叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3a和β-連環(huán)蛋白在胚胎停育絨毛組織中的表達(dá)及意義

馮靜 趙莉萍

胚胎停育是指因受精卵缺陷或母體存在不利妊娠的因素，如遺傳因素、免疫因素、感染、母體內(nèi)分泌失調(diào)、細(xì)胞增殖和凋亡、血栓因素、解剖異常、環(huán)境因素等，導(dǎo)致早期或中期胚胎死亡，全部或部分的組織留在宮腔內(nèi)未能自然排出的一種病理性妊娠，病因十分復(fù)雜，有約40%～50%的胚胎停育原因未明[1]。胚胎停育是一種特殊類型的自然流產(chǎn)，近年來，發(fā)病率有明顯升高趨勢，這對孕婦的身心健康造成嚴(yán)重影響，因此，探究胚胎停育的病因，為早期預(yù)防以及改善妊娠結(jié)局提供新的理論依據(jù)顯得尤為重要。叉頭框蛋白O家族的核心是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3a(forkhead box O transcription factors 3a,FoxO3a)，目前研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞、組織與胚胎發(fā)育、卵泡成熟、血管生成、免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種多功能胞內(nèi)蛋白，既是Wnt/β-catenin通路中的信號傳導(dǎo)分子，又是細(xì)胞間重要黏附分子，這兩種功能可相互獨(dú)立發(fā)揮作用。一方面，可作為轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，參與轉(zhuǎn)錄的激活；另一方面，可參與錨定細(xì)胞骨架與E-鈣黏蛋白(E-cadherins)，涉及細(xì)胞-細(xì)胞黏附接頭的組成，在子宮內(nèi)膜蛻膜化期間的細(xì)胞黏附中起重要作用[4]。本文旨在使用免疫組織化學(xué)技術(shù)SP法檢測胚胎停育患者絨毛中FoxO3a和β-catenin的表達(dá)情況，初步探討二者的作用及其與絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡的關(guān)系。

對象與方法

一、研究對象

選取2017年10月—2018年6月就診于包鋼集團(tuán)第三職工醫(yī)院婦產(chǎn)科門診，經(jīng)彩超證實(shí)為胚胎停育者30例，停經(jīng)7～11周，年齡24～37歲，平均年齡(29.6±2.5)歲。隨機(jī)選取同期正常妊娠，經(jīng)彩超證實(shí)為宮內(nèi)早孕有胎心搏動，自愿要求負(fù)壓吸引術(shù)流產(chǎn)者30例，停經(jīng)6～9周，年齡20～40歲，平均年齡(27.1±4.1)歲。兩組研究對象既往月經(jīng)周期規(guī)律，在取標(biāo)本前3個月內(nèi)均未服用激素類藥物，未放置宮內(nèi)節(jié)育器，無生殖道感染，無內(nèi)外科合并癥，術(shù)前簽署知情同意書。比較兩組年齡、孕周及體重指數(shù)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),男方年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組患者一般情況比較Table 1 Comparison of basic information between two groups

*Compared with normal early pregnant group,P<0.05

二、方法

1.標(biāo)本采集與免疫組織化學(xué)技術(shù)SP法處理：負(fù)壓400 mmHg吸引出入選研究組、對照組的絨毛組織及蛻膜等宮腔內(nèi)容物后，絨毛組織置于生理鹽水中漂洗，洗凈表面血跡后取標(biāo)本約0.5×0.5×0.5 cm3置于體積分?jǐn)?shù)為10%中性甲醛固定液中固定并石蠟包埋，每個組織標(biāo)本蠟塊按厚度4 μm連續(xù)切片2張，分別采用鏈菌素親生物蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidn peroxides conjugated method，S-P法)檢測FoxO3a和β-catenin的表達(dá)。常規(guī)脫蠟水化、抗原熱修復(fù)后，嚴(yán)格按試劑盒(KIT-9710，購自福州邁新公司)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟。兔抗人FoxO3a多克隆抗體(ab70314)購于美國ABCAM公司，鼠抗人β-catenin單克隆抗體(610154)購自美國BD生物技術(shù)公司，二者稀釋濃度均為1:200。自然晾干后閱片，陽性對照為試劑公司所提供的陽性片，PBS代替一抗作為陰性對照。

2.結(jié)果判定：由2位病理醫(yī)師采用雙盲法在光鏡下進(jìn)行觀察和評定。每張切片隨機(jī)選取 5個視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞。FoxO3a及β-catenin均主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，β-catenin在正常妊娠組部分表達(dá)于細(xì)胞膜，二者陽性信號均為出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行半定量判定。(1)按照顯色強(qiáng)度分為無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別評為0、1、2、3分。(2)按照陽性細(xì)胞百分率計(jì)為<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。最后根據(jù)兩者乘積，(1)×(2)，將染色情況分為4級：0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為(++)，>6分為(+++)。乘積<2分判定為陰性(-)，≥2分判定為陽性(+)。

結(jié) 果

一、兩組滋養(yǎng)細(xì)胞中FoxO3a的表達(dá)情況

FoxO3a主要表達(dá)于胚胎停育組滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，正常妊娠組滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。FoxO3a在胚胎停育組、正常妊娠組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中陽性表達(dá)率分別為36.7%(11/30)和63.3%(19/30)，F(xiàn)oxO3a在胚胎停育組陽性表達(dá)率低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

