紫花苜蓿對(duì)隴東黃土高原油污土壤場(chǎng)地生態(tài)修復(fù)的綜合響應(yīng)

宋 曦，王金成，井明博，劉光琇，陳 拓，吳勝偉，周天林

（1. 隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000；2. 甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 慶陽 745000；3. 隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 慶陽 745000；4. 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅 蘭州 730000；5. 西安環(huán)發(fā)環(huán)保工程有限公司，陜西 西安 710068）

現(xiàn)已成為全國(guó)第一大油田的長(zhǎng)慶油田公司是隴東地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)，但因石油開采、貯存及運(yùn)輸造成該地區(qū)原油污染的土壤面積達(dá)1.02 萬hm2，其北部地區(qū)土壤總石油烴含量已高出土壤油污臨界值近300倍[1]。目前油污土壤生態(tài)修復(fù)技術(shù)主要包括物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法和生物修復(fù)法，而生物修復(fù)法以其成本低、可大面積原位操作和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[2]，其中植物修復(fù)法以其處理效果好、美化環(huán)境和無生物性二次污染等優(yōu)點(diǎn)已逐漸成為石油污染土壤生態(tài)恢復(fù)領(lǐng)域的首選技術(shù)之一[3]。

應(yīng)用于油污退化生態(tài)系統(tǒng)的植物應(yīng)具備抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速和抗旱耐寒等特點(diǎn)，如紅三葉草(Trifolium pratense)、韃靼濱藜(Atriplex tatarica)、狗尾草(Setaria viridis)、沙打旺(Astragalus adsurgens)、鹽地堿蓬 (Suaeda salsa)、檸條(Caragana korshinskii)和鹽角草(Salicornia europaea)等[4-6]。但在油污土壤場(chǎng)地修復(fù)過程中植物發(fā)揮活性的條件相對(duì)苛刻[7]，易受多種環(huán)境因素的影響，其中包括場(chǎng)地修復(fù)時(shí)外部環(huán)境因素和植物生理因素[8]。我國(guó)大陸境內(nèi)原油主產(chǎn)區(qū)均位于東北和西北地區(qū)，因此外部環(huán)境因素會(huì)直接或間接影響生物修復(fù)技術(shù)的選擇與修復(fù)方式的準(zhǔn)確定位[9]，而修復(fù)植物本身生理特性則成為制約油污土壤生物降解速率和修復(fù)效果的決定性因素[10]。因此，系統(tǒng)分析修復(fù)植物在油污土壤實(shí)際場(chǎng)地修復(fù)過程中的生理響應(yīng)機(jī)制是解決上述問題的關(guān)鍵因素之一。

紫花苜蓿 (Medicago sativa) 作為我國(guó)北方適生植物，因其根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)[11]、固氮及根際微環(huán)境共代謝水平高[12]等特點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于油污土壤生態(tài)修復(fù)技術(shù)研究[13]。然而以往有關(guān)油污土壤植物修復(fù)技術(shù)相關(guān)研究大多以盆栽試驗(yàn)為主，運(yùn)用紫花苜蓿開展油污土壤實(shí)際場(chǎng)地生態(tài)修復(fù)相關(guān)研究則鮮有報(bào)道。為此，本研究以紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，在長(zhǎng)慶油田公司第二采油廠隴東污泥處理站進(jìn)行為期3個(gè)月的場(chǎng)地修復(fù)試驗(yàn)，分析了紫花苜蓿應(yīng)對(duì)4種隴東地區(qū)常見油污濃度 (1%、3%、5%和7%) 時(shí)19種植物生理和生物降解相關(guān)環(huán)境指標(biāo)的變化情況，旨在揭示場(chǎng)地修復(fù)過程中紫花苜蓿應(yīng)對(duì)不同油污濃度脅迫時(shí)的生理響應(yīng)情況，優(yōu)化場(chǎng)地修復(fù)降解條件、加速生物降解速率，為隴東地區(qū)油污土壤植物生態(tài)修復(fù)的大面積實(shí)地推廣應(yīng)用提供參考和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 供試樣地選擇和試驗(yàn)設(shè)置

