玉米葉夾角形成的分子調(diào)控機(jī)理研究

周文期，王曉娟，寇思榮，李艷春，何海軍

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，甘肅 蘭州 730070；2.會寧縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 白銀 730799)

0 引 言

玉米(Zeamays)是我國目前種植面積最大，總產(chǎn)量最高的糧、經(jīng)、飼兼用的重要作物，在解決人口溫飽，保障糧食安全，飼料可持續(xù)發(fā)展以及緩解能源危機(jī)等方面發(fā)揮了不可替代的作用[1]。近年來，我們可利用耕地面積正在減少，各種作物種植面積均有不同程度削減，由于國家政策導(dǎo)向，東北區(qū)域及黃淮海地區(qū)玉米的種植面積減少更多，但是國家發(fā)展對玉米的需求不減反增，因此，育種家認(rèn)為在有限的可耕地面積上，通過提高單位面積產(chǎn)量進(jìn)而增加總產(chǎn)量是一條可持續(xù)發(fā)展路徑，可以緩解玉米供需之間的矛盾。而培育優(yōu)良的耐密、廣適、高抗及穩(wěn)產(chǎn)的玉米新品種，通過增加種植密度來提高總產(chǎn)量，成了育種家的育種目標(biāo)之一。

株型是影響玉米產(chǎn)量的主要因素，玉米葉長、葉寬、葉夾角、葉向值及葉面積的表型均是構(gòu)成玉米株型的重要因素。合理的葉長、葉寬、葉鞘與莖夾角大小等形態(tài)均有利于改善葉片的空間排列和幾何構(gòu)型，對培育玉米理想株型，減少個體的遮蔭反應(yīng)，增強(qiáng)光合效率，增加有機(jī)物積累及增加糧食產(chǎn)量有重要作用[2]。葉夾角作為一個重要的株型指標(biāo)，與株型育種及產(chǎn)量高度相關(guān)，直接影響光和CO2在冠層內(nèi)的分布及群體的光能利用，進(jìn)而影響植株生長發(fā)育的過程和生理特性，最終影響產(chǎn)量[3]。前人對葉夾角形成及發(fā)育研究已經(jīng)開展了相關(guān)工作，例如，利用構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜進(jìn)行遺傳定位的方法或者結(jié)合關(guān)聯(lián)群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析方法，挖掘了控制葉夾角形態(tài)建成的關(guān)鍵數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait loci，QTL)或者基因。但是，要解釋葉夾角發(fā)育的遺傳網(wǎng)絡(luò)機(jī)理仍相差甚遠(yuǎn)。玉米葉夾角大小是典型的數(shù)量性狀，對葉夾角相關(guān)性狀的QTL及候選基因的圖位克隆，并對其功能和育種價值進(jìn)行深入分析，不僅有助于解析葉夾角性狀的遺傳機(jī)理，為選育耐密理想株型的輔助選擇提供有效的分子標(biāo)記，還可為提高群體光合效率而增加產(chǎn)量的分子育種提供重要的基因資源。本文綜述了近年來已經(jīng)克隆的調(diào)控玉米葉夾角形成的關(guān)鍵QTL/基因，旨在為玉米株型分子育種研究提供參考。

