生物解離大豆蛋白酶解物體外模擬消化抗氧化活性變化

佟曉紅，王 歡，劉寶華，張巧智，李 紅，田 然，趙晉菡，齊寶坤，李 楊，江連洲*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

自由基是通過身體內(nèi)的正常生理反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)[1]。過量的自由基生成可能會(huì)引發(fā)一系列慢性疾病，如衰老、癌癥、心血管疾病和其他疾病[2]。因此，人們?cè)絹碓疥P(guān)注尋找能夠清除自由基的天然來源抗氧化劑[3]。許多蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物及其分離的肽顯示出較好的體外抗氧化活性，例如大豆蛋白、乳清蛋白、玉米醇溶蛋白、小麥蛋白質(zhì)及酪蛋白等[4]，這些酶解產(chǎn)物的抗氧化特性很大程度上取決于酶的特異性、分子質(zhì)量分布、氨基酸組成和釋放肽的序列[5]。大豆蛋白在大豆干種子中約占其質(zhì)量的40%，被認(rèn)為是適合人類食用產(chǎn)品的重要成分。大豆生物解離技術(shù)是一種同時(shí)從大豆中提取油和蛋白質(zhì)的環(huán)保提油技術(shù)，生物解離過程中提取的蛋白質(zhì)主要分布在水解液中（富含蛋白質(zhì)的水相），水解液中蛋白質(zhì)主要為大豆蛋白酶解產(chǎn)物[6]。因此，研究水解液中大豆蛋白酶解物（soy protein hydrolysate，SPH）是十分必要的。SPH可以發(fā)揮其對(duì)胃腸（gastrointestinal，GI）系統(tǒng)的作用或通過腸道吸收作用于其他系統(tǒng)，在GI消化過程中由于消化酶和極端pH值條件可能影響蛋白或肽的結(jié)構(gòu)及活性，因此應(yīng)該研究在GI消化過程中SPH抗氧化活性的變化，體外模擬GI消化是模擬SPH消化過程的一種快速有效的方法[7]。本課題組前期研究7 種不同蛋白酶（堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶）對(duì)生物解離油脂提取率及蛋白質(zhì)水解物苦味和功能特性的影響[8]。結(jié)果表明，采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解時(shí)，提油率最高，為91.23%，SPH溶解性最好，為91.12%，但是苦味值較大，為4.0；采用風(fēng)味蛋白酶處理時(shí)，SPH苦味值最小，為1.5，乳化性最好（乳化活性指數(shù)185.06 m2/g、乳化穩(wěn)定性指數(shù)78.9 min），提油率為87.73%。通過整體對(duì)比得出堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶效果較好，因此本實(shí)驗(yàn)研究大豆堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解物及經(jīng)過體外模擬GI消化后產(chǎn)物的抗氧化活性變化，了解SPH的消化行為可為后續(xù)昂貴動(dòng)物或臨床實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擠壓膨化大豆 山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)總公司；堿性蛋白酶Protex 6 L 杰能科（中國）生物工程有限公司；風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶 北京索萊寶科技有限公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、熒光素鈉、水溶性VE（Trolox） 美國Sigma-Aldrich公司；本實(shí)驗(yàn)所用其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海雷磁公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；3-18K型高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；UV-1600PC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；AL204型分析天平北京京國藝科技發(fā)展有限公司；電子分析天平（0.000 1 g） 上海書俊儀器設(shè)備公司；Synergy多動(dòng)能酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；Q Exactive質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀、Easy-nLC 1000超高效液相色譜系統(tǒng) 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 生物解離SPH的制備

參考Zhang Qiaozhi等[9]的方法制備生物解離SPH，并作適當(dāng)修改。首先將擠壓膨化大豆粉碎過60 目篩，稱取一定量的擠壓膨化大豆粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)固液比為1∶6，調(diào)節(jié)溫度、pH值，加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）酶制劑酶解3 h后，在100 ℃沸水中滅酶10 min。滅酶后離心（8 000×g、20 min），將得到的水解液調(diào)節(jié)pH值至7，冷凍干燥后用正己烷脫脂處理得到SPH。堿性蛋白酶酶解得到產(chǎn)物記為SPH-A，風(fēng)味蛋白酶酶解得到產(chǎn)物記為SPH-F。

