我國(guó)牧草種帶真菌研究進(jìn)展

高晨軒，南志標(biāo)

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

牧草種子是草地生態(tài)建設(shè)與畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的基礎(chǔ)，隨著我國(guó)畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，退耕還草與栽培草地建設(shè)等項(xiàng)目的不斷實(shí)施，可以預(yù)見(jiàn)在未來(lái)我國(guó)對(duì)牧草種子的需求量巨大[1-2]。同時(shí)，種子作為高等植物的繁殖器官會(huì)攜帶大量的病原微生物，在這些病原微生物中真菌是對(duì)種子質(zhì)量影響最大的一類微生物[3-4]。病原真菌可以通過(guò)多種方式進(jìn)行傳播(混于種子間、附于種子外部或寄生于種子組織內(nèi)部)，并且在種子的收獲期、貯藏期與幼苗的生長(zhǎng)期均可造成嚴(yán)重的危害。種帶真菌能夠降低種子的發(fā)芽率并影響種子活力，引起種子的生理生化異常，進(jìn)而導(dǎo)致種子質(zhì)量的降低，最終會(huì)嚴(yán)重影響牧草種子的質(zhì)量和產(chǎn)量，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。種帶真菌除寄生于種子上還會(huì)在其他環(huán)境(土壤、植物殘?bào)w和雜草上)中生存，并且會(huì)在環(huán)境適宜時(shí)再次造成侵染。因此了解種帶真菌，進(jìn)而采取相應(yīng)的措施是防治病害的重要手段[5-9]。本文就近年來(lái)我國(guó)牧草種帶真菌研究加以綜述，以期為種帶真菌的研究提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，同時(shí)也為減少種帶真菌造成的經(jīng)濟(jì)損失提供相關(guān)的科學(xué)依據(jù)。

1 種帶真菌的檢測(cè)方法

種帶真菌的分離與檢測(cè)是研究種帶真菌進(jìn)而采取相應(yīng)防治措施的重要基礎(chǔ)。國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(International Seed Testing Association，ISTA) 1993年指出，健康的種子是指種子上的病原微生物存在較少，且種子應(yīng)具有良好的生理狀態(tài)。理想的種帶真菌監(jiān)測(cè)方法應(yīng)該具有敏感度高、簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)[10]。目前常見(jiàn)的種帶真菌檢測(cè)方法大致有8種，其特點(diǎn)亦不相同(表1)。

表1 種帶真菌常見(jiàn)的檢測(cè)方法Table 1 Common detection methods of seed-borne fungi

2 我國(guó)牧草種帶真菌

截至2018年，我國(guó)科研工作者共對(duì)12種牧草種子的種帶真菌進(jìn)行了分離研究(表2)，分別為沙打旺(Astragalus adsurgens)、燕麥(Avena sativa)、小冠花(Coronilla varia)、老芒麥(Elymus sibiricus)、偃麥草(Elytrigia repens)、羊草(Leymus chinensis)、多年生黑麥草(Lolium perenne)、苜蓿(Medicago)、紅豆草(Onobrychis viciaefolia)、蘇丹草 (Sorghum sudanense)、紅三葉(Trifolium pratense)和草木樨(Melilotus suaveolens)。其中，豆科牧草6種，禾本科牧草6種。種樣來(lái)源包括中國(guó)、澳大利亞、丹麥、新西蘭、美國(guó)和加拿大共計(jì)6個(gè)國(guó)家。中國(guó)的種樣來(lái)源包括甘肅、新疆、青海、河北、河南、江蘇、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、寧夏、山東、山西、陜西和黑龍江共計(jì)14個(gè)省。

