薰衣草精油微乳體系的相行為、微觀結構轉變和清除自由基活性

宋曉秋，王麗萍，孫 月，李帥濤，張 芊，葉 琳，楊曉波，王一非*

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

隨著國家越來越嚴格地限制使用各類化學合成添加劑，食品行業(yè)對天然生物活性物質的需求日趨增加。植物精油作為提取自芳香植物的次生代謝產物，被廣泛應用于食品行業(yè)[1]。其中，薰衣草精油具有鎮(zhèn)靜安神、抗氧化、抗菌、抗炎癥和止痛等多種生物活性[2]。但是，精油具有疏水性質，限制了其在食品中的應用[3]，因此需要發(fā)展一種有效的載運體系，以提升薰衣草精油的使用性能。

微乳液是一種由一定配比的表面活性劑、助表面活性劑、水和油自發(fā)形成的各向同性、外觀透明或半透明、熱力學穩(wěn)定的分散體系，具有提高油性物質親水性和抗氧化性的作用[4]。對單相微乳液而言，根據油或者水作為分散相的情況，將微乳液劃分為O/W型、W/O型和雙連續(xù)型3 種[5]。近期研究顯示，微乳體系對活性物質的保護作用與相行為有一定關聯。Deng Lingli等[6]發(fā)現百里香酚微乳液從W/O到雙連續(xù)再到O/W型的過程中，隨著水相的增加，抗氧化性提升而抑菌性下降。同時，植物精油微乳液的清除自由基活性與體系中的表面活性劑、助表面活性劑濃度有關。Kim等[7]發(fā)現在茶樹精油微乳液中，蔗糖月桂酸酯為表面活性劑和丙二醇為助表面活性劑的配方對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除起到負面作用。由此可見，微乳體系能夠實現植物精油的增溶與增效，但需要進一步深入研究其微觀結構轉變與精油活性成分之間的關系。

本實驗以Tween-80作為非離子型表面活性劑，二丙二醇（dipropylene glycol，DPG）為助表面活性劑，構建可以無限稀釋的薰衣草微乳體系；通過對染料擴散實驗和電導率及黏度的測定，分析其微觀結構轉變；通過對DPPH自由基和2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率的測定，研究微乳結構轉變對抗氧化性能的影響，從而為植物精油微乳體系在食品中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薰衣草精油（lavender essential oil，LO） 新疆生產建設兵團第十四師47團；Tween-80、DPG、氯化鈉、蘇丹III、DPPH和乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；ABTS試劑盒 碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

PL 403電子天平、手動移液器（100 μL） 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DDB-303A電導率儀 上海電子科技儀器有限公司；DV-I布氏黏度計 美國博勒飛公司；JA-2003電子天平 上海天龍儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微乳體系的構建

采用滴水法，將油相（m（薰衣草精油）∶m（DPG）=1∶1）和表面活性劑（Tween-80）按照一定質量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）混合，水浴振蕩至均勻后，間隔滴加蒸餾水，振蕩，待其恢復澄清透明狀態(tài)，渾濁時停止加水并記錄加水總量。按照臨界點油相、表面活性劑相和水相所占比例，借助Origin Pro 9.1軟件繪制出對應的三元相圖，通過三元相圖能夠較為直觀地了解助表面活性劑對（微乳區(qū)）面積的影響[8]，從而確定微乳單相區(qū)，計算出微乳單相區(qū)占三元相圖總面積的比例。

1.3.2 微乳體系微觀結構測定

染色法：選取油溶性染料蘇丹III（1.0 g/L），分別等量滴加于水分質量分數不同的微乳液試管中，輕微搖晃，觀察顏色的擴散現象[9]。

電導率法：在體系中添加少量的NaCl（0.01 mol/L）作為電解質[10]，于25 ℃條件下進行電導率的測定。電解質在體系中跟隨水相流動，因此能夠間接反映水相的行為變化。

黏度的測定：測試采用LV-01（61）轉子，所有樣品均以固定的轉速5 r/min進行測試，測試結果單位用cP表示[11]。

1.3.3 微乳體系抗氧化能力測定

DPPH自由基清除率法：參考Deng Lingli[6]和Kim[7]等的方法測定DPPH自由基清除率，將2.0 mL微乳液與100 μL 2.0 mmol/L的DPPH乙醇溶液振蕩混合搖勻，25 ℃下靜置90 min（避光保存）。以等量（2.0 mL）乙醇代替微乳液作為空白。根據公式（1）計算DPPH自由基的清除率。

式中：Ab為空白溶液吸光度；As為測試樣品溶液吸光度。

使用ABTS試劑盒測定ABTS陽離子自由基清除率。將微乳液樣品（10 μL）與新鮮配制的ABTS溶液（200 μL），黑暗中孵化12～16 h后，將該混合物在25 ℃條件下振蕩10 min，在734 nm波長處測定其吸光度。根據公式（2）計算ABTS陽離子自由基的清除率。