1.3.2 水解蛋白回收率

參照J(rèn)ung等[10]的方法測(cè)定水解蛋白回收率，按式（1）計(jì)算。

式中：ws為擠壓膨化大豆粉中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；m0為擠壓膨化大豆粉的質(zhì)量/g；w1為殘?jiān)械鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；m2為不溶部分的質(zhì)量/g。

1.3.3 體外模擬GI消化

參照Minekus等[11]描述的方案并稍作修改，使用胃蛋白酶和胰酶對(duì)SPH進(jìn)行模擬GI消化。用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.0）將SPH配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，與模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）以體積比1∶1混合，并使用1 mol/L HCl將pH值調(diào)節(jié)至3.0，在消化混合物中加入胃蛋白酶使之濃度達(dá)到2 000 U/mL，將混合物在水浴振蕩器（37 ℃、170 r/min）中反應(yīng)2 h。SGF消化2 h后，將消化樣品與模擬腸液以體積比1∶1混合，用1 mol/L NaOH將pH值增加至7.0，添加胰酶，并使胰蛋白酶的終濃度為100 U/mL，混合物在相同條件下再溫育2 h。水浴加熱（75 ℃、20 min）停止消化后，用0.5 mol/L NaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.0。在10 000×g條件下離心20 min，收集上清液冷凍干燥。分別在SGF和腸液反應(yīng)后收集消化樣品，分別記為SPH-G和SPH-GI，以測(cè)定SPH在體外消化過程中抗氧化活性的變化。

1.3.4 蛋白水解度的測(cè)定

參照Nielsen等[12]的方法，即鄰苯二甲醛（orthophthalaldehyde，OPA）法。采用0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的樣品溶液，樣品溶液與OPA試劑充分混勻后，避光反應(yīng)2 min，在340 nm波長下測(cè)定吸光度。水解度（degree of hydrolysis，DH）按式（2）計(jì)算。

式中：h為水解的肽鍵數(shù)；htot為總肽鍵數(shù)（大豆htot為7.8）。

1.3.5 總氨基酸含量分析

將樣品在密封的水解管中用6 mol/L HCl在110 ℃條件下水解24 h。水解后轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中用去離子水定容。過濾后取1 mL溶液進(jìn)行真空干燥，將干燥的樣品用1 mL HCl重新溶解后，在16 000×g條件下離心15 min取上清液，進(jìn)樣量為50 μL，利用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.3.6 游離氨基酸含量分析

參照Wu Huichun等[14]描述的方法并稍作修改。將樣品用10%三氯乙酸沉淀2 h，然后在11 000×g條件下離心15 min。取上清液，調(diào)節(jié)pH值至2.0，并用0.45 μm濾膜過濾。將濾液利用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

利用尺寸排阻色譜-HPLC法測(cè)定SPH、SPH-G、SPH-GI樣品的分子質(zhì)量分布，參數(shù)參照Zhang Qiaozhi等[15]的方法。

色譜條件為：色譜柱為AdvanceBio SEC柱（300 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為pH 7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液；流速為0.2 mL/min，紫外檢測(cè)波長為220 nm，進(jìn)樣量10 μL。將樣品配制為質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待測(cè)。

根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品的分子質(zhì)量范圍：甲狀腺球蛋白（670 kDa）、牛γ球蛋白（158 kDa）、雞卵白蛋白（44 kDa）、馬肌紅蛋白（17 kDa）和VB12（1.35 kDa）。

1.3.8 抗氧化能力測(cè)定

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力根據(jù)Arise等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。使用96 孔酶標(biāo)板，將100 μL樣品溶液（1 mg/mL）與100 μL DPPH溶液（0.1 mmol/L，溶解于95%甲醇溶液中）混合并在室溫下暗處反應(yīng)30 min。然后利用酶標(biāo)儀在517 nm波長處測(cè)定吸光度。以磷酸鹽緩沖液作為空白溶液。DPPH自由基清除率按式（3）計(jì)算。

