白藜蘆醇對(duì)衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制

張賢益，宋也好，李 露，尹術(shù)華，付王威，吳睿婷，潘 猛，吳文英，湯小芳，李文娟*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

衰老是一種由多因素決定的涉及多器官的自然生理過程，而腦衰老是機(jī)體衰老過程中常見的生理現(xiàn)象，其在機(jī)體健康與疾病的平衡中扮演著重要角色[1-2]。近年來，由于機(jī)體衰老而導(dǎo)致的腦疾病發(fā)病率逐年升高，而我國老齡人口數(shù)量龐大，截至2014年底我國60 歲及以上人口約占總?cè)丝诘?6%，老年群體的腦衰老疾病給我國經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)[3]，因此，加強(qiáng)對(duì)腦衰老的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）即3,4',5-三羥基反式二苯乙烯，是一種具有順、反2 種結(jié)構(gòu)的非黃酮類植物多酚[4]，其主要存在于葡萄、花生、桑樹等植物中，因具有抗衰老、抗氧化、抗癌等多種重要活性而成為研究熱點(diǎn)[5-6]。腦神經(jīng)細(xì)胞是組成腦神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單位，其正常的生長、發(fā)育、分化是維持大腦功能的基礎(chǔ)[7]；而在機(jī)體衰老過程中，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡會(huì)日益增加，導(dǎo)致線粒體功能紊亂。Brenowitz等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中活性氧（reactive oxygen species，ROS）會(huì)過度積累，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）顯著降低，此變化標(biāo)志著線粒體功能損傷明顯[9]；Guo Xiaoqian等[10]發(fā)現(xiàn)，損傷的線粒體在機(jī)體衰老過程中會(huì)通過Bcl-2家族成員促進(jìn)凋亡因子釋放來加速細(xì)胞凋亡和機(jī)體衰老；Geng Huixia等[11]發(fā)現(xiàn)線粒體在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中通過釋放細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）與凋亡蛋白誘導(dǎo)因子pro-Caspase-9等結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，促進(jìn)Caspase家族蛋白酶活化，弱化線粒體功能，促使腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12-13]，最終導(dǎo)致腦記憶減退、神經(jīng)衰弱，甚至誘使機(jī)體發(fā)展成阿爾茨海默病等相關(guān)疾病[14]。因此，加強(qiáng)對(duì)RSV的腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用研究具有重要意義。本研究利用D-半乳糖（D-galactose，D-gal）建立小鼠衰老模型[15]，檢測RSV對(duì)小鼠體質(zhì)量、腦器官指數(shù)、腦記憶水平、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、ROS水平、MMP變化、線粒體Caspase-9和Caspase-3活力、線粒體Cyt c和胞漿Cyt c表達(dá)情況的影響，探究RSV是否通過線粒體機(jī)制對(duì)衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

BALB/c清潔級(jí)小鼠60 只，雌雄不拘，6～8 周，體質(zhì)量（30±2）g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（贛）2006-0001。

D-gal、RSV、羅丹明123 美國Sigma公司；2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（2',7'-dichlorofluorescein dilacerate，DCFH-DA） 美國Molecular Probes公司；Cyt c抗體美國BD Pharmingen公司；Annexin V試劑盒（含碘化丙啶（propidium iodide，PI）） 法國國際免疫公司；Caspase-3、Caspase-9試劑盒 美國BioVision公司；生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Mettler Toledo AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；3K15冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀 美國Becton Dickinson公司；－80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Scientific公司；超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、模型建立、RSV處理

實(shí)驗(yàn)條件及分組：小鼠于18～22 ℃、相對(duì)濕度50%～60%條件下飼養(yǎng)，12 h晝夜交替，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格遵守動(dòng)物管理?xiàng)l例和倫理委員會(huì)鑒定許可，墊料、飼料、飲水均符合使用標(biāo)準(zhǔn)。小鼠按照體質(zhì)量均分為5 組：Control組、D-gal組、D-gal＋RSV（6.25）組、D-gal＋RSV（12.5）組、D-gal＋RSV（25）組。每組12 只，編號(hào)。

