γ-氨基丁酸對雞蛋貯藏性能的影響

姜國川，閆曉慧，譚傳欣，孫洪蕊，張佳霖，劉學軍,*，王麗巖,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林工商學院財稅學院，吉林 長春 130507；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長春 130033；4.吉林省輕工業(yè)設(shè)計研究院，吉林 長春 130021）

雞蛋營養(yǎng)價值較高，其蛋白質(zhì)和氨基酸比例適合人體生理需要[1]，由于其具有高水分、高營養(yǎng)成分，因此在貯藏過程中易品質(zhì)不斷劣化，并導(dǎo)致腐敗[2-4]。延緩雞蛋在貯藏期間的劣化速度以及提高雞蛋品質(zhì)成為研究熱點。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種活性較高的天然氨基酸，主要通過谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸脫羧而產(chǎn)生，具有鎮(zhèn)靜安神、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗疲勞、改善腦機能等多種生理功能，能參與體內(nèi)多種代謝活動[5-6]。2009年我國衛(wèi)生部將GABA確立為新資源食品，GABA在發(fā)酵食品中含量較高，Takeshima等[7]對GABA做了毒性研究評估，結(jié)果表明GABA非常安全，可以作為一種功能性食品。Yang Jiali等[8]在因感染鏈格孢而腐爛的西紅柿中注入不同質(zhì)量濃度的GABA，發(fā)現(xiàn)當GABA質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，其對鏈格孢抑制效果最顯著，原因可能是適宜質(zhì)量濃度的GABA可以激活抗氧化酶，進而導(dǎo)致鏈格孢細胞死亡；同時GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶的關(guān)鍵基因在GABA處理后被上調(diào)，GABA代謝旁路的激活可能在GABA誘導(dǎo)植物免疫的抗性機制中起重要作用。Fait等[9-10]發(fā)現(xiàn)較高水平的GABA可以抑制細菌中hrp基因的表達。此外，GABA在環(huán)境中的應(yīng)激反應(yīng)與GABA的代謝旁路有關(guān)，GABA的代謝旁路在pH值調(diào)節(jié)、氧化還原調(diào)節(jié)、能量產(chǎn)生和維持碳/氮平衡、連接氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)中起作用。Yu Chen[11]、Yu Ting[12]等研究發(fā)現(xiàn)，外源GABA可以通過啟動梨果實的防御反應(yīng)來誘導(dǎo)其對青霉菌的抗性。

目前，國內(nèi)外對GABA的研究多集中于其對食品保健功能特性的影響，有關(guān)外源GABA對貯藏期間雞蛋品質(zhì)影響的研究鮮見報道。綜合以上研究結(jié)果，GABA可以參與蛋白質(zhì)的代謝并具有一定的抑菌性，可以延緩食品的腐敗進程。雞蛋的腐敗變質(zhì)主要由蛋白質(zhì)的變化以及溶菌酶構(gòu)型的改變引起。基于此，本研究擬向雞蛋中注入GABA，以蛋黃指數(shù)、哈夫單位（Haugh units，HU）為評價指標，研究GABA質(zhì)量濃度、貯藏溫度對雞蛋貯藏性能的影響，并對雞蛋貯存期間卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白的含量變化進行分析；從而揭示GABA對雞蛋貯藏性能的影響，旨在為后續(xù)研究改善雞蛋貯藏性以及提高雞蛋品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GABA粉末 自制；GABA標準品、磷酸吡哆醛上海阿拉丁科技股份有限公司；732型強酸型陽離子交換樹脂（Na型）、卵白蛋白（優(yōu)級純）、DEAE-Sepharose-Fast-Flow 北京夢怡美生物科技有限公司；低分子質(zhì)量蛋白Maker、5×蛋白電泳上樣緩沖液、福林-酚試劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京鼎國昌盛生物有限公司；薄層層析板青島海洋公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY04S-3C凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；HD-A電腦采集器、CBS-B程控多功能全自動部分收集器、HD-7電腦高靈敏紫外檢測器 上海青浦滬西儀器廠；1260-6460液相色譜儀 美國安捷倫公司；層析缸上海信誼儀器廠；酶標儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA的制備及純化