場(chǎng)地修復(fù)地點(diǎn)位于甘肅省慶陽市馬嶺鎮(zhèn)長(zhǎng)慶油田公司采油二廠隴東油泥處理站(107°22′19″ E，36°36′15″ N)。供試油污土樣的初始總石油烴 (total petroleum hydrocarbons，TPH)含量設(shè)置為1%、3%、5%和7%，澆水平衡2周后測(cè)得TPH含量依次為0.98%、2.95%、4.82%和6.89%，以不加油泥的井場(chǎng)周邊撂荒地清潔土壤為空白對(duì)照組(TPH濃度為0)。

由西安環(huán)發(fā)環(huán)保工程有限公司負(fù)責(zé)修建束沿，深度為50 cm，大小為3 m × 3 m，土層鋪設(shè)厚度為25～30 cm，土樣容重為1.78 g·cm-3，自然含水為量8.59%，pH為8.82。包括對(duì)照組(CK)在內(nèi)，每個(gè)油污濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共計(jì)15個(gè)束沿修復(fù)池。試驗(yàn)于 2017年4月6日開始，7月5日結(jié)束，試驗(yàn)周期為91 d，每個(gè)束沿播撒供試植物種子1 000粒，覆土厚度約為1 cm，每3 d澆水一次，使土壤田間持水量保持在65%左右，從5月中旬起由自然降水提供水分。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

試驗(yàn)結(jié)束后在每個(gè)束沿池內(nèi)隨機(jī)收獲20株供試植物，隨機(jī)分為2組(每組10株)，第1組采用程立娟和周啟星[14]的方法測(cè)定其株高、根長(zhǎng)、地上及地下生物量和根冠比，同時(shí)收集每株供試植物的根際土壤，采用稀釋培養(yǎng)測(cè)數(shù)法 (MPN) 測(cè)定烷烴降解菌和芳烴降解菌數(shù)量；第2組取植株新鮮葉片，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量[15]，采用硫代巴比妥酸 (TBA) 測(cè)定丙二醛 (MDA) 含量[16]，采用氮藍(lán)四唑法 (NBT) 測(cè)定超氧化物歧化酶 (SOD)活性[17]，采用Rao等[18]的方法檢測(cè)過氧化物酶 (POD)活性，采用H2O2法予以測(cè)定過氧化氫酶 (CAT) 活性[19]，上述指標(biāo)均以供試植物鮮重計(jì)算。土壤TPH殘留量和植物體各部TPH含量采用超聲-索氏萃取-重量法測(cè)定[20]。采用張麟君等[23]的方法測(cè)定植物地上部和地下部總石油烴含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算

利用 SPSS 18.0和 R2.15.2 (http:∥www.r-project.org/) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Origin 8.0和R 2.15.2作圖。為了解析隴東黃土高原地區(qū)不同油污濃度脅迫時(shí)紫花苜蓿生長(zhǎng)及生理指標(biāo)間相互關(guān)系，本研究對(duì)不同油污濃度影響下各指標(biāo)進(jìn)行Pearson's相關(guān)性分析，使用R語言“corrplot”程序包進(jìn)行相關(guān)矩陣排序和顯著性水平計(jì)算[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿根際土壤TPH降解率變化

土壤TPH降解率是直接反映生態(tài)修復(fù)過程中植物對(duì)石油烴吸收和轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[21]。不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿TPH降解率變化不盡相同 (P＜ 0.01)，隨著油污濃度增加紫花苜蓿處理組根際土壤TPH降解率逐步下降(P＜ 0.05)，相較于1%油污濃度時(shí)(75.23%)，當(dāng)油污濃度分別增至3%、5%和7%時(shí)，其TPH降解率依次顯著下降了9.53%、30.07%和87.41%(圖1)。這說明隨著油污濃度不斷增加，其毒性效應(yīng)隨之增強(qiáng)，阻礙了根際微環(huán)境植物與微生物的共代謝水平。

圖1 不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿根際土壤總石油烴降解率變化Figure 1 Changes in the TPH removal rate by Medicago sativa under stress from different TPH concentrations

2.2 不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)指標(biāo)變化

F檢驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，不同油污濃度對(duì)紫花苜蓿的株高、根長(zhǎng)、地上部生物量、地下部生物量和根冠比有極顯著影響 (P＜ 0.01)。

