和最大釋放孔（100 ?L靶細(xì)胞+LDH釋放試劑），置37 ℃、5%CO2孵育24 h，培養(yǎng)結(jié)束前1 h，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在最大釋放孔中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)結(jié)束后，400×g離心5 min。吸取各孔上清120 ?L，置于新96孔板中，同時(shí)加入60 ?L新配制的LDH檢測(cè)工作液，置于水平搖床，避光反應(yīng)30 min。于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算NK細(xì)胞活力。結(jié)果以殺傷率表示。殺傷率（%）=（處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度）÷（細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度）×100%。

2.3.3? 血清白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ水平檢測(cè)

取小鼠血清，ELISA檢測(cè)小鼠血清IL-2與IFN-γ水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多重比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 一般狀況

空白對(duì)照組小鼠毛發(fā)光亮，活動(dòng)靈活，大便棕黑色，干濕適度;模型組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后第3日出現(xiàn)活動(dòng)減少，食量下降，扎堆明顯，喜抱團(tuán)，易驚，毛色黯淡，出現(xiàn)陰囊皺縮，炸毛、掉毛現(xiàn)象;給予補(bǔ)腎固表顆粒28 d后小鼠食量逐漸增加，活動(dòng)增多，扎堆減少，停止掉毛，毛色恢復(fù)柔順光亮。

4.2? 補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)小鼠體質(zhì)量及脾臟質(zhì)量的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量和脾臟質(zhì)量明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量和脾臟質(zhì)量明顯增加（P<0.05，P<0.001）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.3? 補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)模型小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01），并接近正常水平。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.4? 補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)模型小鼠NK細(xì)胞活力的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠NK細(xì)胞活力明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠NK細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01，P<0.001）;與玉屏風(fēng)組比較，補(bǔ)腎固表中、高劑量組小鼠NK細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

4.5? 補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)模型小鼠血清白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-2和IFN-γ含量明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，補(bǔ)腎固表各劑量組小鼠血清IL-2和IFN-γ含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）;補(bǔ)腎固表中、高劑量組小鼠血清IL-2含量?jī)?yōu)于玉屏風(fēng)組（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

5? 討論

補(bǔ)腎固表顆粒主要用于反復(fù)呼吸道感染緩解期的治療，緩解期多以正虛衛(wèi)表不固為主，治療當(dāng)以固本為要，補(bǔ)肺固表、健脾溫腎。虞堅(jiān)爾教授指出補(bǔ)腎實(shí)為固衛(wèi)[6]。衛(wèi)氣是行于皮膚、分肉、腠理之間的精微物質(zhì)，出于脾，功在肺，根于腎。方中補(bǔ)骨脂和黃芪為君藥，共同發(fā)揮溫腎健脾、固表止汗的作用;白術(shù)、防風(fēng)一收一散，使邪去而不傷正;柴胡、黃芩為常用藥對(duì)，清熱疏肝、和解祛邪，在反復(fù)呼吸道感染緩解期，邪氣尚未完全退去，正虛邪戀，用柴胡、黃芩以和解祛邪;烏梅斂肺止咳之功著。全方補(bǔ)中有清，以補(bǔ)為主，用藥平和，組方精當(dāng)，專(zhuān)為小兒特殊生理病理特點(diǎn)而設(shè)。現(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)骨脂在免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫分子各個(gè)方面都有不同的促進(jìn)或抑制作用，且補(bǔ)骨脂具有耐藥性低、不良反應(yīng)少、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[7]。黃芪可促進(jìn)體液免疫，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，刺激T、B淋巴細(xì)胞的吞噬，還能促進(jìn)NK細(xì)胞功能。Du等[8]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在促進(jìn)T細(xì)胞增殖活性的同時(shí)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分泌IL-4、IL-2及IFN-γ。柴胡和黃芩可解熱抗炎、抗病毒[9]。

脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活力、IL-2和IFN-γ是反映免疫功能的常用指標(biāo)。脾臟是人體最主要的免疫器官，在維持機(jī)體免疫功能方面發(fā)揮著重要作用，它可以產(chǎn)生漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，當(dāng)抗原侵襲機(jī)體時(shí)產(chǎn)生免疫應(yīng)答和免疫效應(yīng)物質(zhì)，還能合成干擾素、補(bǔ)體和細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)。淋巴細(xì)胞增殖并產(chǎn)生效應(yīng)淋巴細(xì)胞，清除非己抗原，維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，淋巴細(xì)胞增殖能力決定了效應(yīng)淋巴細(xì)胞的數(shù)量和機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的強(qiáng)度，反映了機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。NK細(xì)胞活力代表機(jī)體的天然防御功能，其作用范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于殺傷性T細(xì)胞，其能殺傷某些病毒感染細(xì)胞，而對(duì)正常未感染細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用。NK細(xì)胞還能調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的分化并分泌IL-2、IFN-γ等。IL-2和IFN-γ是具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。IL-2主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮效應(yīng)，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。能活化T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，刺激NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞活力及產(chǎn)生細(xì)胞因子。NK細(xì)胞和IL-2相互促進(jìn)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。IFN-γ產(chǎn)生于CD4+T和CD8+T，可通過(guò)促進(jìn)抗原提呈過(guò)程而增強(qiáng)免疫功能。

本研究結(jié)果表明，腹腔注射環(huán)磷酰胺能建立穩(wěn)定的免疫低下動(dòng)物模型，與空白對(duì)照組比較，模型小鼠一般狀況稍差，飲食減少，喜抱團(tuán)，體質(zhì)量減輕，脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活力、血清IL-2和IFN-γ水平均明顯下降，表明小鼠免疫功能降低。灌胃4周后，補(bǔ)腎固表顆粒能明顯增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活力（P<0.05），提高血清IL-2和IFN-γ水平（P<0.05，P<0.01），對(duì)脾臟質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況亦有改善。且補(bǔ)腎固表高劑量組對(duì)小鼠體質(zhì)量、脾臟質(zhì)量、NK細(xì)胞活力及IFN-γ水平均有顯著提高（P<0.01）。補(bǔ)腎固表顆粒對(duì)脾臟質(zhì)量、NK細(xì)胞活力及IL-2水平的提高優(yōu)于玉屏風(fēng)組。我們認(rèn)為，補(bǔ)腎固表顆粒通過(guò)提高血清IL-2、IFN-γ、脾淋巴細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活力，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張新光，李利清，霍莉莉.虞堅(jiān)爾兒科臨證經(jīng)驗(yàn)摭拾[J].浙江中醫(yī)藥雜志，2006，41（7）：379-380.

[2] 虞堅(jiān)爾，李合國(guó)，趙鋆，等.補(bǔ)腎固表方對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠模型免疫細(xì)胞功能的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，16（1）：47-49.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)兒科分會(huì)、中國(guó)中藥協(xié)會(huì)藥物臨床評(píng)價(jià)研究專(zhuān)業(yè)委員會(huì)、國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心和中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)兒童肺炎聯(lián)盟.玉屏風(fēng)顆粒在兒童呼吸系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)[J].中華實(shí)用兒科臨床雜志，2018，33（4）：241-246.

[4] 曹繼軍.玉屏風(fēng)顆粒的藥效學(xué)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2010， 26（5）：390，394.

[5] LI Y， ZHENG B， TIAN H， et al. Yupingfeng Powder relieves the immunesuppression induced by dexamethasone in mice[J]. J Ethnopharmacol，2017，200：117-123.

[6] 周亞兵，虞堅(jiān)爾.虞堅(jiān)爾補(bǔ)腎固表法辨治小兒反復(fù)呼吸道感染[J].上海中醫(yī)藥雜志，2010，44（11）：15-17.

[7] 李笑甜，宋忠臣.補(bǔ)骨脂及其活性成分免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2017，37（1）：80-83.

[8] DU X， ZHAO B， LI J， et al. Astragalus polysaccharides enhance immune responses of HBV DNA vaccination via promoting the dendritic cell maturation and suppressing Treg frequency in mice[J]. Int Immunopharmacol，2012，14（4）：463-470.

[9] 胡煜明，李順祥，嚴(yán)建業(yè)，等.柴胡、黃芩藥對(duì)的研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志，2014，30（7）：199-201.