羥自由基氧化對(duì)高白鮭肌原纖維蛋白降解的影響

秦軍委，雷用東，邱恒恒，郭 欣，朱新榮，張 建,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000）

我國淡水資源豐富，淡水漁業(yè)養(yǎng)殖具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，目前除了養(yǎng)殖四大家魚外，冷水魚越來越受到人們的關(guān)注。高白鮭（Coregonus peled）屬于鮭科（Salmonidae）、白鮭屬（Coregonus），自然分布于高寒地區(qū)的湖泊及河流中，是典型的冷水魚[1]。高白鮭適應(yīng)性強(qiáng)，且肉味鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，是國內(nèi)外水產(chǎn)市場深受歡迎的冷水魚品種[2-3]。但是由于魚體中肌纖維較短、水分含量較高、內(nèi)源酶活性高等特點(diǎn)，在加工和貯藏過程中容易發(fā)生肌肉軟化和肌原纖維蛋白降解嚴(yán)重等問題，致使魚肉品質(zhì)下降。

蛋白質(zhì)是魚類肌肉組織的主要組成成分之一，其降解、聚合和變性都會(huì)嚴(yán)重影響魚肉的品質(zhì)特性，營養(yǎng)價(jià)值和加工性能[4]。肌原纖維蛋白是肌肉中最重要的一類功能性蛋白，主要包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白等，這類蛋白在熱誘導(dǎo)作用下可以形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予肉制品良好的感官特性和功能特性[5-6]。蛋白質(zhì)氧化是導(dǎo)致宰后魚肉品質(zhì)下降的另一重要因素，研究表明，氧化降低了肌肉的顏色、風(fēng)味和嫩度等食用品質(zhì)特性，還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能性質(zhì)（如凝膠性和乳化性等）的改變[7-8]。目前對(duì)魚肉蛋白進(jìn)行氧化使用最多的是羥自由基氧化體系，氧化對(duì)象多為肌原纖維蛋白。前人對(duì)魚類肌原纖維蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，氧化可導(dǎo)致羰基含量和表面疏水性增加，總巰基含量、活性巰基含量、乳化活性和乳化穩(wěn)定性顯著下降，氧化后的肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)和聚集，生成大量高分子凝集體，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）比肌動(dòng)球蛋白更容易氧化交聯(lián)[9]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化后肌原纖維蛋白的水結(jié)合能力和白度下降，且氧化可使蛋白發(fā)生聚集[10]。姜晴晴[11]和李學(xué)鵬[12]等均發(fā)現(xiàn)，氧化后MHC發(fā)生交聯(lián)聚集，產(chǎn)生了分子質(zhì)量大于200 kDa的蛋白聚集體。目前研究大多集中于氧化對(duì)肌原纖維蛋白理化特性和功能特性的影響，而關(guān)于氧化對(duì)肌原纖維蛋白降解變化以及具體蛋白如何變化的研究較少。

由于高白鮭出水即死的特點(diǎn)，使其只能進(jìn)行冷藏運(yùn)輸和加工，另外，氧化對(duì)魚肉蛋白的影響越發(fā)突顯，因此研究高白鮭氧化后在貯藏條件下肌肉蛋白的變化很有必要。本實(shí)驗(yàn)采用羥自由基氧化體系對(duì)高白鮭背肌肉氧化后進(jìn)行貯藏，并對(duì)高白鮭肌原纖維蛋白中的MHC、肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的變化進(jìn)行檢測，探究氧化后貯藏對(duì)其產(chǎn)生的影響，以期為高白鮭在加工貯藏過程中控制蛋白氧化、提升魚肉品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮高白鮭購買于新疆賽湖漁業(yè)科技開發(fā)有限公司，體長（32±2）cm、體質(zhì)量（750±50）g，宰殺后去鱗、去頭、去尾、去皮，取其背肌肉（約1 cm×1 cm×1.5 cm）于－80 ℃冰箱備用。