當(dāng)油污濃度為1%時(shí)，紫花苜蓿株高與CK組間無顯著差異(P＞ 0.05)，說明較低的油污濃度對(duì)紫花苜蓿的株高無顯著影響；而隨著油污濃度增至3%～7%時(shí)其株高顯著降低(P＜ 0.05)。當(dāng)油污濃度增至3%和5%時(shí)，紫花苜蓿株高較CK分別下降了25.94%和 24.06%，說明上述2種油污濃度對(duì)紫花苜蓿株高的抑制程度較為一致。當(dāng)油污濃度達(dá)到7%時(shí)，紫花苜蓿株高較CK降低了80.46%，表明高濃度油污土壤對(duì)紫花苜蓿的株高的抑制作用尤為明顯。隨著油污濃度增加，紫花苜蓿地下生物量和根冠比呈顯著降低趨勢(shì) (P＜ 0.05)，表明重度石油污染對(duì)紫花苜蓿地下生物量的積累具有明顯的抑制作用，致使其根冠比也隨之降低(圖2)。

紫花苜蓿根長(zhǎng)、地上及地下部生物量和根冠比方面，隨著油污濃度從1%增至7%，與CK組相比，根長(zhǎng)依次降低了26.28%、15.95%、23.71%和94.49%，地上部生物量分別降低了11.52%、19.62%、1.67%和85.82%，地下部生物量分別降低了44.51%、82.49%、86.96%和99.23%，而根冠比則依次下降了37.25%、78.28%、85.85%和94.45%(圖2)。上述結(jié)果說明重度污染對(duì)紫花苜蓿根長(zhǎng)和地上部生物量和根冠比的抑制作用尤為顯著。相較而言，地下部生物量和根冠比對(duì)油污濃度變化則較為敏感，當(dāng)油污濃度大于3%時(shí)，其地下部生物量和根冠比降低程度相對(duì)較大。

圖2 場(chǎng)地修復(fù)過程中不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)指標(biāo)變化情況Figure 2 Changes in growth indicators for Medicago sativa under stress from different TPH concentrations during the site remediation period

2.3 不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)對(duì)TPH的轉(zhuǎn)移及富集

植物修復(fù)油污土壤主要通過根際微環(huán)境中植物與微生物協(xié)同作用將持久性有機(jī)污染物礦化后，經(jīng)蒸騰作用被運(yùn)輸?shù)街参锏那o葉部分，通過生物化學(xué)反應(yīng)將石油烴進(jìn)行徹底分解為CO2，進(jìn)而通過植物呼吸作用釋放到空氣中[22]，為了說明修復(fù)植物對(duì)持久性有機(jī)污染物礦化和轉(zhuǎn)化能力，通常采用生物轉(zhuǎn)移系數(shù) (TF) 和生物富集系數(shù) (BCF) 來表征植物對(duì)污染物的遷移轉(zhuǎn)化和吸收程度，其中生物轉(zhuǎn)移系數(shù)是指植物地上部與地下部總石油烴含量的比值；生物富集系數(shù)是指植物體內(nèi)總石油烴含量與土壤總石油烴含量的比值[23]。

當(dāng)油污濃度在 3%和5%時(shí)，決定BCF系數(shù)高低的植物體地上及地下部TPH含量在不同油污濃度脅迫時(shí)變化也不盡相同 (P＜ 0.01)。其中TPH濃度為3%時(shí)紫花苜蓿地上部TPH含量最高，7%時(shí)最低(P＜0.05)，而地下部TPH含量則以5%時(shí)最高，7%時(shí)最低(P＜ 0.05)；根據(jù)上述結(jié)果，分別計(jì)算不同油污濃度影響下紫花苜蓿的BCF系數(shù)和TF系數(shù)，且BCF和TF系數(shù)表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，即1%和3%油污濃度時(shí)兩種系數(shù)均顯著高于其他濃度處理(P＜ 0.05)(表1)，說明土壤中TPH含量過高時(shí)，紫花苜蓿對(duì)TPH的富集轉(zhuǎn)化將受到抑制，原因可能是土壤中的TPH含量超出了紫花苜蓿所能承受的最高閾值，烴類物質(zhì)的生態(tài)毒性可抑制植物體對(duì)TPH的吸收。