1 葉夾角在玉米高產(chǎn)育種中的作用

完整玉米葉片由葉片、葉枕(包括葉舌和葉耳)和葉鞘3部分組成，葉片中脈與主莖之間的夾角被定義為葉夾角，是影響光截獲、光合效率和種植密度的最重要的冠層結(jié)構(gòu)參數(shù)之一。根據(jù)葉夾角大小不同，玉米品種被劃分為平展型、中間型和緊湊型3種不同株型。不同類型的株型使得太陽照射在玉米群體上的位置發(fā)生改變，進(jìn)而影響光合作用及干物質(zhì)的積累，對產(chǎn)量有較大的影響。前人研究報道對葉夾角的遺傳規(guī)律結(jié)果較為一致，普遍認(rèn)可加性基因效應(yīng)最為重要，非加性基因效應(yīng)影響次之[4]。在玉米中，Pendleton等[5]利用來自于C103和Hy兩個玉米自交系構(gòu)建的近等基因系產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與其近等基因系相比，攜帶LIGULELESS2(LG2)位點(diǎn)的近等基因系表現(xiàn)為葉片直立，葉夾角減小10°，具有較好的冠層結(jié)構(gòu)以及較高的光能利用率，產(chǎn)量提高40%。同時在這項(xiàng)研究中，雜交種“先鋒3306”是一個葉片平展且高產(chǎn)的品種，通過人工育種選擇，將穗上部的葉夾角減小為10°，產(chǎn)量增加了14%[5]。與20世紀(jì)30至60年代玉米株型相比，現(xiàn)代玉米雜交種葉片直立且葉面積較大，光能捕獲能力較以前增加了14%，光捕獲能力的增強(qiáng)是玉米產(chǎn)量增加超過20%的重要因素[6-7]。葉面積指數(shù)和葉夾角的組合效應(yīng)已經(jīng)得到研究證實(shí)：當(dāng)葉面積指數(shù)大于3時，上部葉片直立，下部葉片平展的株型才會獲得最高的產(chǎn)量[8]。其他研究也報道了葉夾角對籽粒產(chǎn)量直接影響的相似結(jié)果。例如，自20世紀(jì)70年代以來，葉夾角的變化部分歸因于對B73的選擇，而B73是一個具有直立葉的自交系，葉夾角相對較小，被廣泛應(yīng)用于新親本自交系以及雜交種的選育[9]。20世紀(jì)90年代培育的品種中，隨著葉夾角從60°降低到30°，產(chǎn)量提高了15%～30%[7,10]。這些研究為葉夾角和葉面積指數(shù)的改善，以及增加光捕獲和增產(chǎn)效應(yīng)提供了豐富的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。因此，降低葉夾角，或者減小葉向值，獲得理想株型是玉米育種的一項(xiàng)重要任務(wù)。

葉夾角對產(chǎn)量的貢獻(xiàn)不僅提高了葉片對光的截獲效率，使其通風(fēng)良好，同時也大幅度提高了種植密度[11-12]。幾十年前人們就認(rèn)識到葉夾角對種植密度的影響，并迅速對liguleless1(lg1)和liguleless2(lg2)兩個突變體進(jìn)行研究。首先研究闡明了葉夾角和種植密度的關(guān)系，在這個實(shí)驗(yàn)中，采用了3種基因型的玉米：野生型，葉夾角35°；lg1突變體，葉夾角2°；lg2突變體，葉夾角14°[13]。在75 000～90 000株·hm-2的密度條件下，lg2基因型表現(xiàn)出顯著的高產(chǎn)，并且具有可塑性，在極端密度(151 000株·hm-2)下仍然具有較高的產(chǎn)量。由于lg1基因型擁有幾乎直立的葉片，可以預(yù)測為種植最大密度的理想株型。然而，lg2雖然沒有極端小的葉夾角，但它擁有著較大的光截獲效率，因此具有最高的產(chǎn)量。

2 玉米葉夾角QTL的研究

迄今為止，對葉夾角的自然變異研究的報道很多[14-15]，這些研究報道表明，葉夾角是受到多個基因或者多個位點(diǎn)共同調(diào)控的一個復(fù)雜性狀[16-17]。挖掘葉夾角調(diào)控基因的研究策略有兩種：其一是采用兩個親本構(gòu)建的連鎖群體進(jìn)行定位[18-19]；其二是利用巢式關(guān)聯(lián)作圖群體NAM(Nested association mapping)或者關(guān)聯(lián)群體進(jìn)行全基因組的關(guān)聯(lián)分析[20]。