式中：Ab為空白溶液吸光度；As為測試樣品溶液吸光度。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

理化指標表征實驗重復1 次，每次處理3 個平行。三元相圖采用Origin Pro 9.1軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 DPG對薰衣草微乳體系的增溶作用

圖1 薰衣草-DPG微乳體系在25 ℃時的三元相圖Fig. 1 Ternary phase diagrams of systems at 25 ℃

短鏈醇常作為助表面活性劑用于微乳體系的構建[12]。本實驗將DPG與薰衣草精油（1∶1，m/m）為油相構建三元相圖，結果如圖1所示。圖1中的陰影區(qū)域代表渾濁區(qū)，白色區(qū)域代表單相區(qū)（即微乳液形成區(qū)域）。DPG作為助表面活性劑時，單相區(qū)面積（Am）由單一薰衣草精油微乳液時的34.1%增大到71.4%，對薰衣草精油微乳液具有明顯的增溶效果。影響表面活性劑界面行為的3 個因素是界面張力、自發(fā)曲率和彎曲剛度。在微乳液中，多元醇能夠降低油相和水相界面之間的界面張力[13-14]。在已報道的一些植物精油及其主要成分的非離子型微乳體系中，乙醇、1,2-丙二醇等常見短鏈醇作為助表面活性劑添加到油相中，油/醇質量比為1∶1時，單相區(qū)面積一般在40%～50%范圍內[6,15]。本研究發(fā)現DPG對薰衣草精油具有增溶作用。推測DPG的碳鏈長度和羥基位置利于其嵌入界面改變基團的極性，從而使界面膜自發(fā)曲率的發(fā)生更利于微乳液的形成[16]。因此，選擇薰衣草-DPG微乳體系無限稀釋線D82中水分體積分數不同的體系，進行后續(xù)微觀相行為轉變和抗氧化性研究。

2.2 微乳體系類型鑒定及微觀結構的轉變

通過觀察油溶性染料蘇丹III在不同水分體積分數薰衣草-DPG微乳體系中的擴散狀態(tài)，可以直觀判斷微乳液類型。當蘇丹III在微乳液中擴散非常均勻時，說明微乳液為W/O型；反之，若蘇丹III浮于微乳液表面，則說明其為O/W型；若狀態(tài)介于兩者之間，則為雙連續(xù)型微乳液[17]。

在無限稀釋線D82上分別取水分體積分數為0%～90%的微乳體系進行蘇丹III擴散實驗，可以發(fā)現油溶性染料能夠完全擴散在水分體積分數為0%～30%的微乳體系中（圖2），且完全不溶解于水分體積分數為60%～90%的微乳體系。說明當水分體積分數為0%～30%時該薰衣草-DPG微乳體系為W/O型微乳體系，水分體積分數在40%～50%之間為雙連續(xù)型，水分體積分數超過60%時其微觀結構轉變?yōu)镺/W型。

電導率測定結果與染色法結果一致。隨著水分體積分數增加，微乳體系的電導率變化總體呈現出不斷上升的趨勢。當水分體積分數為0%～30%時，微乳液的電導率較小，這是由于水分子被反向膠束所束縛，分散于油相中，水分子之間不能相互作用，符合W/O型的特征[18]。當水分體積分數繼續(xù)增加時，微乳體系結構從W/O型轉變?yōu)殡p連續(xù)相，電導率的增幅最大。在該階段，反向膨脹的膠束被緩慢地扭曲，水分子變得更具有流動性，在水分子液滴碰撞之間的流動水通道產生滲流狀態(tài)，因此電導率增加最快[19]。當水分體積分數大于60%時，微乳體系結構轉變?yōu)镺/W，電導率持續(xù)升高，說明更多的或全部水分子脫離了反向膠束的束縛，分子間相互碰撞也更加劇烈[20]。另外觀察到O/W階段電導率的增加速率略低于雙連續(xù)階段，可能與水分子流動性的增加和純水稀釋效應有關[7,21]。

圖2 不同水分體積分數的微乳體系電導率Fig. 2 Electrical conductivity of microemulsion systems with different water contents