2.4 不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿生理指標(biāo)變化

F檢驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，紫花苜?？扇苄缘鞍缀?、葉綠素含量、MDA含量以及CAT酶、POD酶和SOD酶活性在不同油污濃度間存在極顯著差異 (P＜0.01)。多重比較結(jié)果顯示，紫花苜?？扇苄缘鞍缀吭谟臀蹪舛?%和3%時(shí)最高，且顯著高于其他濃度處理(P＜ 0.05) ；而葉綠素含量則在TPH濃度為5%時(shí)達(dá)到最高，7%脅迫組最低；不同油污濃度脅迫時(shí)紫花苜蓿CAT和POD酶活性表現(xiàn)出與葉綠素含量相似的變化趨勢(shì)，即5%濃度時(shí)最高，7%時(shí)最低；SOD酶活性和MDA含量在應(yīng)對(duì)不同油污濃度脅迫時(shí)二者亦表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，隨著TPH濃度的增加而逐漸降低，其中1%濃度組與CK組間無顯著差異 (P＞ 0.05)，且顯著高于其他濃度組 (P＜ 0.05)。

表1 場(chǎng)地修復(fù)過程中不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿對(duì)土壤TPH的富集系數(shù)(BCF)及轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF)Table 1 Bioconcentration factor and transfer factor values for Medicago sativa under stress from different TPH concentrations

表2 場(chǎng)地修復(fù)過程中不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿生理指標(biāo)變化情況Table 2 Changes in the physiological indexes for Medicago sativa under stress from different TPH concentrations during the site remediation period

2.5 不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿根際土壤中石油烴降解菌數(shù)量變化

當(dāng)油污濃度從0增至3%時(shí)，其烷烴降解菌數(shù)量由 0.32 × 105CFU·g-1增至 4.41 × 105CFU·g-1，但之后逐步降低，當(dāng)油污濃度增至5%和7%時(shí)，與1%濃度組相比，其烷烴降解菌數(shù)量分別下降了39.42%和77.93%，說明紫花苜蓿根際烷烴降解菌數(shù)量對(duì)重度污染相對(duì)敏感，而中度污染時(shí)抑制作用相對(duì)較小(圖3)。芳烴降解菌數(shù)量則在3%濃度組時(shí)最高，為6.21 × 103CFU·g-1；1%濃度時(shí)次之，為5.23 × 103CFU·g-1；3%濃度以上，隨油污濃度增加芳烴降解菌數(shù)量降低 (P＜ 0.05)，說明中低油污濃度時(shí)土壤石油烴為土著石油降解菌提供了大量的碳源，有助于土壤石油降解數(shù)量的提升[14]；但當(dāng)油污濃度高于5%時(shí)，石油烴會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，加劇根際土壤粘度進(jìn)而抑制土壤透氣性[11]，加之石油降解菌大多為好氧菌[13]，因此造成高濃度土壤烷烴降解菌和芳烴降解菌數(shù)量的下降。

2.6 中度和重度油污濃度脅迫下紫花苜蓿各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)分析

為了綜合解析隴東地區(qū)不同油污濃度脅迫時(shí)供試指標(biāo)間內(nèi)在關(guān)系，本研究選取中度(3%)和重度 (7%)兩種油污濃度進(jìn)行Pearson's相關(guān)性分析。分析可知，當(dāng)油污濃度為3%時(shí)，BCF系數(shù)與紫花苜蓿地上部分TPH含量 (r= 0.899，P= 0.001) 和可溶性蛋白含量 (r= 0.660，P= 0.045) 呈正相關(guān)關(guān)系，而與轉(zhuǎn)移系數(shù)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系 (r= -0.643，P= 0.038)，這說明紫花苜蓿對(duì)TPH的吸收主要發(fā)生并富集在根際區(qū)域(圖4)。土壤TPH殘留量分別與植物體TPH殘留量(r= 0.786)、葉綠素總量 (r= 0.893)、烷烴降解菌 (r=0.894) 和芳烴降解菌數(shù)量(r= 0.880)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜ 0.01)，說明中度污染時(shí)，紫花苜蓿TPH富集量隨土壤中TPH含量增加而增加，進(jìn)而引起了包括葉綠素 (r= 0.882)、MDA含量 (r= 0.776)、烷烴降解菌(r= 0.909) 和芳烴降解菌數(shù)量 (r= 0.896) 的顯著增加(P＜ 0.01)。