Mickelson等[21]利用B73×Mo17構(gòu)建的重組自交系群體，種植在兩個不同環(huán)境，采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到調(diào)控葉夾角發(fā)育的多個不同QTLs，分別定位在第1、2、4、5及7號染色體，分析表明7號染色體上的QTL可以解釋27.7%的表型變異，被認(rèn)為是主效QTL。Lu等[22]以掖478×丹340構(gòu)建的F2:3家系群體，檢測到了控制葉夾角發(fā)育的6個QTLs，分別分布于第1、2、3及5號染色體，對表型變異貢獻(xiàn)率范圍為2.9%～13.6%，共解釋了41%的表型變異。同時檢測到8個控制葉向值的QTLs，分布于第2、3、8及9染色體上，解釋了60.8%的表型變異。也有研究表明：葉夾角受到多個位點(diǎn)調(diào)控，且它們之間以加性效應(yīng)以及部分顯性效應(yīng)為主。郭晉杰等[23]利用農(nóng)系531自交系作為受體材料，導(dǎo)入其它10個不同農(nóng)藝性狀自交系的染色體片段，建立系群體，通過對BC3F3代的QTL分析，檢測到4個調(diào)控葉夾角發(fā)育的QTLs，其中定位在第2、9及10號染色體上QTL，分別解釋了12.7%、14.1%和26.5%的表型變異。Ku[8]利用豫82與沈137，兩個緊湊型和平展型玉米自交系構(gòu)建了229個F2:3家系群體，在不同環(huán)境下對控制玉米葉夾角及葉向值性狀進(jìn)行定位，檢測到3個葉夾角發(fā)育相關(guān)QTLs，共解釋了37.4%的表型變異；5個與葉向值相關(guān)的QTLs，解釋了53.9%的表型變異。另外，位于1號染色體1.02 bin位置的qLA 1和qLOV 1，兩個位點(diǎn)同時控制葉夾角以及葉向值，分別解釋了20.4%和23.2%的表型變異；位于第5號染色體的qLA 5和qLOV 5同時控制葉夾角以及葉向值，分別解釋了9.7%和9.8%表型變異，這些位點(diǎn)可以用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，提高育種效率。Ku[16]克隆到位于第2染色體關(guān)鍵基因ZmTAC1，證明了ZmTAC1是qLA 2主效QTL中的關(guān)鍵基因，且正向調(diào)控葉夾角的發(fā)育。Tian等[20]利用巢式關(guān)聯(lián)作圖群體對玉米全基因組進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從玉米基因組中檢測到160個遺傳位點(diǎn)，并篩選鑒定出與玉米葉夾角相關(guān)的基因，研究表明玉米葉夾角的變化是通過多個微小效應(yīng)基因變異累加形成的，它們之間主要以加性效應(yīng)為主。Ku[24]利用豫82與豫87-1構(gòu)建了256個F2:3家系，后代中定位到5個控制葉夾角發(fā)育的QTLs，分別在第1、2、3及7染色體上，解釋表型變異范圍為7.34%～18.43%。他們結(jié)合前人研究結(jié)果，通過Meta-analysis分析將候選區(qū)間整合在一張遺傳連鎖圖譜上，其中位于第1(bin1.02)、第2(bin2.00)染色體的QTL(qLA 1-1和qLA 2-1)分別在多個群體中被檢測到，認(rèn)為是調(diào)控葉夾角性狀的主效QTL。Wassom[25]利用B73×Mo17構(gòu)建的群體，對調(diào)控葉夾角發(fā)育相關(guān)QTL進(jìn)行定位，檢測到了3個QTLs，分布于第1、5及9號染色體，分別解釋了16.4%、13.9%和10.4%的葉夾角表型變異。Ding等[26]首次在玉米中采用Four-way的策略，利用4個玉米自交系構(gòu)建的定位群體，在兩個環(huán)境中，共檢測到14個控制葉夾角QTL位點(diǎn)，其中7個和已經(jīng)發(fā)表的控制葉夾角位點(diǎn)或基因重合，另外7個為該群體檢測到的新位點(diǎn)，并將其中4個位點(diǎn)構(gòu)建了近等基因系，用于后續(xù)精細(xì)定位。