式中：Asample為樣品溶液吸光度；Ablank為空白溶液吸光度。

1.3.8.2 ABTS陽離子自由基清除能力

參照Re等[17]方法進(jìn)行ABTS陽離子自由基清除能力測(cè)定。用0.2 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL的樣品溶液。7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液與2.45 mmol/L過硫酸鉀在暗處反應(yīng)16 h制備ABTS工作液，隨后用磷酸鹽緩沖液稀釋，使其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。取50 μL樣品溶液加入到4 mL已稀釋的ABTS溶液中并在黑暗中反應(yīng)6 min，在734 nm波長處測(cè)定吸光度。以磷酸鹽緩沖液作為空白溶液。ABTS陽離子自由基清除率按式（4）計(jì)算。

式中：Asample為樣品溶液吸光度；Ablank為空白溶液吸光度。

1.3.8.3 氧化自由基吸收能力測(cè)定

參照Bitzer等[18]的方法進(jìn)行氧化自由基吸收能力（oxidative radical absorption capacity，ORAC）測(cè)定，并稍作調(diào)整。將樣品用75 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液溶解至終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，Trolox（12.5、25、50、75、100 μmol）作為對(duì)照。加入20 μL樣品溶液及Trolox于96 孔酶標(biāo)板中，再加入120 μL熒光素鈉溶液，在37 ℃條件下反應(yīng)12 min后，加入60 μL AAPH誘發(fā)反應(yīng)，設(shè)定酶標(biāo)儀的激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為535 nm，每1 min測(cè)定1 次熒光強(qiáng)度，測(cè)定120 min。測(cè)定結(jié)束后計(jì)算熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線即熒光衰減曲線下面積（area under curve，AUC），用磷酸鹽緩沖液作為空白，AUC樣品－AUC空白與以Trolox溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相較，將樣品的抗氧化能力轉(zhuǎn)化為Trolox濃度（μmol/L）。

1.3.9 LC-MS/MS鑒定

SPH-F和SPH-F-GI樣品經(jīng)毛細(xì)管HPLC脫鹽及分離后用Q Exactive MS儀進(jìn)行分析。將樣品從自動(dòng)取樣器加載到Zorbax 300SB-C18peptide traps柱，再通過C18反相柱（150 mm×75 μm，5 μm）進(jìn)行分離。流動(dòng)相洗脫液A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的超純水，洗脫液B為含0.1%甲酸的乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)84%）。洗脫流速為250 nL/min，洗脫條件：0～50 min，洗脫液B體積分?jǐn)?shù)為4%～50%；50～54 min，洗脫液B體積分?jǐn)?shù)為50%～100%；54～60 min，洗脫液B體積分?jǐn)?shù)保持在100%。多肽和多肽碎片的質(zhì)荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）；采用正離子模式掃描，掃描范圍m/z100～2 300；使用maxquant數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索；根據(jù)BIOPEP數(shù)據(jù)庫查找具有抗氧化活性的肽的序列。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，并用Origin 8.0和Excel軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，P＜0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白DH和回收率分析

圖1 SPE和模擬GI消化樣品的DEFig. 1 Degree of hydrolysis of SPHs and their digests

DH是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)水解的關(guān)鍵參數(shù)[12]。由圖1可知，在模擬GI消化期間，SPH-A和SPH-F的DH遵循類似的趨勢(shì)，都呈上升趨勢(shì)，胃蛋白酶消化2 h后，SPH-A-G和SPH-F-G的DH分別僅達(dá)到18.78%和13.49%，DH低可能是由于胃蛋白酶是一種內(nèi)肽酶，它對(duì)切割肽鍵具有高度特異性，其中羧基由芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸提供[19]。然而，在隨后的胰酶消化期間樣品DH均迅速增加，尤其是SPH-A-GI的DH達(dá)到29.31%。這是由于胰酶是一種酶混合物，胰酶表現(xiàn)出胰蛋白酶（精氨酸和賴氨酸位點(diǎn)肽鍵斷裂）、胰凝乳蛋白酶（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和亮氨酸位點(diǎn)肽鍵斷裂）和彈性蛋白酶（丙氨酸和其他脂肪族氨基酸的肽鍵斷裂）的活性[20]。計(jì)算得到SPH-A和SPH-F的水解蛋白回收率分別為79.28%和77.41%。