模型建立：除Control組外，其他各組每日按100 mg/kg mb腹腔注射D-gal，Control組按相同劑量注射生理鹽水，持續(xù)10 周，建立小鼠衰老模型。

RSV處理：從第7周開始，3 個(gè)RSV處理組分別按6.25、12.50、25.00 mg/kg mb灌胃RSV，其他組按100 mg/kg mb灌胃生理鹽水，持續(xù)4 周，第10周結(jié)束后處死小鼠。

1.3.2 腦神經(jīng)細(xì)胞的制備

參照文獻(xiàn)[16]的方法。無菌摘除小鼠大腦置于預(yù)冷的生理鹽水中，分離大腦皮質(zhì)，稱質(zhì)量，將大腦皮質(zhì)剪碎，于37 ℃條件下加入1.25 mg/mL胰酶消化8 min，胎牛血清終止消化；接著采用全培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，再將細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，再分別加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，同時(shí)在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞濃度不超過5×105個(gè)/mL，每日換液以維持細(xì)胞良好狀態(tài)，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 指標(biāo)檢測

腦器官指數(shù)：取出小鼠腦組織用生理鹽水清洗后并稱質(zhì)量。腦器官指數(shù)按下式計(jì)算。

記憶水平：參照Morris等[17]的方法，采用圓形水池和隱藏平臺(tái)制成簡易水迷宮。實(shí)驗(yàn)中水面高出平臺(tái)約1 cm，水溫為（22.0±0.5）℃，將水染成黑色以隱藏平臺(tái)。將小鼠放入水池中自由游泳，記錄120 s內(nèi)小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間；如果120 s內(nèi)小鼠未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)并停留20 s以加強(qiáng)記憶，每天訓(xùn)練4 次，共訓(xùn)練4 d，第5、6天撤去平臺(tái)，記錄120 s內(nèi)小鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)以評(píng)價(jià)RSV對(duì)衰老小鼠記憶水平的影響。

細(xì)胞凋亡率[18]：在室溫下加入250 μL 1.25 mg/mL胰酶處理神經(jīng)細(xì)胞，10 min后用DMEM培養(yǎng)基終止消化，收集神經(jīng)細(xì)胞于離心管，2 000 r/min離心5 min，收集沉淀細(xì)胞，PBS洗滌2 次，加入適量胰蛋白酶抑制劑和RNA酶緩沖液，在室溫下反應(yīng)10 min；然后加入Annexin V和PI染色液各5 μL，避光反應(yīng)5 min，冰浴10 min，在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行測定。

細(xì)胞R O S水平：以2',7'-二氯熒光素（2',7'-dichlorofluorescein，DCF）的熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表明ROS水平越高[19]。以DCFH-DA作為ROS特異熒光探針并檢測其水平。取1.3.2節(jié)生長狀況良好的神經(jīng)細(xì)胞加入0.5 mL 20 μmol/L DCFH-DA，在37 ℃、避光條件下孵育，20 min后移去培養(yǎng)基，PBS漂洗細(xì)胞3 次，在激發(fā)光波長525 nm下使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

細(xì)胞MMP：根據(jù)線粒體攝取Rho123熒光染料后可發(fā)出綠色熒光，其強(qiáng)度與MMP成正相關(guān)的工作原理[20]，取1.3.2節(jié)生長狀況良好的細(xì)胞，用含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化，并用PBS漂洗2～3 次制成細(xì)胞懸液，在4 ℃、1 500 r/min條件下離心10 min，再避光加入0.5 mL 5 mg/L Rho123染液置于培養(yǎng)箱中染色30 min，PBS漂洗1 次；在4 ℃、1 500 r/min條件下離心10 min，過200 目尼龍濾網(wǎng)，使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm條件下檢測Rho123的熒光強(qiáng)度。

細(xì)胞Caspase-9和Caspase-3活力：嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定Caspase-3和Caspase-9活力。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×105～5×105個(gè)/mL，冰浴10 min，1 000 r/min離心1 min后測定蛋白質(zhì)濃度，加入50 μL細(xì)胞裂解液將蛋白樣品稀釋至100 μL，每個(gè)樣品中分別加入2×緩沖液（50 μL）和4 mmol/L LEHD-pNA底物（5 μL），再于37 ℃溫育1 h。同時(shí)，將未誘導(dǎo)的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照組，通過比較RSV處理組與Control組水平以測定Caspase-9和Caspase-3活力。