表2 我國(guó)已檢出的牧草種帶真菌Table 2 Seed-borne fungi isolated from forage in China

針對(duì)6種重要牧草的種帶病原真菌的致病性在培養(yǎng)皿中進(jìn)行了初步測(cè)定(表3)，共分離得到種帶真菌50個(gè)屬，可大致分為3類：1)病原真菌，在一定條件下會(huì)嚴(yán)重影響種子質(zhì)量并抑制幼苗生長(zhǎng)，如鐮刀菌(Fusariumspp.)、離蠕孢(Bipolarisspp.)、粉紅單端孢(Trichothecium roseum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)等[8,28]；2)拮抗菌，通過(guò)代謝產(chǎn)物或者競(jìng)爭(zhēng)作用等方式抵抗病原菌，如枝頂孢(Acremoniumsp.)、球毛殼菌(Chaetomium globosum)等[29-30]；3)貯藏真菌，種子收獲后在貯藏期間傳播的真菌，如曲霉(Aspergillusspp.)和青霉(Penicilliumspp.)等[31-32]。

續(xù)表2Table 2 (Continued)

3 影響種帶真菌的因素

3.1 環(huán)境條件

由于每種真菌孢子發(fā)育、繁殖、侵染和傳播所需的環(huán)境條件不同，不同種子種帶真菌的種類和數(shù)量均不相同，即使是同一種子，在不同培養(yǎng)條件和不同培養(yǎng)基質(zhì)上的帶菌情況也會(huì)存在差異[33]。李春杰和南志標(biāo)[8]在研究苜蓿種帶真菌區(qū)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的各種樣之間其帶菌率存在差異，相同產(chǎn)地的不同品種之間其種子帶菌率也存在很大的差異。濕潤(rùn)半濕潤(rùn)地區(qū)帶菌率較高，干旱地區(qū)帶菌率較低。帶菌率最高可以達(dá)到100%，最低僅為0.75%。沙打旺的帶菌率與其成熟、收獲期的氣候條件息息相關(guān)，即濕潤(rùn)度越高，種子帶菌率越高[5]。其中產(chǎn)自淮陰的種子帶菌率最高，為20%；產(chǎn)自保定的種子帶菌率最低，達(dá)到4.5%。收獲期的濕潤(rùn)度與種子帶菌率極顯著正相關(guān)(P＜ 0.01)，R2= 0.987。

表3 種帶真菌致病性測(cè)定Table 3 Pathogenicity of seed-borne fungi

3.2 貯藏條件

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，紫花苜蓿帶菌種子數(shù)量下降，主要種帶真菌交鏈孢、曲霉和枝孢的檢出率也隨之下降[31]。室溫條件下貯藏300 d較貯藏60 d的種子真菌檢出率降低了3%。同時(shí)，隨著溫度濕度的增高，有利于貯藏真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，表現(xiàn)出苜蓿種帶真菌檢出率逐漸增高。室溫條件下種子帶菌率僅為10%；在35 ℃，10%種子含水量的條件下，種子帶菌率達(dá)到了29%。老芒麥帶菌率亦是隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)[20]。其中，2010年收獲的種子帶菌率為38%，顯著(P＜ 0.05)高于其之前收獲的種樣帶菌率，造成這種現(xiàn)象的原因可能是隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，不能適應(yīng)貯藏環(huán)境條件的真菌漸漸被淘汰掉，另一方面隨著時(shí)間的增加，老芒麥種子的休眠不斷被解除，而真菌侵染速率隨著種子的萌發(fā)而降低[20,33]。

3.3 種子部位

真菌在種子的部位直接決定了病害發(fā)生的強(qiáng)度[34]。種子的不同部位其種帶真菌的種類與數(shù)量亦會(huì)不同。有研究表明，種帶腐生真菌多存在于種子表面，種子胚上幾乎不存在[35]。對(duì)淮陰沙打旺種樣解剖檢測(cè)表明，85.7%的沙打旺種帶真菌存在于子葉內(nèi)[5]。檢測(cè)多年生黑麥草種帶真菌存在部位時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑麥草稃殼上檢出真菌15種，胚乳檢出16種而胚上僅檢出6種[21]。檢測(cè)蘇丹草種帶真菌時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，種皮檢出真菌最多，達(dá)到13種；穎殼次之，為12種；胚乳檢出10種而胚內(nèi)檢出真菌最少(7種)[36]。造成這種現(xiàn)象的原因主要為真菌入侵時(shí)，種子的形態(tài)結(jié)構(gòu)是否能夠?qū)χ斐扇肭终系K[37]。同時(shí)亦與真菌種類及其入侵強(qiáng)度息息相關(guān)。