當(dāng)油污濃度為7%時(shí)，土壤中TPH殘留量與植物體內(nèi)TPH含量 (r= 0.845，P= 0.002)和烷烴降解菌數(shù)量 (r= 0.722，P= 0.018) 存在正相關(guān)關(guān)系，而植物體內(nèi)TPH殘留量又與BCF系數(shù) (r= 0.908，P＜0.01) 和烷烴降解菌數(shù)量 (r= 0.681，P= 0.030) 存在正相關(guān)關(guān)系，且BCF系數(shù)與烷烴降解菌亦存在正相關(guān)關(guān)系 (r= 0.670，P= 0.034)，上述結(jié)果在某種程度上說明紫花苜蓿在如此高濃度油污脅迫下依然進(jìn)行了TPH的轉(zhuǎn)移，而此時(shí)植物體內(nèi)TPH殘留量與TF系數(shù)無相關(guān)性則說明TPH含量在植物體內(nèi)分布較為一致，即地上及地下部分間無顯著差異。

圖3 場(chǎng)地修復(fù)過程中不同油污濃度脅迫下紫花苜蓿根際土壤石油烴降解菌數(shù)量變化情況Figure 3 Changes to the quantity of TPH degrading bacteria in the rhizosphere soil around Medicago sativa under stress from different TPH concentrations during the site remediation period

3 討論與結(jié)論

石油烴對(duì)土壤污染主要表現(xiàn)為破壞土壤結(jié)構(gòu)、降低土壤透性，引起根部腐爛，阻礙植物根系呼吸及養(yǎng)分吸收等[11]。因此利用植物進(jìn)行油污土壤生態(tài)修復(fù)，需通過檢測(cè)其株高、生物量、根冠比等諸多植物體生長(zhǎng)指標(biāo)，來評(píng)價(jià)植物是否具備修復(fù)油污土壤潛力[13]。本研究中紫花苜蓿5種生長(zhǎng)指標(biāo)在不同油污濃度脅迫時(shí)呈極顯著差異 (P＜ 0.01)。首先，紫花苜蓿株高和根長(zhǎng)均隨油污濃度增加明顯降低 (P＜ 0.05)，這與山寶琴等[24]研究結(jié)果相一致。但本研究中當(dāng)油污濃度為3%紫花苜蓿根長(zhǎng)顯著增長(zhǎng)，究其原因可能是由于中度石油污染可刺激植物根際的生長(zhǎng)所致[22]。其次，植物體地上及地下生物量在油污濃度低于5%時(shí)其影響程度不盡相同，但在7%脅迫組時(shí)二者均為最低，這與時(shí)騰飛等[25]研究結(jié)果基本一致。說明不同濃度石油烴對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)指標(biāo)的影響不盡相同，但總體表現(xiàn)為油污濃度增加對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用則愈加明顯[14,25]，而5%的油污濃度卻對(duì)紫花苜蓿地上生物量的積累有明顯的促進(jìn)作用。

圖4 場(chǎng)地修復(fù)過程中3%和7%油污濃度脅迫下紫花苜蓿各指標(biāo)間相關(guān)性Heatmap圖譜Figure 4 Heatmap diagrams showing the correlation analyses of the physiological and biochemical indexes for Medicago sativa under TPH concentration stress levels of 3% and 7% during the site remediation period

石油烴的生物降解主要發(fā)生在修復(fù)植物的根際微環(huán)境中，通過植物根際分泌物與土壤微生物群落共代謝作用將持久性有機(jī)污染物礦化從而達(dá)到生物降解的目的，因此油污土壤植物修復(fù)過程中植物體地下部生物量對(duì)于油污土壤生物生態(tài)修復(fù)效果尤為重要[14]。本研究中，紫花苜蓿根冠比隨油污濃度的增加呈顯著下降 (P＜ 0.05)，說明石油烴對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)影響主要體現(xiàn)在對(duì)地下生物量的影響，因此如何有效保護(hù)紫花苜蓿根際生長(zhǎng)對(duì)于提高根際微環(huán)境石油烴礦化速率至關(guān)重要。