Western blotting法檢測Cyt c表達(dá)：取待用細(xì)胞懸液，PBS漂洗3 次，按體積比1∶8加入勻漿液進(jìn)行勻漿，在4 ℃、1 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，繼續(xù)取上清液，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，分裝上清液，進(jìn)行凍存[21]。按照Bradford法測定蛋白質(zhì)量濃度，再嚴(yán)格按照Western blotting方法配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%分離膠、3%濃縮膠，于每個(gè)上樣孔中加入20 μg蛋白樣品，在150 V電壓下電泳30 min；再在100 V電壓下分別電轉(zhuǎn)移15、30、60、90、120 min，將硝酸纖維素膜浸入1%麗春紅溶液中顯色3 min后用蒸餾水沖洗；最后將膜浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% Tween 20、5%脫脂乳粉中封閉1 h，加入按1∶300體積比稀釋的Cyt c抗體，4 ℃孵育過夜，用TBST（Tris buffered saline Tween）洗膜3 次后加入按1∶2 000體積比稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3 次后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）顯色[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 RSV對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表1 RSV對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of RSV on body mass in mice

體質(zhì)量是機(jī)體生長發(fā)育的一個(gè)重要指標(biāo)，其變化能反映小鼠的生長情況。實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)每周相同時(shí)間稱量并記錄一次小鼠體質(zhì)量。由表1可知，各組小鼠在實(shí)驗(yàn)初期的平均體質(zhì)量基本相同，組間無顯著差異（P＞0.05），在第7周進(jìn)行RSV灌胃后，由于灌胃操作可能會(huì)對(duì)胃腸黏膜造成損害，導(dǎo)致小鼠食欲低下，體質(zhì)量短時(shí)間內(nèi)小幅下降，適應(yīng)本操作后小鼠體質(zhì)量又有所增長，說明RSV的劑量在本實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未對(duì)小鼠體質(zhì)量造成影響，不影響實(shí)驗(yàn)小鼠的正常生長發(fā)育。

2.2 RSV對(duì)小鼠腦器官指數(shù)的影響

表2 RSV對(duì)小鼠腦器官指數(shù)的影響Table 2 Effect of RSV on brain index in mice

腦器官指數(shù)能反應(yīng)腦組織的健康狀況，與腦組織的健康程度呈正相關(guān)。由表2可知，與Control組相比，D-gal組小鼠腦器官指數(shù)明顯減小，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明D-gal對(duì)小鼠腦組織造成明顯損傷。而與D-gal組相比，RSV處理組腦器官指數(shù)均有不同程度的提高，其中D-gal＋RSV（25）組效果最為明顯，與D-gal組具有顯著性差異（P＜0.05）。此結(jié)果表明RSV能提高D-gal致衰老小鼠的腦器官指數(shù)，對(duì)腦組織具有保護(hù)作用。

2.3 RSV對(duì)小鼠記憶水平的影響

表3 RSV對(duì)小鼠穿越隱藏平臺(tái)次數(shù)的影響Table 3 The effect of RSV on the number of crossing platform in mice

由表3可知，與Control組相比，D-gal組小鼠穿越隱藏平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，表明D-gal能使小鼠記憶水平降低，損傷記憶功能；與D-gal組相比，RSV處理組小鼠穿越隱藏平臺(tái)次數(shù)均有所提高，但無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果表明RSV在一定程度上能提高D-gal致衰老小鼠的記憶水平，改善記憶功能。

2.4 RSV對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡的影響

圖1 RSV對(duì)D-gal誘導(dǎo)小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響Fig. 1 Effect of RSV on D-gal-induced apoptosis of cerebral cortical neurons in mice

由圖1可知，與Control組相比，D-gal組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率由3.66%增加至37.99%，存在極顯著差異（P＜0.01），說明D-gal引起腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯，所造衰老模型成功。而與D-gal組相比，RSV處理組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別降至28.32%、21.38%、18.56%，均有極顯著差異（P＜0.01），且抑制效果與RSV劑量呈正相關(guān)，表明RSV對(duì)D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

