棕竹炭疽病病原菌的分離鑒定

樊改麗

(廈門市綠化中心/廈門市森林病蟲害防治技術(shù)站，福建 廈門 361004)

炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)真菌是一類分布廣泛的植物病原菌，可危害橡膠樹、茶樹、茉莉、辣椒、芒果等上百種植物，是多種糧食作物及經(jīng)濟(jì)作物的重要致病菌。膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)復(fù)合種分為22個種和1個亞種[1]，暹羅刺盤孢菌(C.siamense)是膠孢炭疽菌復(fù)合種中的一種,2009年由Prihastuti et al[2]從泰國健康咖啡漿果和病果上分離得到。由暹羅刺盤孢菌引起的經(jīng)濟(jì)作物炭疽病報道比較多，如引起的蘋果[3]、草莓[4]、油茶[5]、海南臺農(nóng)芒果[6]、菠蘿蜜[7]炭疽病等。

棕竹(Rhapisexcelsa)也稱觀音竹、棕櫚竹等，原產(chǎn)于我國東南和西南地區(qū)，為棕櫚科棕竹屬的常綠叢生灌木。現(xiàn)約有20種棕竹屬植物，分為大葉棕竹、細(xì)葉棕竹、中葉棕竹、花葉棕竹和多裂棕竹等[8]。近年來，棕櫚科植物種植越來越廣泛，隨之而來的棕竹病害發(fā)生也逐漸增加[9]。棕竹病害的發(fā)生不僅嚴(yán)重影響了棕竹的健康生長和觀賞價值，同時對其他棕櫚科植物造成潛在危險。而當(dāng)前有關(guān)棕竹病害分離鑒定及防治的研究鮮見報道。

本文對廈門市植物園、公園及道路綠化帶常見的棕竹葉斑病進(jìn)行采樣，采用形態(tài)學(xué)特征與分子系統(tǒng)發(fā)育相結(jié)合的方法進(jìn)行分離鑒定，以期為棕竹炭疽病的化學(xué)防治及生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集及病原菌的分離純化

2017年7月，在廈門市植物園、公園和道路綠化帶進(jìn)行棕竹病害調(diào)查。采集有明顯黃褐色、黑色斑點(diǎn)的病害葉片樣品，標(biāo)記后裝入干凈樣品袋中，帶回實(shí)驗室進(jìn)行病原菌的分離。將組織樣品剪成約5 mm的組織塊，放置于裝有體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的燒杯中，緩慢振蕩1 min，用滅菌蒸餾水沖洗3次，用無菌濾紙吸干組織表面水分，將樣品放到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(加入0.05 g·mL-1鏈霉素)中，每皿放置2塊。4～5 d后觀察純化平板的菌落是否為純的單菌落。若為單菌落，則純化完成；若不是，則繼續(xù)純化，直至每個平板上的菌落皆為單菌落。對純化好的菌落(培養(yǎng)6～7 d)進(jìn)行拍照后，用體積分?jǐn)?shù)為25%甘油進(jìn)行保菌，存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 病原菌致病性測試

取棕竹幼嫩及成熟健康的葉片，用自來水沖洗3次，用吸水紙吸干表面水分；培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上濕潤的濾紙，將葉片用接種刀輕輕刮傷表皮形成造傷葉片，將無造傷和造傷葉片放置于濾紙上；在每片葉片上接種帶孢子的菌絲塊(5 mm)，以未接種的葉片作為對照組；蓋好蓋子后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，定期觀察發(fā)病情況并記錄結(jié)果，待發(fā)病后從病組織處再次分離病原菌。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