二、兩組滋養(yǎng)細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)情況

β-catenin主要表達(dá)于胚胎停育組滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，正常妊娠組滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)(圖2)。β-catenin在胚胎停育組、正常妊娠組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中陽性表達(dá)率分別為56.7%(17/30)和26.7%(8/30)，β-catenin在胚胎停育組陽性表達(dá)率高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

三、兩組滋養(yǎng)細(xì)胞中FoxO3a與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

FoxO3a與β-catenin在胚胎停育組中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(rs=-0.591，P<0.05)，二者在正常妊娠組中的表達(dá)無相關(guān)性(rs=-0.099，P>0.05)，見表3。

圖1 FoxO3a表達(dá)的病理圖(免疫組化SP染色,×100)Figure 1 The pathology of figure of FoxO3a′s expression (immunohistochemical SP staining, ×100)

GroupnFoxO3a+-β-catenin+-missed abortion group3011(36.7)?19(63.3)17(56.7)?13(43.3)normal earlypregnant group3021(70.0)9(30.0)8(26.7)22(73.3)total6032(53.3)28(46.7)25(41.7)35(58.3)

*Compared with normal early pregnant group,P<0.05

圖2 β-catenin表達(dá)的病理圖(免疫組化SP染色,×100)Figure 2 The pathology of figure of β-catenin′s expression (immunohistochemical SP staining, ×100)

FoxO3aβ-cateninmissed abortion group-+totalβ-cateninearly pregnant group-+total-41519639+921116521total13173022830

討 論

一定程度的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡在正常妊娠生理活動中是存在的[5]，主要發(fā)生在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，在胚胎生長發(fā)育過程中，增殖-凋亡的狀態(tài)平衡利于形成絨毛內(nèi)血管及分支并保持相關(guān)的侵襲能力[6]。當(dāng)某因素導(dǎo)致增殖-凋亡的平衡狀態(tài)被打破后，絨毛胎盤血管增殖不良，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力降低，絨毛凋亡增加，生長發(fā)育受阻，最終導(dǎo)致胚胎停育，這可能是早期自然流產(chǎn)發(fā)生的一個重要病理過程。近期研究表明，自然流產(chǎn)妊娠組織中存在著過度凋亡，而且過度凋亡的發(fā)生與促凋亡基因的高表達(dá)有關(guān)[1]。有學(xué)者研究顯示，F(xiàn)oxO3a可誘導(dǎo)促凋亡因子表達(dá)，進(jìn)而激活半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，使卵母細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元以及腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞發(fā)生凋亡[7-9]。而FoxO3a在合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)的高表達(dá)可有利于維持妊娠[10]。FoxO3a在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位受磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt) 信號通路影響，對凋亡的調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要作用[11-13]。KIM等[11]推測正常早期妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞中FoxO3a磷酸化后被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)處在失活狀態(tài)，阻礙凋亡基因表達(dá)可使合體滋養(yǎng)細(xì)胞維持正常生理狀態(tài)；而稽留流產(chǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞FoxO3a在胞質(zhì)中表達(dá)下降，并出現(xiàn)較多胞核內(nèi)表達(dá)，去磷酸化的 FoxO3a大部分進(jìn)入胞核，使凋亡基因表達(dá)最終加速細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致絨毛正常發(fā)育的平衡狀態(tài)失衡引起胚胎停育。本實(shí)驗(yàn)與其研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)中FoxO3a在胚胎停育組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中陽性表達(dá)率低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

胚胎發(fā)育過程中Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化、凋亡和定位等生物學(xué)過程。胚胎附著子宮內(nèi)膜的過程是著床，成功著床的標(biāo)志是胎盤血管形成及母體蛻膜滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控胚胎著床包括2個方面：激活胚胎植入位點(diǎn)上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，使胚胎著床后的血管重塑胎盤形成；在胚胎植入前激活子宮環(huán)形平滑肌，調(diào)節(jié)胚胎對子宮內(nèi)膜的黏附和侵入。胚胎著床窗子宮內(nèi)膜β-catenin蛋白表達(dá)暫時(shí)性下調(diào)或缺失,有利于促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離和胚胎著床[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-catenin在胚胎停育組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中陽性表達(dá)率高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示β-catenin在胚胎停育過程中扮演著重要角色。

本實(shí)驗(yàn)得出胚胎停育組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中FoxO3a與β-catenin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能共同參與了細(xì)胞過度凋亡和胚胎停育的過程。二者在諸多細(xì)胞生命活動中有重要意義，其相互之間作用可影響各自表達(dá)和功能，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。如FoxO3a能可逆性同T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(LEF)競爭結(jié)合β-catenin，阻斷Wnt信號通路下游靶基因的激活。FoxO3a靶基因GABARAPL1可通過促進(jìn)自噬降解Dvl2蛋白抑制Wnt/β-catenin信號通路[15]。有學(xué)者在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)當(dāng)實(shí)驗(yàn)組加入抑制劑后，β-catenin的表達(dá)被抑制，而FoxO3a的表達(dá)較對照組升高，提示FoxO3a受Wnt/β-catenin負(fù)調(diào)控，可能是其下游分子[16]。綜上所述，F(xiàn)oxO3a與β-catenin在胚胎停育過程中發(fā)揮重要作用，更深入研究二者在發(fā)生胚胎停育信號通路中的具體機(jī)制，明確胚胎停育細(xì)胞過度凋亡的發(fā)病機(jī)理，將為早期預(yù)防及改善妊娠結(jié)局提供新的理論依據(jù)。