2.5 RSV對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞ROS水平的影響

由圖2可知，與Control組相比，D-gal組DCF熒光強(qiáng)度由105.64±5.20增加至155.88±13.77，差異極顯著（P＜0.01），說明D-gal組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞ROS積累明顯；而與D-gal組相比，D-gal＋RSV（6.25）、D-gal＋RSV（12.5）、D-gal＋RSV（25）組DCF熒光強(qiáng)度分別減至121.48±9.35、92.56±8.71、87.67±15.43，均有極顯著差異性（P＜0.01），且其DCF熒光強(qiáng)度與RSV呈劑量依賴性相關(guān)，表明RSV能夠有效抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中ROS的積累。

圖2 RSV對(duì)D-gal誘導(dǎo)小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞ROS相對(duì)含量的影響Fig. 2 Effect of RSV on ROS production in cerebral cortical neurons of aging mice induced by D-gal

2.6 RSV對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞MMP的影響

圖3 RSV對(duì)D-gal誘導(dǎo)小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig. 3 Effect of RSV on MMP in cerebral cortical neurons of aging mice induced by D-gal

由圖3可知，Control組Rho123熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，而D-gal組Rho123熒光強(qiáng)度最弱，兩者之間具有極顯著性差異（P＜0.01），結(jié)果顯示D-gal能使小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞MMP極顯著降低，造成線粒體損傷。而與D-gal組相比，D-gal＋RSV（6.25）、D-gal＋RSV（12.5）、D-gal＋RSV（25）組Rho123熒光強(qiáng)度均有極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），且MMP的增強(qiáng)效果與RSV劑量呈正相關(guān)。此結(jié)果說明RSV可促進(jìn)D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞MMP增強(qiáng)，對(duì)線粒體具有保護(hù)作用。

2.7 RSV對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響

由圖4可知，與Control組相比，D-gal組線粒體Cyt c表達(dá)下降，胞漿Cyt c表達(dá)增強(qiáng)；而與D-gal組相比，RSV處理組線粒體Cyt c表達(dá)均增強(qiáng)，胞漿Cyt c表達(dá)均降低；表明RSV可顯著促進(jìn)D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中線粒體Cyt c的表達(dá)，抑制胞漿Cyt c的表達(dá)。

另一方面，與Control組相比，D-gal組線粒體中Caspase-9和Caspase-3活力極顯著上升（P＜0.01）；表明D-gal組Caspase家族蛋白酶已被活化。而與D-gal組相比，RSV處理組中Caspase-9和Caspase-3活力均極顯著降低（P＜0.01），且與RSV劑量呈正相關(guān)。說明RSV可有效抑制腦神經(jīng)細(xì)胞中Caspase-9和Caspase-3活化，對(duì)線粒體產(chǎn)生保護(hù)作用，從而有效抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

圖4 RSV對(duì)D-gal誘導(dǎo)小鼠腦神經(jīng)Cyt c表達(dá)及對(duì)Caspase-9和Caspase-3活力的影響Fig. 4 Effect of RSV on the expression of cytochrome c and the activity of caspase-9 and caspase-3 in cerebral cortex of D-gal-induced aging mice

綜上可知，對(duì)D-gal致衰老小鼠灌胃RSV 4 周后，RSV能抑制D-gal引起的線粒體凋亡通路相關(guān)參數(shù)Cyt c表達(dá)和Caspase-3、Caspase-9活力的變化，表明RSV通過線粒體通路來抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

3 討 論

機(jī)體在衰老過程中易引起線粒體功能損傷、代謝紊亂、自由基過剩等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因細(xì)胞凋亡與機(jī)體衰老過程中組織、器官功能的退化以及老年癡呆等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，所以細(xì)胞凋亡會(huì)加速機(jī)體衰老，因此神經(jīng)細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致機(jī)體衰老的一個(gè)重要因素[23-24]。神經(jīng)細(xì)胞是組成神經(jīng)系統(tǒng)基本單位，在機(jī)體衰老過程中，腦神經(jīng)細(xì)胞逐漸發(fā)生壞死或凋亡，從而出現(xiàn)記憶損傷、意識(shí)模糊等病癥[25]。D-gal致衰老模型是指對(duì)動(dòng)物長期注射適宜劑量D-gal使其產(chǎn)生一系列與衰老相關(guān)的病理過程。本研究通過連續(xù)10 周腹腔注射D-gal建立小鼠衰老模型，再對(duì)小鼠灌胃不同劑量的RSV并以腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡作為研究重點(diǎn)，探究RSV對(duì)衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及線粒體機(jī)制[26]。