鼠單克隆抗肌動(dòng)蛋白（3E9） 美國Abbkine公司；鼠單克隆抗肌間線蛋白（Clone DE-U-10）、鼠單克隆抗肌鈣蛋白T（Clone JLT-12） 美國Sigma公司；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗 美國Abcam公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜 美國Millipore公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒 美國Pierce公司；酶放大化學(xué)發(fā)光免疫分析（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒 美國Thermo Scientific公司；FeCl3、H2O2、鹽酸胍、抗壞血酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)股份有限公司；XB 3200C電子天平、XB 220A分析天平 瑞士Precisa公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；Cary 50紫外-可見分光光度計(jì) 美國Varian公司；電泳和印跡轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 氧化系統(tǒng)的制備

氧化系統(tǒng)由FeCl3、抗壞血酸、H2O2、磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）組成，包括4 組不同濃度的氧化體系：1 mmol/L H2O2+0.2 mmol/L FeCl3（組1）、5 mmol/L H2O2+0.4 mmol/L FeCl3（組2）、10 mmol/L H2O2+0.8 mmol/L FeCl3（組3）、20 mmol/L H2O2+1.0 mmol/L FeCl3（組4），每組分別在室溫下氧化0、15、30、60、90 min，通過測定每組魚肉樣品的羰基含量來確定最適氧化濃度。最適氧化濃度確定后，將高白鮭背肌肉組織隨機(jī)分成兩組，一組作為空白組，另一組置于羥自由基氧化系統(tǒng)，之后將樣品于4 ℃貯藏0、1、7、14 d并取樣，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考Chin[13]和Jiang Xinjing[14]等的方法，取適量高白鮭背肌肉，加入10 倍體積0.3 g/100 mL NaCl溶液，均質(zhì)1 min，4 ℃下8 000×g離心10 min，棄上清液，重復(fù)操作一次，將沉淀溶于10 倍體積0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中（pH 7.0），均質(zhì)5 s，于4 ℃提取1 h以充分溶解蛋白，取蛋白溶液8 mL，加入16 mL去離子水稀釋上清液使蛋白沉淀，10 000×g、4 ℃離心5 min，棄上清液，重復(fù)兩次，沉淀用0.6 mol/L NaCl溶解，作為肌原纖維蛋白。采用BCA蛋白試劑盒測定并調(diào)整至同一質(zhì)量濃度。

1.3.3 羰基含量的測定

參照Oliver等[15]的方法并稍作修改，取1 mL 4 mg/mL的蛋白溶液于離心管中，加入1 mL 10 mmol/L DNPH，室溫下反應(yīng)1 h（每10 min漩渦振蕩一次）后加入1 mL 20%（體積分?jǐn)?shù)）TCA，4 ℃下8 000×g離心5 min，棄上清液，用1 mL乙酸乙酯：乙醇（1∶1，V/V）清洗沉淀3 次，加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，于37 ℃條件下水浴15 min使沉淀溶解，反應(yīng)液8 000×g離心3 min除去不溶物質(zhì)，所得上清液在370 nm波長處測吸光度。

1.3.4 SDS-PAGE樣品制備及分析

調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度后，按1∶1（V/V）的比例加入樣品處理液（100 mmol/L Tris-HCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% SDS、體積分?jǐn)?shù)20%甘油、體積分?jǐn)?shù)10% β-巰基乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%溴酚藍(lán)，pH 8.0），100 ℃水浴5 min，冷卻后放入－80 ℃冰箱備用。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）參照Laemmli[16]的方法并略作修改，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠和5%的濃縮膠檢測肌原纖維蛋白變化，上樣量10 μL，濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓160 V，SDS-PAGE完成后進(jìn)行染色、脫色、成像。

1.3.5 Western-blotting分析

參考Delbarre-Ladrat等[17]的方法并稍作修改，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠和5%濃縮膠檢測肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的變化，上樣量均為10 μL，凝膠電泳時(shí)電壓與SDS-PAGE一致。