4 種帶病原真菌的防治

南志標(biāo)[37]提出建立我國(guó)牧草病害可持續(xù)管理防治體系，即“以信息技術(shù)、生物技術(shù)和經(jīng)濟(jì)學(xué)與社會(huì)學(xué)的知識(shí)為技術(shù)支撐，通過(guò)抗病品種的利用和對(duì)草地的持續(xù)管理，并輔以殺菌劑拌種和生物防治等措施，將病害控制在經(jīng)濟(jì)閾值水平之下，達(dá)到提高草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)整體生產(chǎn)力和穩(wěn)定性的目的”。目前，我國(guó)牧草種帶真菌常見(jiàn)的防治方法有4種。

4.1 熱水處理

熱水處理法具有易于操作，對(duì)種子及生態(tài)環(huán)境影響較小的優(yōu)點(diǎn)。Nan等[38]檢測(cè)柱花草(Stylosanthes guianensias)種子的種帶真菌之后，確認(rèn)種帶真菌多位于種皮，故選擇了熱水處理進(jìn)行防治用以替代化學(xué)殺菌劑。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確定將種子于55 ℃的熱水中浸泡10 min防治效果最佳，種子被感染率下降31%。若繼續(xù)提高溫度和浸泡時(shí)間，可以減少種帶真菌的數(shù)量但會(huì)造成對(duì)種子的不良影響，如發(fā)芽率降低，死種子數(shù)量的增加。張穎[21]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)45 ℃熱水處理20 min的多年生黑麥草種子可降低其種子帶菌率35%，減少死種率10%，且不影響種子的發(fā)芽率。但是使用熱水處理要注意溫度控制在適宜范圍內(nèi)，因?yàn)闊崴幚聿划?dāng)會(huì)導(dǎo)致發(fā)芽率的降低。

4.2 微波處理

研究表明，使用微波處理可以達(dá)到安全、高效的滅菌效果，但是要注意處理時(shí)間與微波強(qiáng)度的控制，以保證種子活力不受影響[39]。適當(dāng)強(qiáng)度的微波處理不但能夠降低披堿草種子的帶菌率，而且可以顯著促進(jìn)其芽的生長(zhǎng)及幼苗鮮重和株高的增加[40]。測(cè)試發(fā)現(xiàn)，在150 W功率下進(jìn)行40 s的微波處理不但能夠有效降低種子的帶菌率55.83%，且不影響種子的活力，還可以進(jìn)一步促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)以及生物量的積累，處理后幼苗苗長(zhǎng)提高了15.87%，株高提高了10.49%。

4.3 干熱處理

干熱處理在一定處理范圍內(nèi)不但可以殺菌，而且能夠促進(jìn)種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)。但是，處理的溫度和時(shí)間應(yīng)控制在種子可以耐受的范圍之內(nèi)，反之種子的活力會(huì)深受影響。研究發(fā)現(xiàn)，75 ℃處理20 d能使披堿草種子帶菌率從93.17%顯著降到0(P＜ 0.05)[41]。同時(shí)，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和幼苗鮮重分別顯著提高36.37%、73.94%、50.38%、63.38%和7.79%，且在幼苗生長(zhǎng)初期對(duì)芽和根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，處理后芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)分別增加了0.54%和14.43%。

4.4 殺菌劑拌種

殺菌劑拌種是指在播種之前，使藥劑與種子充分?jǐn)嚢杌靹?。拌種不但可以起到防病治蟲(chóng)的效果，而且對(duì)種子危害很小，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于種子的生產(chǎn)活動(dòng)中。南志標(biāo)團(tuán)隊(duì)曾系統(tǒng)論述了在牧草病害防治過(guò)程中，殺菌劑拌種的應(yīng)用及其優(yōu)點(diǎn)[42-43]，并指出殺菌劑拌種是一種有效且經(jīng)濟(jì)的病害防治方式。總體而言，殺菌劑拌種之后種子的發(fā)芽率和出苗率可顯著提高，但會(huì)因?yàn)闅⒕鷦┓N類、拌種對(duì)象、土壤條件和拌種種子活力的不同，造成拌種之后效果各異[44-45]。針對(duì)紫花苜蓿、多年生黑麥草、高羊茅、草地早熟禾(Poa pratensis)和蘇丹草的試驗(yàn)表明，不同殺菌劑拌種之后，多數(shù)殺菌劑可以顯著(P＜ 0.05)提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，提高生物量(表4)。