Li等[19]采用3個RIL群體，利用Genotyping-by-sequencing (GBS) 的基因型策略，以及6個環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)，通過不同RIL群體聯(lián)合分析作圖，對包含葉夾角以及其相關(guān)的3個性狀分析，得到了45個QTL位點(diǎn)，解釋的表型變異范圍1.2%～29.2%，而且每個性狀的QTL解釋的變異總和在60%左右。其中， 4個QTL位點(diǎn)位于較小的區(qū)間，并找到了一些候選基因。常立國等[27]以150個重組自交系群體為供試材料，對兩年3點(diǎn)試驗(yàn)的穗三葉葉夾角表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL 定位，結(jié)果表明有3個QTLs(qSecLA 1-1、qThiLA 1-1和qThiLA 5-1) 分別在3種及以上環(huán)境中同時被檢測到，是控制玉米葉夾角的主效QTL。郭書磊等[2]將來自不同群體和不同實(shí)驗(yàn)的控制葉形性狀的QTL進(jìn)行整合，利用Meta-QTL統(tǒng)計學(xué)方法對前人研究發(fā)現(xiàn)的592個葉形QTLs綜合分析，明確了控制葉夾角性狀“一致性”的17個QTLs，縮小了QTL置信區(qū)間，提高了在染色體定位上的準(zhǔn)確度。李威亞[28]以玉米大芻草滲入系BC2F5群體為材料，在第2染色體短臂上定位了控制葉夾角的兩個相鄰的QTLs(qLA 2-1和qLA 2-2)，分別解釋了9.16%和10.93%的表型變異，并證明了增加葉夾角的等位基因來自大芻草。Zhao等[29]利用573份F1群體對玉米株高、葉夾角、葉長和葉寬進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)研究，針對這4種性狀，共鑒定出36個高度顯著相關(guān)的數(shù)量性狀SNPs，占表型變異的51.9%～79.9%，主要受加性、顯性和環(huán)境特異性影響。Dzievit等[30]通過單個群體內(nèi)的連鎖圖譜或跨群體的聯(lián)合連鎖圖譜，檢測到了495個調(diào)控葉及葉夾角大小相關(guān)的QTLs，每個QTL能解釋的表型方差范圍在0.41%～85.05%之間。此外，通過Meta分析了325個非冗余QTLs，將這些結(jié)果與其他報道的QTLs相結(jié)合，確定了基因組中與葉夾角變異相關(guān)的58個區(qū)域，將這些QTLs區(qū)域作圖，分布在玉米的10條染色體上[30]。其中一些區(qū)域含有已知的影響玉米葉夾角的基因，而其他區(qū)域則含有來自水稻基因在玉米中對應(yīng)的同源基因，這些基因與改變細(xì)胞大小和葉片葉節(jié)處彎曲有關(guān)，供其他學(xué)者深入研究調(diào)控葉夾角的候選基因提供了參考。雖然在控制葉夾角發(fā)育方面，檢測到了諸多控制其表型的QTLs，但是，由于不同研究人員選擇的實(shí)驗(yàn)方法不同，試驗(yàn)環(huán)境不同、構(gòu)建的群體類型、選取的性狀、作圖群體等均存在差異，在不同群體范圍下定位到的QTLs，可能由于標(biāo)記密度的限制，難以覆蓋控制目標(biāo)性狀的全部QTLs，并且定位到的大多QTLs置信區(qū)間遺傳距離較大，不同研究之間的可重復(fù)性較低，解釋控制葉夾角遺傳性狀的核心區(qū)間仍然不清楚，使得上述QTLs大多數(shù)難以真正有效地應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇等育種實(shí)踐中，給生產(chǎn)帶來巨大的增產(chǎn)效益。因此，還需要在此基礎(chǔ)之上，精細(xì)定位一些控制葉夾角發(fā)育及調(diào)控其夾角大小的關(guān)鍵基因，挖掘其功能。