2.2 SPH及其模擬GI消化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布分析

利用HPLC法測(cè)定SPH、SPH-G、SPH-GI樣品的分子質(zhì)量分布如圖2所示。

圖2 SPH和模擬GI消化樣品的分子質(zhì)量分布Fig. 2 Molecular mass distribution of SPHs and their digests

表1 SPH和模擬GI消化樣品的分子質(zhì)量分布Table 1 Percentages of fractions with different molecular masses in SPHs and their digests

由表1可知，未消化的SPH-A和SPH-F樣品中，分子質(zhì)量大于10 kDa的肽的相對(duì)含量分別為23.21%和44.15%，這表明原料經(jīng)過堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解后產(chǎn)生了相當(dāng)大量的大豆蛋白多肽，但是一些蛋白質(zhì)對(duì)酶水解具有抗性并且保持完整。SPH-A和SPH-F經(jīng)過胃蛋白酶消化后，分子質(zhì)量大于10 kDa的肽相對(duì)含量明顯降低，分子質(zhì)量為5～10 kDa的肽相對(duì)含量增加，這說明胃蛋白酶破壞了鏈內(nèi)肽鍵，主要產(chǎn)生較大的肽段。而經(jīng)胰酶消化后，分子質(zhì)量小于1 kDa的肽相對(duì)含量明顯增加，說明胰酶不僅將SPH-A-G和SPH-F-G水解成更小的片段，而且由于其更大的水解活性而產(chǎn)生更多的游離氨基酸[21]，這些變化與上述DH變化一致，其中SPH-F-GI樣品中分子質(zhì)量小于1 kDa的肽相對(duì)含量最高，為17.35%。Zhang Qiaozhi等[15]也報(bào)道了同樣的多肽水解趨勢(shì)，大豆蛋白水解物經(jīng)胃蛋白酶和胰酶消化后，大于10 kDa的肽相對(duì)含量降低，小于1 kDa的肽相對(duì)含量同時(shí)增加。水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布也可能對(duì)其抗氧化活性產(chǎn)生影響，因?yàn)檩^低分子質(zhì)量的肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性[22]。據(jù)報(bào)道，抗氧化肽大多含有20 個(gè)以內(nèi)的氨基酸殘基，分子質(zhì)量越低，穿過腸屏障并發(fā)揮生物效應(yīng)的可能性就越高[23]。源自食物來源的大多數(shù)抗氧化肽的分子質(zhì)量范圍為0.5～1.8 kDa[4]。

2.3 SPH及其模擬GI消化后產(chǎn)物的氨基酸組成分析

盡管氨基酸組成不是評(píng)估肽抗氧化能力的唯一標(biāo)準(zhǔn)，但是模擬GI消化過程中確定其變化也很重要，在模擬GI消化期間釋放的游離氨基酸和肽的含量和組成可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物抗氧化活性的信息[24]。在酶水解和GI消化過程中，一些氨基酸會(huì)失去其生物利用度。例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露于高溫和強(qiáng)堿性條件下時(shí)，通過美拉德反應(yīng)、異肽交聯(lián)及氨基?；鶜埢耐庀梢园l(fā)生賴氨酸的損失[25]。肽的抗氧化活性是基于分子質(zhì)量、特定氨基酸的存在及其在序列中的特定定位[26]。