采取兩段式發(fā)酵，先在pH 6.2、37 ℃適宜希臘魏斯氏菌Y24條件下培養(yǎng)16 h，將發(fā)酵液離心保留菌體，然后在pH 4.4、45 ℃條件下培養(yǎng)36 h，以積累更多的GABA。參考Tamura等[13]的方法，用離子交換色譜法對希臘魏斯氏菌Y24合成的GABA進行純化，然后收集含有GABA的洗脫液，于60 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至濃縮液體積幾乎不變時停止，趁熱加入100 mL無水乙醇，倒入燒杯中，立即再加入100 mL無水乙醇，不斷搖晃旋蒸瓶以減少損耗，倒入同一燒杯，室溫靜置醇沉24 h，然后抽濾，在干燥瓶內(nèi)于60 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量。

1.3.2 薄層層析法驗證GABA

參考王超凱等[14]的方法，驗證實驗制備的樣品是否為GABA。將薄層板在105 ℃烘箱中活化2 h，以5 g/L GABA標準品作對照，在展開相中展開，當移動至薄層板上端1 cm時取出薄層板，用茚三酮溶液進行噴霧，在80 ℃烘箱中顯色15 min，將出現(xiàn)的紅色斑點與對照組做對比。

1.3.3 GABA純度檢測

應(yīng)用Berthelot比色法測定GABA純度[15]。

1.3.4 實驗分組

將雞蛋用10 mg/g新潔爾滅擦洗干凈后晾干，對接種部位進行一次消毒（體積分數(shù)2%碘酒）和二次消毒（體積分數(shù)75%酒精），用1 mL注射器將100 μL GABA或生理鹽水注射到雞蛋內(nèi)，利用氧化鋅將針眼封住，然后用固體石蠟加固，在不同溫度條件下貯藏14 d。按注射的物質(zhì)將實驗分為2 個對照組和4 個實驗組：對照1（未添加任何物質(zhì)）、對照2（添加生理鹽水）和10、100、1 000、10 000 μg/mL GABA組，探討不同質(zhì)量濃度GABA處理對雞蛋在37 ℃條件下貯藏14 d后新鮮度（HU值和蛋黃指數(shù)）的影響，得到最優(yōu)GABA處理的質(zhì)量濃度。再在最優(yōu)質(zhì)量濃度下，探討貯藏溫度（4、25、37 ℃）對GABA處理組和對照組（添加生理鹽水）雞蛋新鮮度的影響。

1.3.5 HU值、蛋黃指數(shù)的測定

分別參考董曉光[16]、趙美美[17]等的方法測定HU值和蛋黃指數(shù)。首先稱量雞蛋質(zhì)量（m/g），再將雞蛋橫向破殼，將內(nèi)容物置于水平玻璃板上，測量蛋黃邊緣與濃蛋白邊緣的中點高度，即為濃蛋白高度（h/mm），同時測量蛋黃高度及寬度，分別根據(jù)公式（1）、（2）計算樣品的HU值和蛋黃指數(shù)。

1.3.6 蛋清蛋白的分離純化

按照1.3.4節(jié)的實驗方法對雞蛋進行預(yù)處理，研究GABA對貯藏后（貯藏溫度37 ℃、貯藏時間14 d）雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白質(zhì)量濃度的影響。實驗分為100 μg/mL GABA處理組和對照組（添加生理鹽水）。參照麻小娟[18]的方法對蛋清蛋白進行分離純化。純化后蛋白質(zhì)的確定：吸取各峰液體160 μL，加入40 μL 5×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇），沸水浴8 min，于－20 ℃保存?zhèn)溆?。用SDS-PAGE法檢測純化后的蛋白質(zhì)種類。

1.3.7 蛋白質(zhì)量濃度的測定

參照麻小娟[18]的方法，應(yīng)用福林-酚法測定蛋白質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)利用Excel軟件進行處理，利用Origin 8.5.1、Lane 1D軟件作圖，利用Statistic軟件進行HSD顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化后GABA的驗證結(jié)果