3 玉米葉夾角基因的克隆

由于玉米基因組較大，全基因組測序完成時間短，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)不成熟等劣勢，對基因功能研究近幾年才興起，因此克隆到參與調(diào)控葉夾角大小的基因非常有限。Moreno等[31]通過對玉米Liguleless1(lg1)功能缺失突變體的研究表明，LG1基因缺失，葉舌和葉耳缺失，葉片和葉鞘的連接處發(fā)育異常，葉夾角明顯變小。LG1編碼一個SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白，主要在剛發(fā)育葉的葉舌區(qū)表達(dá)。利用玉米轉(zhuǎn)座因子(Ac)標(biāo)簽法，將lg1的等位基因LG-ML分離克隆，RT-PCR結(jié)果表明，LG1基因在lg-ml突變體中表達(dá)量急劇降低，證實(shí)了LG1以一種細(xì)胞自主方式產(chǎn)生功能[32]。玉米Liguleless2(lg2)突變體葉舌和葉耳缺失，或葉環(huán)發(fā)育不正常，葉舌和葉耳異位發(fā)育，葉夾角明顯變小。LG 2蛋白被證明編碼一個堿性亮氨酸拉鏈蛋白(bZIP)，它的表達(dá)時間比LG 1早，可能決定幼葉原基葉環(huán)的正確起始[33]。lg2的表型是非細(xì)胞自主方式發(fā)揮功能的，經(jīng)過對lg1lg2雙突變體的分析研究，兩者作用在葉枕發(fā)育過程的同一條通路之中，共同調(diào)控葉枕的發(fā)育，直接影響葉夾角的大小[34]，認(rèn)為最終的葉枕和葉夾角大小由細(xì)胞分裂產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞伸長形成的細(xì)胞大小共同決定。Juarez等[35-36]發(fā)現(xiàn)Rolledleaf1(rld1)和Leafbladeless1(lbl1)表現(xiàn)出近軸/向上的葉部形態(tài)，成功克隆了RLD1基因，編碼HD-ZIPIII蛋白；半顯性突變體Rld1-Original(Rld1-O)中HD-ZIPIII基因的單堿基替換，使其不能被miRNA166識別，導(dǎo)致HD-ZIPIII轉(zhuǎn)錄本持續(xù)表達(dá)，引起葉片偏向近軸端，發(fā)現(xiàn)LBL1和RLD1-O基因拮抗表達(dá)，在同一信號路徑中調(diào)控玉米葉形態(tài)發(fā)育，且LBL1作用于RLD1的上游，在葉原基發(fā)育過程中決定細(xì)胞命運(yùn)。Ku等[16]通過豫82和沈137所構(gòu)建的F2:3家系，圖位克隆到控制葉夾角的基因ZmTAC1(Tilleranglecontrol1,TAC1)，其位于2號染色體qLA 2區(qū)域。ZmTAC1與水稻OsTAC1基因高度同源，編碼一個263個氨基酸的未知功能蛋白質(zhì)。通過RT-PCR檢測分析，ZmTAC1表達(dá)量在玉米葉鞘中最高，在葉片和莖尖中次之。在緊湊型自交系豫82中，測序發(fā)現(xiàn)5′-UTR端序列為“CTCC”，在平展型自交系沈137中，5′-UTR端為“CCCC”，該變化影響了ZmTAC1在不同品種之間的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而進(jìn)一步影響葉夾角的大小。該實(shí)驗(yàn)還檢測了31個不同葉形玉米品種的ZmTAC1基因的5′-UTR端序列，得出了與親本自交系相同的結(jié)果，即平展型品種的ZmTAC1基因的5′-UTR端序列為“CCCC”，而緊湊型品種的ZmTAC1基因的5′-UTR端序列為“CTCC”，證明了ZmTAC1基因表達(dá)差異是通過5′-UTR位點(diǎn)序列′CTCC′-′CCCC′的變化所調(diào)控的，進(jìn)而影響葉夾角的發(fā)育和大小[16]。