結(jié)果顯示，與Control組相比，D-gal組腦器官指數(shù)顯著減?。≒＜0.05），記憶能力有所降低，但無顯著差異（P＞0.05），腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率極顯著增加（P＜0.01），表明實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)D-gal能加速小鼠腦損傷，促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡。而經(jīng)RSV處理4 周后，與D-gal組相比，RSV 3 個(gè)劑量組中腦器官指數(shù)增大，其中D-gal＋RSV（25）組效果最明顯（P＜0.05）；記憶能力均有增強(qiáng)，但無顯著差異（P＞0.05）；神經(jīng)細(xì)胞凋亡率極顯著降低（P＜0.01），表明RSV能有效保護(hù)腦組織，抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。在RSV的線粒體作用通路研究中，利用流式細(xì)胞儀檢測DCF和Rho123的熒光強(qiáng)度，測定腦神經(jīng)細(xì)胞ROS水平和MMP的變化，結(jié)果顯示，與Control組相比，D-gal組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞ROS積累極顯著增加（P＜0.01），MMP極顯著降低（P ＜0.01），表明D-gal加速了腦神經(jīng)細(xì)胞損傷；而與D-gal組相比，RSV 3 個(gè)劑量組中ROS水平均極顯著降低（P＜0.01），MMP均極顯著增加（P＜0.01），結(jié)果表明RSV能抑制ROS積累，提高M(jìn)MP，對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，此結(jié)果與Baar等[27]研究結(jié)果一致。在細(xì)胞凋亡過程中，先出現(xiàn)MMP下降，再發(fā)生胞膜磷脂酰絲氨酸由內(nèi)而外的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致Caspase家族成員被激活，其也是細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)[28]，且當(dāng)膜電位下降時(shí)，細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)，因此MMP下降也是細(xì)胞凋亡的特征表現(xiàn)，此結(jié)果與Sung等[29]的研究結(jié)果一致。

與Control組相比，D-gal組線粒體Cyt c表達(dá)下降，胞漿Cyt c表達(dá)增強(qiáng)；而與D-gal組相比，RSV 3 個(gè)劑量組線粒體Cyt c表達(dá)回升，胞漿Cyt c表達(dá)降低，結(jié)果提示RSV可顯著抑制D-gal致衰老小鼠神經(jīng)細(xì)胞中Cyt c的表達(dá)，與Pradelli等[23]研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白促使線粒體損傷，而損傷的線粒體通過Cyt c誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究顯示，活化的Caspase-9和Caspase-3均會(huì)參與到細(xì)胞凋亡的過程中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。本研究檢測了Caspase-9和Caspase-3活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Control組相比，D-gal組線粒體Caspase-9和Caspase-3活力極顯著上升（P＜0.01）；而與D-gal組相比，RSV 3 個(gè)劑量組中Caspase-9和Caspase-3活力呈劑量依賴性極顯著降低（P＜0.01），表明RSV可抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中Caspase-9和Caspase-3活性的升高。本研究中線粒體凋亡信號(hào)通路中3 個(gè)參數(shù)均發(fā)生變化，提示RSV可能通過調(diào)控線粒體通路來抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上可知，RSV能明顯抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，提高小鼠腦器官指數(shù)和記憶水平，極顯著降低細(xì)胞凋亡率、抑制ROS積累、提高M(jìn)MP，說明RSV對(duì)D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生了保護(hù)作用；而RSV又能提高線粒體Cyt c表達(dá)，抑制胞漿Cyt c表達(dá)，極顯著降低Caspase-9和Caspase-3活力，說明線粒體通路介導(dǎo)了RSV對(duì)D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。