將純化后的GABA利用薄層層析法驗證，如圖1所示，純化后的GABA與GABA標準品純度相近。將經(jīng)過732型強酸型陽離子交換樹脂層析柱純化結(jié)晶后的GABA經(jīng)再次溶解后，測得純度為97.51%。

圖1 純化后的GABA與標準品的薄層層析結(jié)果對比Fig. 1 Comparison of thin-layer chromatogr results between purified GABA and standard

2.2 GABA對貯藏期間雞蛋新鮮度的影響

2.2.1 不同GABA質(zhì)量濃度處理對雞蛋新鮮度的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度GABA對雞蛋新鮮度的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of GABA on egg freshness

HU值是衡量雞蛋新鮮度和雞蛋品質(zhì)的重要指標，亦是目前國際上衡量蛋品質(zhì)的常用方法。定義當HU值在60～100時，為新鮮雞蛋；在56～60時，為可食雞蛋；小于40時，為變質(zhì)雞蛋[19]。由圖2可知，對照組1、2的HU值接近60，新鮮程度低。其原因是，鮮雞蛋中濃蛋白占總蛋白質(zhì)量的50%～60%，隨著貯藏時間的延長，濃蛋白會逐漸水樣化，蛋白層之間的比例發(fā)生變化，濃蛋白逐漸變?yōu)橄〉鞍祝瑢?dǎo)致HU值降低[20-21]。隨著GABA質(zhì)量濃度的升高，雞蛋的HU值呈先升高后降低的趨勢，當GABA質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，雞蛋HU值為71.51，顯著高于其他組，此時的雞蛋可以定義為新鮮雞蛋，與Yang Jiali等[8]的實驗結(jié)果一致。當GABA質(zhì)量濃度為10 000 μg/mL時，雞蛋的HU值為52.18，顯著低于兩個對照組，說明10 000 μg/mL GABA會加速雞蛋的腐敗變質(zhì)。因此GABA的代謝可能影響到了蛋清中特定蛋白質(zhì)的代謝，延緩雞蛋腐敗變質(zhì)，低質(zhì)量濃度的GABA對這一特定蛋白質(zhì)的影響較少，而質(zhì)量濃度過高會起到相反作用，加速雞蛋的腐敗變質(zhì)。

蛋黃指數(shù)也是衡量雞蛋品質(zhì)的重要指標之一，蛋黃指數(shù)反映蛋黃的滲透壓和含水量，雞蛋內(nèi)蛋黃膜的弱化和蛋清中的水分向蛋黃遷移導(dǎo)致蛋黃指數(shù)降低[22]。蛋黃指數(shù)大于0.3，定義為新鮮雞蛋；蛋黃指數(shù)大于0.2，定義為合格雞蛋，即蛋黃指數(shù)越大，雞蛋新鮮程度越高。如圖2所示，添加GABA的實驗組蛋黃指數(shù)值均高于2 個對照組，其中2 個對照組雞蛋貯藏后的蛋黃指數(shù)值接近0.2，可接受程度較低。當GABA質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，雞蛋的蛋黃指數(shù)最大，此時的雞蛋可以定義為合格雞蛋。綜上所述，當GABA質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，雞蛋的HU值與蛋黃指數(shù)最高，雞蛋新鮮程度最優(yōu)。因此，選擇此質(zhì)量濃度進行以下實驗。

2.2.2 不同貯藏溫度對雞蛋新鮮度的影響

如圖3A所示，貯藏時間相同時，不同組雞蛋HU值均隨著貯藏溫度的升高而降低。100 μg/mL GABA處理組HU值均高于對照組，在貯藏溫度為4、25、37 ℃時，對照組與實驗組的HU值分別為：85.20、86.91；64.90、72.28；61.83、71.50。Smith等[23]的研究結(jié)果表明，卵白蛋白巰基參與了蛋清稀化的過程；張銀等[24]的研究結(jié)果表明加熱會使卵白蛋白分子內(nèi)α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)化，分子間β-折疊結(jié)構(gòu)的交聯(lián)使分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出疏水基團。實驗組在不同溫度貯藏條件下的HU值均高于對照組，原因可能是貯藏過程中，GABA促進了雞蛋中卵白蛋白的轉(zhuǎn)化，使實驗組卵白蛋白濃度低于對照組。