Ku等[24]定位了與葉夾角發(fā)育相關(guān)基因YABBY9、YABBY15，調(diào)控玉米葉近-遠(yuǎn)軸端發(fā)育模式，在葉原基發(fā)育初期表達(dá)。Zhang等[37,8]利用近等基因系D132-NIL和D132，克隆了ZmCLA4(Contollingleafangle4,CLA4)基因，控制玉米葉夾角發(fā)育，該基因在D132-NIL和D132之間存在兩個SNPs位點(diǎn)和兩個片段插入/缺失突變。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，兩個多態(tài)性位點(diǎn)CA/indel 965和C/T/mutation 607與葉夾角之間存在顯著關(guān)聯(lián)(P=10-7)，并且RNA干擾以及基因超表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明：葉夾角大小和ZmCLA4基因表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，即葉夾角越大，ZmCLA4表達(dá)量越低，葉夾角越小，表達(dá)量越高。Strable[38]發(fā)現(xiàn)了一個具有葉片結(jié)構(gòu)變異的玉米突變體，并命名為Droopingleaf1(drl1)，DRL1基因突變影響葉長和寬度、葉角、節(jié)間長度和直徑，是一個多效基因，并且這些表型通過drl2位點(diǎn)的自然變異而增強(qiáng)。DRL1基因?qū)θ~片組織的形成、發(fā)育和細(xì)胞增殖具有重要的調(diào)控作用。利用NAM-RIL群體全基因組關(guān)聯(lián)分析研究表明，DRL1基因位于控制葉夾角、葉寬及節(jié)間長度的數(shù)量性狀位點(diǎn)內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)了稀有單核苷酸多態(tài)性變異對葉夾角具有明顯的表型效應(yīng)。隨著基因組編輯技術(shù)的成熟和在植物中的廣泛應(yīng)用，Li等[39]基于CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，用一種RNA引導(dǎo)性核酸內(nèi)切酶(A RNA-guided endonuclease,RGEN)系統(tǒng)對不同玉米自交系的LG1基因進(jìn)行編輯，篩選出弱突變類型的等位變異，將促進(jìn)lg1特異改變?nèi)~夾角大小的利用。Lu等[40]對吉林省的80份骨干自交系進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得了22個與葉片夾角表型顯著相關(guān)的SNPS，分別分布在第1、3、4、5、6、7、8和9號染色體上，解釋了21.6%的變異表型，并從182個重組自交系中篩選出5個葉片角度顯著變化的自交系，分析到5個控制葉片角度大小的候選基因，其中，GRMZM2G039583基因在調(diào)控葉夾角表型中貢獻(xiàn)率為21.6%，編碼與細(xì)胞信號通路相關(guān)的SNARE蛋白。趙小強(qiáng)[41]利用廊黃及昌7-2、TS141玉米自交系構(gòu)建了含有258個單株的F2:3群體，將同時調(diào)控葉夾角和葉向值的主效穩(wěn)定表達(dá)的QTLs(stable QTLs， sQTL)(umc2177-umc1378)進(jìn)行了基因定位，克隆到了該主效sQTL區(qū)間內(nèi)存在的目標(biāo)基因Zm00001d018659_T006，同時調(diào)控玉米葉夾角和葉向值。Wei等[42]闡明了ZmSPL基因在調(diào)控葉夾角等農(nóng)藝性狀方面的作用，并探討了利用ZmSPL基因改善玉米植株結(jié)構(gòu)和單產(chǎn)的途徑。表1中匯總了前人已經(jīng)克隆或者已知調(diào)控葉夾角發(fā)育功能的部分基因信息，可供參考。