凝膠電泳后，將凝膠中相應(yīng)的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液（48 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、0.037% SDS、20%甲醇）中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜移到含有5%脫脂奶粉的TBST溶液（150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、0.05% Tween-20，pH 7.5）中，于室溫下封閉2 h。然后將PVDF膜分別與稀釋2 000 倍體積的鼠單克隆抗肌動(dòng)蛋白、稀釋2 000 倍體積的鼠單克隆抗肌間線蛋白和稀釋400 倍體積的鼠單克隆抗肌鈣蛋白T在4 ℃條件下孵育2 h后，先用TBST在脫色搖床上漂洗3 次，每次10 min，再用TBS緩沖液（150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗10 min。再與稀釋5 000 倍體積的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫反應(yīng)1 h，繼續(xù)用TBST漂洗3 次，最后用ECL法顯色。

1.3.6 目標(biāo)蛋白的半定量分析

通過凝膠成像儀對(duì)凝膠或PVDF膜進(jìn)行成像，然后通過Quantity One軟件對(duì)條帶光密度值進(jìn)行半定量分析。MHC、肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T降解情況分別通過220、42、55 kDa和35 kDa處條帶灰度來表示，其降解率通過相應(yīng)降解條帶的灰度除以完整條帶的灰度表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)除SDS-PAGE和凝膠電泳外，均采用3 次平行實(shí)驗(yàn)。采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan's多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥自由基氧化對(duì)高白鮭肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖1 不同濃度羥自由基氧化體系對(duì)高白鮭肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of different oxidation systems on the carbonyl content of myofibrillar proteins from Coregonus peled

為了明確合適的氧化濃度，本實(shí)驗(yàn)先測定了不同濃度羥自由基氧化體系中高白鮭背肌肉羰基的含量，結(jié)果如圖1所示。隨著氧化時(shí)間的延長，4 組不同濃度的氧化體系中的羰基含量顯著升高（P＜0.05），其中組1和組4在0 min時(shí)的羰基含量分別為2.93 nmol/mg和3.10 nmol/mg，在90 min時(shí)分別增長至5.90 nmol/mg和9.59 nmol/mg，分別增加了101.37%和209.35%，增長趨勢顯著（P＜0.05）。另外，在相同氧化時(shí)間內(nèi)高白鮭背肌肉羰基含量也隨著氧化濃度的升高而增加，在孵育15 min之前，不同氧化濃度組的羰基含量增長差異不明顯；但在30 min之后4 種組合的羰基含量變化差異顯著（P＜0.05）。值得注意的是，在孵育90 min時(shí)組1與組2差異顯著（P＜0.05），組2與組3差異不顯著（P＞0.05），組3與組4差異顯著（P＜0.05），這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的羰基主要通過羥自由基攻擊蛋白質(zhì)的側(cè)鏈或肽鍵、肽骨架的斷裂、還原糖反應(yīng)以及結(jié)合非蛋白羰基化合物而產(chǎn)生[18]，也可經(jīng)過分子重排直接形成；另外通過電子轉(zhuǎn)移、加成和脫氫等方式使脂肪族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)轉(zhuǎn)化成為烷氧自由基，并直接分解為羰基化合物。在長時(shí)間、高濃度氧化劑作用下會(huì)生成大量羰基基團(tuán)，加速與親核物質(zhì)（如NH2－）的反應(yīng)，最終生成席夫堿，促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚合和交聯(lián)，使得氧化后期羰基含量的增加速度逐漸減緩[19]。但氧化濃度過高或氧化時(shí)間過長，聚合蛋白質(zhì)可能進(jìn)一步發(fā)生降解和解聚，肽鍵斷裂，羰基含量會(huì)繼續(xù)增加，這可能是90 min時(shí)組4羰基含量升高的原因。

蛋白質(zhì)中羰基的產(chǎn)生是蛋白發(fā)生氧化的一個(gè)顯著性標(biāo)志，可用羰基含量衡量肉制品中蛋白氧化的程度，羰基含量越高，表明蛋白質(zhì)氧化程度越高[20]。綜上，本實(shí)驗(yàn)最終采用組2氧化濃度（5 mmol/L H2O2+0.4 mmol/L FeCl3）孵育60 min的條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用SDS-PAGE分析各蛋白的降解變化情況，Western blotting分析肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的降解變化。