對病害葉片進(jìn)行室內(nèi)觀察，將具有明顯特征的樣品(葉片正面或背面可以看見明顯的小黑點(diǎn)等顆粒狀物質(zhì))拿到體視鏡(奧林巴斯SZX16)下拍照。之后進(jìn)行切片和鏡檢，在顯微鏡(奧林巴斯BX-53)下觀察該病原菌的形態(tài)特征，并進(jìn)行拍照和測量，完成病原菌的初步鑒定。對供試菌株進(jìn)行形態(tài)觀察鑒定，將分離純化的菌株進(jìn)行培養(yǎng)、定期觀察并測定生長速率；當(dāng)菌絲表面出現(xiàn)橘黃色物質(zhì)時，則該菌開始產(chǎn)孢，此時將菌株在體視鏡下拍照；用挑針挑取產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和適量孢子，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)特征，記錄并進(jìn)行拍照和測量。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 病原菌DNA的提取及多基因PCR擴(kuò)增 將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，收集菌絲團(tuán)塊，冷凍干燥后，采用DNA快速提取法提取真菌基因組DNA[10]。并對獲得的DNA進(jìn)行多基因PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增基因包括核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因(ITS)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、肌動蛋白基因(ACT)、鈣調(diào)蛋白基因(CAL)及幾丁質(zhì)合成酶基因(CHS-1)。擴(kuò)增引物如表1所示。擴(kuò)增后5 μL PCR產(chǎn)物加到1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。當(dāng)條帶明亮清晰、無雜帶，且條帶大小與所擴(kuò)基因片段大小相同時，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收，并送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 PCR引物及擴(kuò)增片段長度信息Table 1 Detail information on PCR primers and the length of amplicons

1.4.2 DNA序列分析 將獲得的供試菌株測序序列用Bio Edit軟件進(jìn)行序列修正，在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行Blast比對，得到初步的比對結(jié)果。選用Weir et al[1]鑒定的膠孢炭疽菌復(fù)合種中的模式菌株以及從NCBI比對中選取相應(yīng)種的序列作為參考序列，采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建和注釋[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測定

在廈門市植物園、公園和道路綠化帶采集大葉棕竹病害樣品，分離純化出9株單菌株。9株單菌落菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長速度與菌落形態(tài)特征一致，均從葉尖、葉緣及葉片中部發(fā)病，初期為褐色或黑色小斑點(diǎn)，隨后病斑擴(kuò)展形成不規(guī)則形病斑或梭形病斑，發(fā)病中期可見明顯的病健交界，嚴(yán)重時造成葉片缺刻(圖1A)。致病性測定表明，用菌絲塊接種10 d后發(fā)現(xiàn)造傷接種葉片有明顯病斑產(chǎn)生(圖1B)，并能從病斑處分離到與原接種菌一致的菌株，且所產(chǎn)生的分生孢子與原接種菌株形態(tài)、大小一致，說明供試菌株為棕竹葉斑病的病原菌；而無傷接種的葉片(CK)未表現(xiàn)病征(圖1C)，說明供試菌株可以從傷口處侵染棕竹葉片。

A.自然發(fā)??；B.造傷葉片發(fā)病；C.無傷葉片(CK)。圖1 棕竹葉片炭疽病癥狀Figure 1 Leaf symptoms of R.excelsa anthracnose

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

A.正面；B.背面。圖2 棕竹炭疽菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落生長形態(tài)Figure 2 Colony morphology of R.excelsa anthracnose on PDA plate

對分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征鑒定。在PDA平板上，菌落正面菌絲為白色或灰色絨毛狀，菌落中間菌絲繁茂，邊緣菌絲稀疏；菌落背面白色、淡褐色、淡黃色。在光周期12 h、28 ℃條件下培養(yǎng)，7 d后菌落直徑為4.4～5.2 cm(圖2)；15 d后可在菌落表面形成肉眼可見的橘黃色分生孢子堆(圖3A)。顯微鏡下觀察，分生孢子盤為褐色或灰褐色，分生孢子梗無色(圖3B)；分生孢子為單孢、無色、長橢圓狀、圓柱狀、兩端稍頓或一端尖頓；一些孢子內(nèi)含2個油球；分生孢子大小為(12.92～15.63) μm×(4.77～5.84) μm，平均為13.93 μm×5.55 μm，長寬比為2.51(圖3C)。此鑒定結(jié)果與野外采集樣品徒手切片鑒定到的菌落菌絲、分生孢子等具有相同的形態(tài)學(xué)特征。