盡管前人研究了較多調(diào)控葉夾角發(fā)育的QTLs和基因，但葉夾角大小性狀由多基因調(diào)控，調(diào)控方式比較復(fù)雜，單基因在表型控制方面貢獻(xiàn)效率較低，且受環(huán)境影響較大，大多研究都是基于構(gòu)建不同的群體，粗定位到大致QTLs區(qū)域，使得單一環(huán)境及小群體定位到的QTLs和基因位點(diǎn)穩(wěn)定性較差，不同群體、不同環(huán)境下可重復(fù)性也較差，很難將理論研究應(yīng)用于育種過程。因此，在控制葉夾角發(fā)育研究中，仍亟待我們開展以上QTLs的精細(xì)定位，確定調(diào)控表型的關(guān)鍵基因并對其功能進(jìn)行詳細(xì)注釋，在遺傳學(xué)及生理生化解析基礎(chǔ)上，進(jìn)行關(guān)鍵基因之間信號通路的探索研究，才能真正為玉米株型相關(guān)的分子育種提供可靠理論依據(jù)。

4 葉夾角形成的分子機(jī)制及代謝途徑

葉夾角是一種被多種植物激素調(diào)節(jié)的農(nóng)藝性狀，主要由葉枕處(葉片與葉鞘的連接處)細(xì)胞大小所決定的[50-52]。水稻中直立葉片的細(xì)胞學(xué)觀察表明，直立葉片葉枕處的細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞長度變短，因此產(chǎn)生了較小的葉夾角。相反平展型葉片的葉枕近軸端細(xì)胞細(xì)長，因此導(dǎo)致葉片彎曲下垂，具有較大的葉夾角[50-52]。細(xì)胞的伸長是指在細(xì)胞膨脹的情況下，細(xì)胞壁的松弛、合成以及添加新的細(xì)胞壁成分[53-54]。細(xì)胞的伸長受到多種激素的調(diào)節(jié)，比如：生長素、赤霉素以及油菜素內(nèi)酯等。這些激素可以刺激多糖的合成，增加細(xì)胞壁的彈性，進(jìn)而合成新的細(xì)胞壁成分，促使細(xì)胞的伸長[55-57]。

表1 玉米葉夾角發(fā)育相關(guān)基因信息Table 1 Genetic information related to leaf angle development of maize

在禾本科作物中，前人研究結(jié)果表明，油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids，BRs)和葉夾角形成密切相關(guān)。在玉米、水稻以及高粱中，很多參與BRs合成、信號傳遞相關(guān)的基因被鑒定和研究，參與BRs信號通路的基因，其突變體大多數(shù)表現(xiàn)出葉夾角變小的表型[58-59]。對這些BRs合成缺陷或者功能喪失的突變體的機(jī)理研究，建立起了通過控制葉枕處細(xì)胞分裂或者抑制細(xì)胞伸長導(dǎo)致葉夾角變小的機(jī)制[55-56,59]。例如，細(xì)胞周期蛋白CYC U4;1可通過控制遠(yuǎn)軸面厚壁組織細(xì)胞增殖，正向調(diào)控葉片的直立性[49]。當(dāng)BR缺失或信號受阻時，BR信號傳導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)控蛋白激酶(Brassinosteroid insensitive 2,BIN 2)，可以磷酸化CYC U4; 1蛋白，進(jìn)而增加葉枕處遠(yuǎn)軸面主維管束外側(cè)的厚壁細(xì)胞層數(shù)，促使葉片直立。在高濃度BR條件下，BIN 2功能受到抑制，莖葉夾角變大主要是由葉枕近軸面薄壁細(xì)胞伸長和遠(yuǎn)軸面的厚壁細(xì)胞層數(shù)減少共同調(diào)控。此外，BR信號通過BES 1(Bri 1-EMS-suppressor 1)調(diào)控CYC U4;1表達(dá)，并通過GSK 3激酶調(diào)控CYC U4;1蛋白活性，進(jìn)而抑制遠(yuǎn)軸面厚壁組織細(xì)胞分裂，從而造成葉夾角大小的表型[49]。其他研究也表明，水稻BR轉(zhuǎn)錄因子Brassinazole resistant 1 (BZR 1) 積累可以增加葉夾角，OsBZR1RNAi抑制了BZR1的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植株葉片直立，葉夾角減小[60-61]。同時,水稻基因Leafandtillerangleincreasedcontroller(OsLIC)是和BZR1功能相反的基因，該基因的超表達(dá)可以使水稻葉片直立，葉夾角減小[61]。以上結(jié)果說明，BR對于葉夾角的形成具有重要的作用。

BR和GA共同調(diào)控葉夾角的研究有很多報道。例如水稻GA響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子家族GA-stimulated transcript gene(OsGSR1)，它可以和BR合成基因DWF1互作，作為BR合成下游的正調(diào)控因子[62]。OsGSR1表達(dá)量下降的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為內(nèi)源BR水平降低，表型和BR突變體類似，即植株變矮，葉夾角減小[56,62]。玉米BR合成缺陷突變體Nanaplant2-1(na2-1)、na1-1以及GA合成缺陷突變體d1表現(xiàn)為水平葉夾角，然而當(dāng)施加外源GA以后，它們表現(xiàn)出直立葉片，葉夾角也變小[48]。Best等[48]研究表明，GA相關(guān)突變體、BR相關(guān)突變體以及GA-BR雙突變體都會嚴(yán)重影響到株高、葉夾角、分蘗以及育性。綜合前人研究結(jié)果可以認(rèn)為，BR和GA相關(guān)基因復(fù)雜的網(wǎng)狀調(diào)控作用是調(diào)控葉夾角發(fā)育的重要機(jī)制，并且來自于兩種激素的雙突變體會嚴(yán)重影響到植株的形態(tài)建成及其育性。