可溶性蛋白是調(diào)控植物代謝的主要物質(zhì)，其含量高低是表征植物合成和代謝能力的重要指標(biāo)。當(dāng)石油烴污染土壤后，植物體可通過增加蛋白質(zhì)合成量或?qū)⒉豢扇苄缘鞍邹D(zhuǎn)化成可溶性蛋白的方式來維持植物體正常新陳代謝[12]。本研究中紫花苜?？扇苄缘鞍缀吭谟臀蹪舛?%和3%時(shí)達(dá)到最高(P＜ 0.05)，之后隨著油污濃度的增加而逐步降低，這與雒曉芳等[26]研究結(jié)論基本一致。結(jié)合Pearson's相關(guān)性分析可知，當(dāng)油污濃度小于3%時(shí)，紫花苜蓿可通過增加可溶性蛋白的含量予以補(bǔ)償，且TPH可能在根部積累的含量高于其地上部分。但當(dāng)油污濃度大于3%時(shí)，補(bǔ)償方式則受到顯著抑制。此外，雒曉芳等[26]采用盆栽試驗(yàn)時(shí)石油烴對(duì)紫花苜蓿可溶性蛋白合成的抑制濃度僅為 0.75%，而在本研究實(shí)際場(chǎng)地生態(tài)修復(fù)時(shí)其抑制濃度出現(xiàn)在5%以上，說明大面積實(shí)施場(chǎng)地修復(fù)時(shí)紫花苜?？扇苄缘鞍讓?duì)于石油烴毒害作用的補(bǔ)償作用更加明顯。

植物體在逆境條件下亦可通過增加光合作用來適應(yīng)或補(bǔ)償土壤逆境帶來的生長(zhǎng)損失，因此葉綠素含量高低是衡量植物體該補(bǔ)償效應(yīng)的重要參數(shù)[27]。本研究中紫花苜蓿葉綠素含量在TPH濃度為5%時(shí)達(dá)到最高，說明石油烴濃度在5%時(shí)對(duì)紫花苜蓿的生態(tài)毒性最大，紫花苜蓿通過光合作用進(jìn)行最大程度的生理補(bǔ)償，同時(shí)增加烷烴降解菌和芳烴降解菌數(shù)量加速植物體根際微環(huán)境的TPH濃度(圖4)。但當(dāng)石油烴濃度增至7%時(shí)，其葉綠素含量已降至0.63 mg·kg-1(表2)，說明重度污染時(shí)石油烴可以直接進(jìn)入植物體內(nèi)造成直接傷害，進(jìn)而影響葉綠體正常生理功能[28]。

CAT是植物組織一種保護(hù)植物體免受過氧化氫積累危害的重要酶類，因此其活性的高低是反映植物抗性的重要生理指標(biāo)[13]。于君寶等[29]在溫室條件下模擬了2種不同油污濃度(0.5%和2%)對(duì)黃河三角洲地區(qū)蘆葦(Phragmites australis)和鹽地堿蓬(Suaeda salsa)幼苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，鹽地堿蓬幼苗葉片CAT活力隨油污濃度增加而下降，但對(duì)蘆葦幼苗葉片CAT活性無顯著影響；而蘆葦幼苗葉片POD活性隨油污濃度增加而升高，但鹽地堿蓬葉片中POD活力隨油污濃度的增加呈先升后降的變化趨勢(shì)。弓曉峰等[30]模擬了4種不同油污濃度(0、1%、5%和 10%)對(duì)玉米(Zea mays)生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示重度污染 (TPH ≥ 5%) 可有效增加玉米CAT活性，但會(huì)抑制POD活性。上述試驗(yàn)結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。本研究中5%濃度組紫花苜蓿CAT活性明顯增加，但7%濃度組時(shí)該酶活性受到抑制。說明中低油污濃度時(shí)(＜ 5%)，紫花苜?？寡趸芰γ黠@，并有效解除過氧化氫和過氧化物積累，但當(dāng)油污濃度達(dá)到7%時(shí)，植株為解除上述積累毒害作用而消耗了大量CAT和POD，同時(shí)抑制了紫花苜蓿抗氧化酶的活性和抗氧化劑的產(chǎn)生，對(duì)抗氧化系統(tǒng)造成損傷[31]，進(jìn)而引起CAT和POD活性在此濃度下明顯下降。