圖3 貯藏溫度對雞蛋HU值（A）和蛋黃指數(shù)（B）的影響Fig. 3 Effect of storage temperature on Hough unit (A) and yolk index (B) of eggs

如圖3B所示，蛋黃指數(shù)變化趨勢與HU值趨勢相似，隨著貯藏溫度的升高，兩組雞蛋蛋黃指數(shù)均呈現(xiàn)降低的趨勢；但相同貯藏溫度條件下，實驗組的蛋黃指數(shù)均高于對照組，說明100 μg/mL GABA對于改善雞蛋新鮮程度有一定的作用。雞蛋貯藏期間內(nèi)，蛋清內(nèi)的水分逐漸向蛋黃內(nèi)遷移，蛋黃內(nèi)的鹽則向蛋清內(nèi)滲透，導(dǎo)致蛋黃體積不斷增大，蛋黃膜彈性變?nèi)?，當體積進一步增大會形成散蛋黃的現(xiàn)象。高溫有利于促進水分的滲透，從而使蛋黃的滲透壓降低，因此高溫條件下雞蛋的蛋黃指數(shù)下降速率較快[25]。實驗中發(fā)現(xiàn)高溫條件下，樣品產(chǎn)生貼殼現(xiàn)象的比較多；推測高溫對蛋黃破壞性較強烈，可能是高溫促進系帶變細甚至消失，導(dǎo)致蛋黃移位上浮，造成貼殼現(xiàn)象[20]。

2.3 GABA對雞蛋貯藏期間卵轉(zhuǎn)鐵蛋白及卵白蛋白含量的影響

2.3.1 DEAE-Sepharose-Fast-Flow層析結(jié)果

采用DEAE-Sepharose-Fast-Flow陰離子交換層析法對蛋清蛋白進行分離純化，分離時蛋白質(zhì)因帶電荷的不同與樹脂結(jié)合程度不同，因此對蛋清蛋白進行氯化鈉濃度線性梯度洗脫，洗脫曲線如圖4所示。當洗脫液氯化鈉濃度為0 mol/L時，蛋清蛋白洗脫曲線上出現(xiàn)a蛋白峰，當洗脫體積達到100 mL時基線回歸到0，改變洗脫液的離子濃度，將結(jié)合的蛋白質(zhì)逐步洗脫下來。當氯化鈉濃度為0.04 mol/L時，出現(xiàn)b蛋白峰，當氯化鈉濃度為0.06 mol/L時峰值最大，之后緩慢趨于平緩。

圖4 蛋清蛋白DEAE-Sepharose-Fast-Flow層析洗脫曲線Fig. 4 Elution curve of egg white protein by DEAE-Sepharose-Fast-Flow chromatography

2.3.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白及卵白蛋白的SDS-PAGE結(jié)果分析

圖5 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵白蛋白分離純化的SDS-PAGE圖Fig. 5 SDS-PAGE of purified ovotransferrin and ovalbumin

圖5為蛋白分離純化的SDS-PAGE圖。對洗脫曲線的兩個峰利用Lane 1D軟件分析得到a、b峰蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為74、46 kDa，與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白的分子質(zhì)量一致，說明a、b兩峰分別代表卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵白蛋白，與佟平[26]的實驗結(jié)果一致。

2.3.3 GABA對貯藏后雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白及卵白蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖6 GABA對貯藏期間雞蛋中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵白蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig. 6 Effect of GABA on the concentrations of otransferrin and ovalbumin in eggs during storage

如圖6所示，在相同貯藏條件下，100 μg/mL GABA處理組卵轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)量濃度高于對照組，是對照組的1.12 倍。其原因可能是GABA促進了卵白蛋白向卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)化，并且溫度越高卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵后氫鍵作用越強，對熱的抵抗性越強[27]。