2.3 微觀結構轉變對微乳體系黏度的影響

微乳液作為抗氧化復合載體應用到具體產品中時，黏度是重要的物理參數。微乳液的宏觀黏度會受到微觀結構的影響[22-23]。圖3為薰衣草-DPG微乳體系黏度變化趨勢，可以看出該體系是“鐘型”曲線[10,24]。在水分體積分數0%～30%區(qū)間，黏度很低且變化小，這可能取決于W/O結構[24]。當水分體積分數從40%增加到50%，黏度上升速率顯著加快。這一階段雙連續(xù)結構形成，界面面積逐漸增加，界面之間相互作用也更加頻繁，水-油通道的聚集和相互連接在宏觀上表現為微乳體系黏度的不斷增加[25]。隨著水分體積分數的繼續(xù)增加，最大黏度出現在水分體積分數為50%左右，正是微乳體系由雙連續(xù)相到O/W體系的轉變點。Sharma等[26]的研究表明，六方相存在于水分體積分數為30%～47%的水溶液中。Bonacucina等[27]研究了Tween-80/肉豆蔻酸異丙酯（9∶1，m/m）的微乳體系，當體系水分體積分數為20%～60%時，發(fā)現有類似凝膠結構的形成。由此推測，薰衣草-DPG微乳體系中雙連續(xù)相高黏度現象可能是六方相或棒狀結構膠束的形成所導致的，此時形成的膠束體積和單個膠束表面積均較大，導致膠束之間相互作用面積及相互作用力更大。當進一步提高體系的水分體積分數使其轉變?yōu)镺/W型時，常規(guī)球狀膠束形成，破壞了棒狀或者六方相結構的膠束結構，降低了膠束之間的相互作用以及它們之間相互碰撞的概率，從而出現黏度急劇下降的現象[6]。

圖3 不同水分體積分數的微乳體系黏度變化Fig. 3 Viscosity change of microemulsion systems with different water contents

2.4 微乳體系微觀結構對自由基清除能力的影響

2.4.1 DPPH自由基清除活性

圖4 不同水分體積分數的微乳體系DPPH自由基清除率Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of microemulsion systems with different water contents

DPPH自由基清除能力常作為檢測物質抗氧化活性的指標。由圖4可知，當微乳體系為W/O型和雙連續(xù)相時，隨著水分體積分數的增加，D82微乳體系DPPH自由基清除率快速提高。當水分體積分數提高到50%時，DPPH自由基清除率達到70%左右。但是，隨著水分體積分數繼續(xù)增加，體系結構由雙連續(xù)結構轉變?yōu)镺/W結構，DPPH自由基清除率基本保持不變。

在薰衣草-DPG微乳體系D82的W/O階段，水相被油相所束縛，包埋在反向膠束內，存在于體系中的多余表面活性劑膠束在反向膠束界面形成保護層，阻礙油相薰衣草油滴與DPPH自由基間的相互接觸和作用；因此隨著體系水分體積分數的升高，反膠束流動性提高，表現為DPPH自由基清除率快速提高。但是到了O/W階段，相同的反應體積內薰衣草精油含量進一步降低，而DPPH自由基清除能力維持不變，這可能是隨著結構的轉變，逐步增加的自由水加速了自由基反應所致[28]。

2.4.2 ABTS陽離子自由基清除活性

ABTS陽離子自由基清除實驗是可以同時評價脂溶性和水溶性物質抗氧化活性的方法[29]。圖5反映了D82體系在734 nm波長處ABTS陽離子自由基脫色程度，即微乳液樣品的總抗氧化能力[30]。從圖5可以看出，當水分體積分數為0%～50%時，ABTS陽離子自由基清除率總體呈下降趨勢。說明當微乳液在W/O型和雙連續(xù)型的階段，其ABTS陽離子自由基清除作用取決于精油的劑量[31]。在O/W型階段，ABTS自由基的清除率隨著水分體積分數的增加發(fā)生明顯變化，在水分體積分數為70%時出現峰值，清除率達63%，與水分體積分數為0%的體系清除率基本相同。薰衣草精油的主要成分是芳樟醇、乙酸芳樟酯、1,8-桉葉油素、羅勒烯、萜烯醇和樟腦[32]。因而推測在體系轉變?yōu)镺/W型微乳后，釋放出的親水基團迅速與ABTS陽離子自由基進行反應。當微乳體系水分體積分數繼續(xù)增加到80%～90%時，ABTS陽離子自由基清除能力迅速下降，這可能是同體積樣品中薰衣草精油含量降低造成的。綜合以上結果表明，微乳液微觀結構和精油劑量對ABTS陽離子自由基清除活性有明顯的影響。

圖5 不同水分體積分數的微乳體系ABTS陽離子自由基清除率Fig. 5 ABTS radical scavenging activity of microemulsion systems with different water contents

3 結 論

本實驗利用三元相圖，以薰衣草精油和DPG等質量混合為油相，以Tween-80為表面活性劑，構建了一個可以有效提高薰衣草親水性的多元微乳體系。以該體系微乳區(qū)域的一條無限稀釋線D82為研究對象，通過染料擴散實驗和電導率測定了其微觀結構轉變及其對微乳體系黏度變化的影響規(guī)律。通過抗氧化性實驗發(fā)現，在O/W型階段，雖然薰衣草精油含量低，但反應界面面積大，呈現出良好的DPPH自由基清除能力。ABTS陽離子自由基清除能力則在W/O型和雙連續(xù)型階段先下降，在進入O/W型階段回升，并在水分體積分數70%時出現峰值，其受到精油含量與微觀結構轉變的雙重影響。本研究結果可能為油性功能性原料多元體系在食品中的應用領域提供一定的理論支持。