本研究中紫花苜蓿SOD酶活性和MDA含量在油污濃度1%時(shí)與CK組間無顯著差異，且二者顯著高于其他濃度組 (表2)。說明SOD酶對(duì)石油烴污染較為敏感，這一結(jié)果也印證了宋雪英等[32]在分析不同油污濃度對(duì)小麥生態(tài)毒性中所提出的SOD酶對(duì)持久性有機(jī)污染物極為敏感的試驗(yàn)結(jié)論。SOD酶是植物體內(nèi)重要的膜保護(hù)酶之一，可防御活性氧或其他過氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害和逆境脅迫，在石油污染土壤后其活性相對(duì)較高[30]。但本研究中隨著油污濃度由1%增至5%時(shí)該酶活性逐漸升高，但在7%脅迫組時(shí)其活性驟然下降，說明一定濃度范圍內(nèi)油污濃度的增加可誘導(dǎo)紫花苜蓿SOD酶活性的增加以清除自由基對(duì)植物的毒害作用[27]，但當(dāng)氧自由基含量超過紫花苜?？沙惺芊秶鷷r(shí)，石油烴的生理毒性則會(huì)直接破壞紫花苜?？寡趸阁w系[31]，進(jìn)而導(dǎo)致SOD酶活性大幅降低。MDA數(shù)量能夠表征膜脂過氧化程度和抗氧化能力強(qiáng)弱，當(dāng)石油烴污染土壤后植物體往往發(fā)生細(xì)胞膜脂過氧化作用，MDA含量則隨油污濃度的增加而升高[29]。雒曉芳等[26]在研究不同石油烴脅迫濃度下小麥(Triticum aestivum)和玉米兩種供試植物盆栽觀測(cè)試驗(yàn)后指出，小麥葉片中的MDA含量隨著石油濃度的升高而降低，但玉米葉片中的MDA含量則是隨著石油濃度的增加而升高。弓曉峰等[30]研究表明，玉米MDA含量隨著污土濃度的增加呈現(xiàn)低-高-低的趨勢(shì)。上述結(jié)果與本研究結(jié)果不盡相同，同時(shí)也說明不同植物應(yīng)對(duì)石油烴污染時(shí)MDA含量變化因種而異，在不同油污濃度脅迫時(shí)紫花苜蓿和小麥MDA含量較為相似，究其原因可能是重度污染對(duì)植物細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)破壞所致。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，3%脅迫組時(shí)土壤石油烴降解菌數(shù)量明顯增加(圖3)，因此需要消耗大量POD酶分解紫花苜蓿根際微環(huán)境中由于降解菌在進(jìn)行TPH生物降解時(shí)所產(chǎn)生大量的過氧化物，進(jìn)而造成原油降解菌數(shù)量越多，POD酶活越低的試驗(yàn)結(jié)果(圖4)。但就兩種石油烴降解菌相關(guān)性結(jié)果來看，烷烴降解菌在進(jìn)行飽和烷烴生物降解時(shí)產(chǎn)生的超氧化物含量相對(duì)較高，表現(xiàn)為SOD酶與烷烴降解菌負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與Chang等[33]對(duì)烷烴降解菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果相吻合。而重度污染時(shí)葉綠素含量的提升有助于土壤TPH的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而在其根際刺激了烷烴及芳烴降解菌生長(zhǎng)繁殖，但油污濃度達(dá)到7%時(shí)，TPH轉(zhuǎn)移、富集和膜系統(tǒng)及抗氧化體系造成了嚴(yán)重破壞(圖4)，由此推斷隨著油污濃度等繼續(xù)增加，植物體膜系統(tǒng)及抗氧化體系的持續(xù)破壞，其TPH轉(zhuǎn)移和富集程度將隨植物體枯黃死亡而中斷。

綜上所述，紫花苜蓿實(shí)際場(chǎng)地修復(fù)3個(gè)月后，TPH積累降解率隨油污濃度增加而逐漸降低。實(shí)際場(chǎng)地修復(fù)中紫花苜蓿在油污濃度1%時(shí)TPH降解率最高為73.39%，而7%油污濃度時(shí)TPH降解率僅為9.44%；株高、根長(zhǎng)和根冠比均隨TPH濃度增加而明顯降低。5%油污濃度有助于其地上生物量的積累但卻明顯抑制了地下生物量。由此說明，隴東黃土高原地區(qū)采用紫花苜蓿開展石油污染土壤生態(tài)修復(fù)時(shí)油污濃度5%應(yīng)設(shè)為臨界值。