卵白蛋白質(zhì)量占蛋清蛋白質(zhì)量的54%～63%，是雞蛋中主要致敏原之一。在相同貯藏條件下，實驗組的卵白蛋白質(zhì)量濃度低于對照組，僅為對照組的39%。綜上所述，GABA對雞蛋貯藏期間卵白蛋白質(zhì)量濃度以及卵轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)量濃度的變化有明顯影響。GABA的添加有助于貯藏期間卵白蛋白向卵轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)化，使卵轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)量濃度較對照組高，而卵白蛋白質(zhì)量濃度較對照組低。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種糖蛋白，在鐵的螯合及運輸過程中起關(guān)鍵作用，同時具有抗炎活性[28]。Kobayashi等[29]研究表明，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以減輕小鼠經(jīng)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀。Wang Xiong等[30]通過模擬肽切割使用腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的Caco-2細胞炎癥的體外模型來評估卵轉(zhuǎn)鐵蛋白及其二肽的抗炎作用，結(jié)果表明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白衍生二肽通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號途徑發(fā)揮其抗炎活性。因此，GABA的添加有利于提高雞蛋貯藏期間的品質(zhì)。

3 討 論

貯藏期間雞蛋蛋清蛋白濃度與雞蛋品質(zhì)的變化關(guān)系是揭示雞蛋品質(zhì)變化的本質(zhì)因素。卵白蛋白與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是蛋清蛋白的重要組成部分。Alleoni等[31]的研究結(jié)果表明，經(jīng)6 個月的貯藏，雞蛋卵白蛋白相對含量顯著升高。付丹丹等[32]對貯藏期間卵白蛋白相對質(zhì)量濃度與雞蛋新鮮度指標之間的相關(guān)性進行分析，研究結(jié)果表明，雞蛋蛋黃指數(shù)、HU值與卵白蛋白質(zhì)量濃度之間呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)。金永國[27]、鄭彩燕[33]等研究表明，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是蛋清中的主要抗菌蛋白，能夠抑制蛋中的微生物生長，對雞蛋品質(zhì)的保持起著積極的作用。本實驗對雞蛋貯藏期間卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白兩個蛋白組分進行研究，以期明確GABA處理對貯藏期間這兩個蛋清蛋白組分質(zhì)量濃度以及雞蛋品質(zhì)的影響。雞蛋在貯藏期間新鮮度降低，蛋清稀化，導(dǎo)致HU值與蛋黃指數(shù)下降。貯藏期間雞蛋品質(zhì)的惡化主要是由蛋白質(zhì)、溶菌酶構(gòu)型變化[34]以及微生物增殖引起的。100 μg/mL GABA實驗組的雞蛋HU值、蛋黃指數(shù)高于對照組（未添加任何物質(zhì)以及生理鹽水組），卵轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)量濃度高于對照組（生理鹽水組），卵白蛋白質(zhì)量濃度低于對照組（生理鹽水組），原因可能是GABA代謝旁路參與了三羧酸循環(huán)[35]，影響到蛋清中蛋白質(zhì)的代謝，進而促進卵白蛋白向卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)化，抑制溶菌酶構(gòu)型的改變以及細菌的表達[8-12]，進而延緩雞蛋的腐敗進程。

4 結(jié) 論

本實驗研究了GABA對雞蛋貯藏性能的影響，通過比較不同質(zhì)量濃度GABA處理雞蛋貯藏后新鮮度指標，篩選出最優(yōu)GABA質(zhì)量濃度。在此基礎(chǔ)上，探討貯藏溫度對最優(yōu)GABA處理組和對照組（添加生理鹽水）雞蛋新鮮度的影響以及GABA對雞蛋在37 ℃條件下貯藏14 d后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白質(zhì)量濃度的影響。研究結(jié)果表明：GABA的添加可以提高雞蛋貯藏后的HU值、蛋黃指數(shù)以及卵轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)量濃度，降低卵白蛋白質(zhì)量濃度。因此，GABA能夠提高雞蛋的新鮮度，延緩蛋白質(zhì)在貯藏過程中的變化，可以應(yīng)用到其他食物中來減緩變質(zhì)現(xiàn)象，或應(yīng)用到飼料中提高雞蛋品質(zhì)。