表2 SPH和模擬GI消化樣品的氨基酸組成Table 2 Amino acid compositions of SPHs and their digests

由表2可知，與SPH-A相比，SPH-F中游離氨基酸含量更高，這可能由于風(fēng)味蛋白酶是復(fù)合蛋白酶，其含有的氨肽酶和羧肽酶會(huì)通過末端水解多肽，因此游離氨基酸更多。SPH-A和SPH-F經(jīng)過模擬GI消化后，游離氨基酸含量增加。同時(shí)相對(duì)于胃蛋白酶消化后，經(jīng)過胰酶消化后，游離氨基酸含量明顯增加，這是由于胃蛋白酶消化期間，一些肽主要被分解成小片段，然而在胰酶消化后，這些肽水解更完全[27]。經(jīng)過模擬消化后，SPH-F-GI樣品中肽的相對(duì)含量相對(duì)于SPH-A-GI更高，為75.86%，即超過70%的最終消化物仍然以肽的形式存在，這使它們更易于吸收和具有抗氧化活性。

2.4 SPH及其模擬GI消化后產(chǎn)物的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

表3 SPH和模擬GI消化樣品的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of SPHs and their digests

由表3可知，SPH-A比SPH-F抗氧化活性更高。這可能是由于SPH-A中的肽含量更高，并且肽中HAA和組氨酸含量也更高（表2）。水解產(chǎn)物中HAA殘基的存在可以增強(qiáng)與食物中脂質(zhì)的相互作用，通過與膜脂雙層發(fā)生疏水相互作用增強(qiáng)抗氧化劑進(jìn)入靶器官[28]。而組氨酸由于存在咪唑環(huán)，因此尤其具有強(qiáng)烈的自由基清除活性[29]。經(jīng)過模擬GI消化后，SPH-F-GI樣品的抗氧化活性比SPH-A-GI樣品更高，可能是由于肽的相對(duì)含量更高，并且肽中HAA、AAA及NCAA含量更高。據(jù)報(bào)道，富含AAA的肽通過直接電子轉(zhuǎn)移顯示出自由基清除作用，并抑制脂質(zhì)氧化副產(chǎn)物的產(chǎn)生[30]。已有報(bào)道顯示，NCAA具有很強(qiáng)的抗氧化作用，因?yàn)樗鼈兛梢蕴峁╇娮觼礅缱杂苫鵞31]。

2.4.1 ABTS陽離子自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

ABTS陽離子自由基清除率的測(cè)定可以應(yīng)用于親脂性和親水性化合物，并且已經(jīng)廣泛用作抗氧化活性測(cè)定[32]。由表3可知，相對(duì)于SPH-F，SPH-A的ABTS陽離子自由基清除率更高，為55.84%。SPH-F和SPH-A經(jīng)過胃蛋白酶消化后，ABTS陽離子自由基清除率增加不明顯甚至減小，這是因?yàn)槲傅鞍酌柑幚砗笙a(chǎn)物的疏水性增加，使得它們不太可能與水溶性ABTS反應(yīng)，胃蛋白酶在切割疏水性和芳香族氨基酸如Phe、Trp和Try之間的肽鍵方面最有效[20]。當(dāng)胃蛋白酶消化產(chǎn)物用胰酶水解時(shí)，額外的肽鍵裂解導(dǎo)致較短肽（三肽和二肽）和游離氨基酸積累，因此變得更親水，可以更容易地與水溶性ABTS反應(yīng)[33]，因此ABTS陽離子自由基清除率增加。SPH-A-GI的ABTS陽離子自由基清除率比SPH-F-GI小，這可能是由于SPH-A經(jīng)過模擬GI消化后水解過度，產(chǎn)生大量游離氨基酸。

2.4.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其與抗氧化劑發(fā)生單電子配對(duì)而被清除，DPPH自由基清除率的測(cè)定已被認(rèn)為是評(píng)價(jià)抗氧化活性的有效方法[34]。由表3可知，SPH-F和SPH-A經(jīng)過胃蛋白酶消化后，DPPH自由基清除率增加，但是經(jīng)過胰酶消化后，DPPH自由基清除率降低，這可能是由于在胰酶消化后較短的肽（三肽和二肽）和氨基酸積累，使腸道消化物更加親水，導(dǎo)致與脂溶性DPPH自由基反應(yīng)更加困難[33]。SPH-A-GI和SPH-F-GI的DPPH自由基清除率相近，分別為25.98%和27.29%，這可能由于它們分子質(zhì)量在1～5 kDa范圍內(nèi)的相對(duì)含量十分接近。Kimatu等[35]在測(cè)定食用菌（雙孢蘑菇）蛋白水解物的DPPH自由基清除率時(shí)，發(fā)現(xiàn)1～3 kDa的肽具有比小于1 kDa和3～5 kDa的肽更高的抗氧化活性。同時(shí)，Yu Min等[36]研究表明，大豆豆粕水解產(chǎn)物中1～3 kDa的部分可能具有良好的抗氧化活性。因此說明用分子質(zhì)量在1～5 kDa范圍內(nèi)的肽主要發(fā)揮DPPH自由基清除活性。