A.分生孢子堆；B.分生孢子盤和分生孢子梗；C.分生孢子。圖3 棕竹炭疽菌菌落孢子堆及孢子形態(tài)特征Figure 3 Morphological characteristics of R.excelsa anthracnose conidiophore heaps and conidia spores

2.3 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

將供試菌株進(jìn)行ITS基因序列擴(kuò)增，并對片段測序，通過NCBI Blast同源性比對，發(fā)現(xiàn)病原菌株序列與膠孢炭疽菌復(fù)合種中的暹羅刺盤孢菌小種序列相似度為100%。為進(jìn)一步確定鑒定結(jié)果，本研究選取真菌鑒定常用的ACT、CAL、CHS-1和GAPDH共4個單基因序列引物對病原菌進(jìn)行擴(kuò)增。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對表明，ACT、CAL、CHS-1和GAPDH4個單基因序列與數(shù)據(jù)庫中暹羅刺盤孢菌相似性分別為100%、99.7%、99.2%和100%。在ITS、ACT、CAL、CHS-1和GAPDH5個基因序列的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)病原菌菌株與暹羅刺盤孢菌株聚為一類(圖4)。結(jié)合病原菌菌落特征、顯微鏡下形態(tài)學(xué)特征以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，本研究將棕竹炭疽病病原菌鑒定為暹羅刺盤孢菌。

圖4 基于ITS、ACT、CAL、CHS-1和GAPDH基因序列構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of ITS, ACT, CAL, CHS-1 and GAPDH genes

3 討論與結(jié)論

本研究對引起廈門市植物園、公園及道路綠化帶的大葉棕竹炭疽病的病原菌進(jìn)行了分離與鑒定。病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察及單基因與多基因聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，引起廈門市棕竹炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌復(fù)合種小種暹羅刺盤孢菌(C.siamense)。該病菌可以侵染棕櫚科植物棕竹，造成棕竹炭疽病，屬于國內(nèi)棕櫚科植物中鑒定到暹羅刺盤孢菌的首次報道。

林業(yè)和園林植物由暹羅刺盤孢菌引起的炭疽病研究相對較少。 2017年李沛利等[12]鑒定了暹羅刺盤孢菌可以引起成都市園林觀賞植物鵝掌柴的炭疽病；徐明珠等[13]首次分離鑒定了暹羅刺盤孢菌可引起荊州市香樟樹炭疽病。吳奉奇[14]研究表明，廣東省肇慶市北嶺山降香黃檀、樟樹、閩楠、火力楠、貝殼杉和格木炭疽病均由暹羅刺盤孢菌引起。李河等[15]研究發(fā)現(xiàn)，從油茶林及其附近的植被分離到的炭疽菌均可以侵染油茶，說明不同寄主植物上分離的炭疽菌均可能成為油茶炭疽病的潛在侵染源。綜上表明，暹羅刺盤孢炭疽菌是一種分布廣泛的真菌病害，在高溫高濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)分布更廣，其寄主種類繁多，可以侵染多種植物從而引起植物炭疽病。

李沛利等[12]研究發(fā)現(xiàn)，暹羅刺盤孢菌侵染鵝掌柴葉片時，用砂紙擦拭鵝掌柴葉片更容易致??；劉威[16]在研究茶樹炭疽病時也發(fā)現(xiàn)，暹羅刺盤孢菌通過傷口侵染茶樹葉片。本研究致病性試驗發(fā)現(xiàn)，在造傷接種的情況下，暹羅刺盤孢菌可以成功侵染棕竹。茶樹、鵝掌柴和棕櫚科植物葉片蠟質(zhì)都較厚，這可能是其不容易侵染的原因。由此可見，在棕竹等園林植物栽培過程中，應(yīng)盡量減少機(jī)械損傷和人為傷害，修剪枝葉的工具要經(jīng)常消毒，以減少病菌侵染的幾率和降低病害的流行。

致謝：福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院胡紅莉老師對本研究病原菌測序及鑒定進(jìn)行指導(dǎo)，謹(jǐn)此致謝。