4.5 其他措施

近年來(lái)，一些新興的防治種帶真菌的方法在其他植物的種子上取得了良好的防效，但未在牧草種子上進(jìn)行相關(guān)研究。

臭氧作為一種廣譜殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用越發(fā)廣泛。臭氧的殺菌作用原理為單原子氧的氧化作用。單原子氧與引起植物病害的各種病原物接觸之后，氧化其組織蛋白，進(jìn)而使之失去活性甚至死亡。研究發(fā)現(xiàn)，2～6 mg·L-1的高濃度臭氧水對(duì)高粱(Sorghum bicolor)種子進(jìn)行處理，種子在2 mg·L-120 min和6 mg·L-110 min處理?xiàng)l件下，發(fā)芽霉變率最低，僅為6%[47]。在研究水稻(Oryza sativa)種子滅菌方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲波和臭氧水結(jié)合處理水稻種子可以顯著提高殺菌效率，用超聲波結(jié)合臭氧水處理3 h后殺菌率可以達(dá)到90%[48]。

王玉霞等[49]以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的發(fā)酵液為原料，制成生物拌種劑，應(yīng)用于玉米(Zea mays)種子防治種傳和土傳病害。結(jié)果表明，該生物制劑對(duì)根腐病的防效超過(guò)80%，對(duì)黑穗病的防效超過(guò)74.6%，對(duì)地下害蟲(chóng)防效超過(guò)66.7%，同時(shí)可以使玉米增產(chǎn)8.7%～5.7%。但是環(huán)境因素會(huì)影響生防物質(zhì)的防效，其穩(wěn)定性和持續(xù)性均會(huì)發(fā)生變化。黃曦等[50]指出，為實(shí)現(xiàn)生防物質(zhì)互補(bǔ)、多種病害兼防、作用持久的良好防治效果可考慮將生防物質(zhì)配合化學(xué)藥劑使用或者配合使用多種生防物質(zhì)。

表4 殺菌劑對(duì)牧草種帶真菌的防治效果Table 4 Effect of different fungicides on seed-fungi of forage

5 問(wèn)題與展望

相較于種帶真菌造成的危害，牧草成株后的病害往往更易引起人們的重視，但是種子作為植物生活史的重要階段同時(shí)也是植物生活史的薄弱環(huán)節(jié)，更易受到各種生物或非生物的脅迫影響，因此要更加重視種帶真菌的檢測(cè)與防治以減少未來(lái)可能發(fā)生的病害[51-54]。目前，我國(guó)牧草種帶真菌的研究已取得了巨大的進(jìn)展，但是仍需加強(qiáng)以下幾個(gè)方面：1)牧草種帶真菌的檢測(cè)大多采用培養(yǎng)方法進(jìn)行分離純化，在今后的研究中為得到更加全面準(zhǔn)確的種帶真菌信息，需進(jìn)一步結(jié)合非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行研究。2)多數(shù)研究表明，種帶病原真菌會(huì)對(duì)種子帶來(lái)嚴(yán)重的不利影響，如抑制種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)，降低種子質(zhì)量。但是造成該影響的具體物質(zhì)究竟是什么，及其影響種子質(zhì)量的詳細(xì)作用機(jī)制尚需進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。3)有關(guān)牧草種帶真菌的防治研究尚不全面，應(yīng)加大研究力度爭(zhēng)取全面覆蓋所有的重要牧草，以達(dá)到科研與生產(chǎn)實(shí)踐結(jié)合的目的。