2.4.3 ORAC測(cè)定結(jié)果

ORAC是一種通過氫原子轉(zhuǎn)移（hydrogen atom transfer，HAT）對(duì)自由基進(jìn)行清除的方法[37]。與DPPH自由基和ABTS陽離子自由基測(cè)定結(jié)果不同，SPH-A和SPH-F的ORAC通過胃蛋白酶消化后均降低，這可能是由于檢測(cè)方法的反應(yīng)機(jī)制不同，ORAC測(cè)定基于HAT，而DPPH自由基和ABTS陽離子自由基測(cè)定主要基于電子轉(zhuǎn)移[38]。另一方面，其他可能的植物化學(xué)物質(zhì)，如酚類化合物、類黃酮、多糖也可以產(chǎn)生抗氧化活性[39]，導(dǎo)致不同的抗氧化作用結(jié)果。相對(duì)于SPH-A-GI，SPH-F-GI的ORAC更高，為69.15 μmol/mg，這可根據(jù)前面多肽分子質(zhì)量分布和肽內(nèi)氨基酸組成進(jìn)行解釋，即SPH-F-GI中分子質(zhì)量小于1 kDa的肽相對(duì)含量更高，并且肽中HAA、AAA及NCAA含量相對(duì)更高。

2.7 LC-MS/MS鑒定

綜上可知，相對(duì)于SPH-A，SPH-F經(jīng)過模擬GI消化后，抗氧化活性更好，所以對(duì)SPH-F和SPH-F-GI進(jìn)行LC-MS/MS鑒定。根據(jù)前期研究可知，食物來源的大多數(shù)抗氧化肽的N-末端包含疏水氨基酸殘基[4]。以MS的可信度、豐度及抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)得到的肽段序列進(jìn)行篩選。SPH-F中得到4 種多肽，氨基酸序列分別為AIPVNKPGRFESF、ALPEEVIQH、SRNELDKGIGTII、AFPGSAKDIENLIK。SPH-F-GI中得到5 種多肽，氨基酸序列分別為ALPEEVIQH、A I P V N K P G R F E S F、F G R E E G Q Q Q G E E R、ALPEEVIQHT、FREGDLIAVPT。后續(xù)可對(duì)這些肽進(jìn)行合成，并鑒定其抗氧化特性。

3 結(jié) 論

在模擬GI消化期間，胰酶處理使SPH-A和SPH-F的DH顯著增加，分別達(dá)到29.31%和20.42%，相對(duì)于SPH-F-GI，SPH-A-GI有更大的DH。經(jīng)過模擬GI消化后，SPH-A和SPH-F分子質(zhì)量大于10 kD組分的相對(duì)含量降低，小于1 kDa組分的相對(duì)含量增加，其中，其中SPH-F-GI樣品中分子質(zhì)量小于1 kDa的肽相對(duì)含量最高，為17.35%。SPH-F-GI樣品中肽的含量較SPH-A-GI更高，為75.86%，并且肽中HAA、AAA及NCAA含量更高。整體而言，相對(duì)于SPH-A-GI，SPH-F-GI的抗氧化活性更好，ORAC為69.15 μmol/mg，DPPH自由基清除率為27.29%，ABTS陽離子自由基清除率為56.21%；同時(shí)，通過胃蛋白酶和胰酶的消化改善了SPH-F的抗氧化活性。以后可進(jìn)一步研究并鑒定SPH-F經(jīng)過模擬GI消化后得到肽的抗氧化活性。