2.2 肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

羥自由基氧化對(duì)高白鮭肌原纖維蛋白影響的SDS-PAGE圖譜如圖2A所示，SDS-PAGE能夠直觀地反映蛋白質(zhì)發(fā)生氧化后及不同氧化條件下，蛋白亞基間發(fā)生的聚集、斷裂或降解等情況。經(jīng)過氧化且在貯藏過程中，MHC、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈都發(fā)生了不同程度的降解，并且氧化組降解程度比未氧化組高。在貯藏第14天時(shí)，氧化組的MHC降解率為46.39%，未氧化組為34.72%（圖2B），兩者差異顯著（P＜0.05）。特別的是，氧化組與未氧化組在貯藏1 d時(shí)MHC和肌動(dòng)蛋白的條帶灰度比0 d深，原因可能是在0 d時(shí)肌原纖維蛋白中的肌動(dòng)球蛋白沒有發(fā)生解離或者解離程度不高，分子質(zhì)量過大無法進(jìn)入泳道，貯藏1 d后，肌動(dòng)球蛋白逐步解離為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，因此條帶灰度深。另外可以發(fā)現(xiàn)，氧化組在貯藏過程中MHC和肌動(dòng)蛋白的條帶灰度比未氧化組低，這說明羥自由基氧化促進(jìn)貯藏前期蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)或聚集，促進(jìn)貯藏后期蛋白質(zhì)的降解、肽鍵斷裂及小分子化合物的降解，這可能是因?yàn)榍捌诹u自由基影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氫鍵、二硫鍵、疏水作用和靜電作用等，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)改變，活性巰基含量減少，二聚酪氨酸含量增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集[21-22]；而后期羥自由基進(jìn)一步滲透到組織內(nèi)部，激活了鈣激活酶類、組織蛋白酶類等內(nèi)源酶，加速了蛋白的降解。

圖2 羥自由基氧化體系對(duì)高白鮭肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜（A）和MC降解率（B）的影響Fig. 2 SDS-PAGE patterns of Coregonus peled myofibrillar proteins subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of MHC (B)

2.3 羥自由基氧化對(duì)肌動(dòng)蛋白的影響

圖3 羥自由基氧化對(duì)肌動(dòng)蛋白降解Western blotting圖譜（A）和肌動(dòng)蛋白降解率（B）的影響Fig. 3 Western blotting analysis of degradation of actin subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of actin (B)

肌動(dòng)蛋白可以組裝成多種結(jié)構(gòu)并廣泛參與真核細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)，是骨骼肌中第二豐富的蛋白質(zhì)，也是肌節(jié)中細(xì)絲的主要組成成分[23]。肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的降解能破壞肌動(dòng)球蛋白的形成并導(dǎo)致結(jié)構(gòu)完整性損傷[23]。由圖3A可以看出，羥自由基氧化對(duì)肌動(dòng)蛋白降解的影響不明顯，氧化組與未氧化組的條帶變化不明顯，從圖3B也可以看出，兩組中肌動(dòng)蛋白的降解率無明顯差異（P＞0.05）。只有在14 d時(shí)兩組的降解率偏高，但這可能是肌動(dòng)蛋白正常的降解損耗所致，貯藏前期魚肉組織內(nèi)部的內(nèi)源酶開始對(duì)肌動(dòng)蛋白及其他骨架蛋白進(jìn)行分解，隨著貯藏時(shí)間的延長，組織內(nèi)部開始出現(xiàn)間隙，加速了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化，保水性開始降低，魚肉組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步松軟解體，肌動(dòng)蛋白降解加速，因此貯藏后期肌動(dòng)蛋白的降解率偏高。結(jié)果表明，在高白鮭背肌肉組織中肌動(dòng)蛋白的自然降解占主導(dǎo)地位，羥自由基氧化對(duì)其影響作用不明顯。

2.4 羥自由基氧化對(duì)肌間線蛋白的影響

圖4 羥自由基氧化對(duì)肌間線蛋白降解Western blotting圖譜（A）和肌間線蛋白降解率（B）的影響Fig. 4 Western blotting analysis of degradation of desmin subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of desmin (B)

肌間線蛋白是細(xì)胞骨架蛋白之一，分子質(zhì)量約為53 kDa，連接于Z線與其他細(xì)胞骨架元件之間，保持肌細(xì)胞的有序性和完整性[25-26]。由圖4A可以看出，氧化組的肌間線蛋白條帶降解變化不明顯，反而未氧化組降解明顯，尤其是在貯藏后期。由圖4B可以看出，未氧化組肌間線蛋白降解率在貯藏期間均比氧化組高，且一直在增加，氧化組則增長緩慢，甚至前7 d沒有明顯增加，這表明羥自由基氧化對(duì)魚肉組織在貯藏期間肌間線蛋白的降解起到抑制作用，這一結(jié)果與薛梅等[27]研究牛肉肌原纖維蛋白降解的結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)高氧化濃度下能顯著抑制μ-鈣激活酶對(duì)肌間線蛋白的降解。李錚等[28]的研究結(jié)果表明，肌原纖維蛋白磷酸化后肌間線蛋白的降解也受到了抑制，而去磷酸化加速肌間線蛋白的降解。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，肌間線蛋白是一類極其敏感的結(jié)構(gòu)蛋白，受到外界物質(zhì)影響后，其酶切位點(diǎn)發(fā)生改變，抑制了其降解，這也可能是細(xì)胞自我保護(hù)的一種機(jī)制。

2.5 羥自由基氧化對(duì)肌鈣蛋白T的影響

圖5 羥自由基氧化對(duì)肌鈣蛋白T降解Western blotting圖譜（A）和肌鈣蛋白T降解率（B）的影響Fig. 5 Western blotting analysis of degradation of troponin-T subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of troponin-T (B)

肌鈣蛋白T分子質(zhì)量約為35 kDa，是肌鈣蛋白復(fù)合物的原肌球蛋白結(jié)合成分起連接作用，和肌鈣蛋白I及肌鈣蛋白C共同參與骨骼肌收縮與舒張的調(diào)節(jié)[29]。由圖5可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，氧化組與未氧化組中的肌鈣蛋白T條帶灰度均變淺，降解率增加。但在貯藏前期，兩組肌鈣蛋白T的降解率差異并不顯著（P＞0.05），而在后期氧化組中肌鈣蛋白T的降解率要顯著低于未氧化組（P＜0.05），這說明羥自由基氧化抑制了魚肉組織中的肌鈣蛋白T的降解，特別是在貯藏后期。前人研究表明，肌鈣蛋白T是μ-鈣蛋白酶的降解底物，且其在宰后易發(fā)生降解，從而改善肉的嫩度[30]。這與本研究結(jié)果有一定的差別，分析其原因可能是研究對(duì)象不同，前期研究對(duì)肌原纖維蛋白體外進(jìn)行氧化，本實(shí)驗(yàn)則是對(duì)魚肉組織進(jìn)行氧化然后貯藏，體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境和各種抑制酶的存在導(dǎo)致肌鈣蛋白T前期降解緩慢，氧化組中肌鈣蛋白T降解率低于未氧化組也說明氧化對(duì)其產(chǎn)生了影響，降低了其前期的降解速率。

3 結(jié) 論

采用羥自由基氧化體系對(duì)高白鮭背肌肉進(jìn)行氧化后，其羰基含量隨著氧化時(shí)間的延長和氧化濃度的增加而升高。氧化后進(jìn)行貯藏，氧化組MHC的降解率比未氧化組高，表明氧化顯著促進(jìn)了MHC在貯藏期間的降解；兩組中肌動(dòng)蛋白的差異變化不顯著，自然降解占主導(dǎo)地位；氧化組中肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的降解率低于未氧化組，氧化抑制了肌間線蛋白和肌鈣蛋白T降解，尤其是貯藏后期，對(duì)肌間線蛋白降解的抑制效果尤為顯著。高白鮭魚肉蛋白的降解變化勢必影響其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其功能性質(zhì)，所以高白鮭在貯存及加工過程中應(yīng)該控制其氧化，減少魚肉品質(zhì)的劣變。