IAA也參與調(diào)控葉夾角形成和發(fā)育，作用機(jī)制比較復(fù)雜。例如，Leafinclination1(LC1)基因編碼一種OsGH3-1,IAA氨基合成酶，它通過將多余的生長素結(jié)合到不同種類的氨基酸(比如丙氨酸及天冬氨酸等)上來調(diào)節(jié)生長素的穩(wěn)態(tài)[63]。lc1-D突變體有很少的自由IAA，表現(xiàn)出較長的葉枕細(xì)胞以及平展角度的旗葉。另外，在水稻中，超表達(dá)Auxinresponsefactor19(OsARF19)基因，可以使得更多活性IAA被抑制因子束縛，因而可以增強(qiáng)細(xì)胞分裂，使得葉夾角變大[64]。

5 問題與展望

高產(chǎn)始終是育種家追求的核心目標(biāo)。近年來，理想株型育種已成為玉米遺傳育種家們普遍關(guān)注的熱點(diǎn)[4]，玉米葉夾角又是影響高密度育種的一個重要性狀，與株型育種及產(chǎn)量高度相關(guān)，因此，對調(diào)控葉夾角發(fā)育的機(jī)理研究也越受到重視。通常情況下，單位面積種植密度越高的玉米品種，葉夾角相對越小，尤其是植株穗上葉葉片直立上沖，相互之間不遮蔭，透光性強(qiáng)，促進(jìn)頂層光合作用和利用效率，根莖吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力強(qiáng)，因此，穗上葉葉夾角較小的自交系被育種家所青睞，可用于選育耐密的新品種。雖然國內(nèi)外已經(jīng)對控制玉米葉夾角的發(fā)育、QTL 定位及遺傳規(guī)律等方面做了許多工作，但是仍存在以下問題：(1)對調(diào)控葉夾角株型中的關(guān)鍵性基因克隆不夠，以及對葉夾角形成及發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的研究仍比較淺顯；(2)前人研究控制葉夾角性狀QTL的局限性，由于所用的親本群體無法覆蓋全部玉米種質(zhì)，分子標(biāo)記密度不足，檢測到控制葉形性狀的QTL有限，并且定位到的大多QTL置信區(qū)間遺傳距離較大，已有的定位結(jié)果并不能檢測到目標(biāo)性狀相關(guān)的QTL，兩者并不完全重疊，使得大多研究難以應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助選擇等育種實(shí)踐中。隨著二代高通量測序、轉(zhuǎn)錄組測序等成本的降低，以及測序精準(zhǔn)度的提高，應(yīng)該在基因克隆及功能解析中有更深入的研究：(1)需要在前人檢測到的QTL基礎(chǔ)上，精細(xì)定位更多控制葉夾角發(fā)育及其夾角大小的關(guān)鍵基因，闡述其功能及作用機(jī)理；(2)基于基因編輯技術(shù)在各作物中的廣泛應(yīng)用，可以通過反向遺傳學(xué)手段，將在禾本科作物水稻及模式作物二穗短柄草中控制葉夾角發(fā)育關(guān)鍵基因，在玉米B73基因組中找尋相同物理位置或相似功能注釋的同源基因，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行單基因或者多基因編輯，篩選葉夾角發(fā)育變異突變體，以此挖掘控制目標(biāo)性狀的基因或者基因家族。將進(jìn)化過程中調(diào)控植物葉夾角性狀非常保守的功能基因或保守信號通路引用到玉米研究中，再進(jìn)行功能驗(yàn)證，可以大大縮短摸索時間?？傊?，進(jìn)一步發(fā)掘調(diào)控玉米葉夾角的關(guān)鍵基因并對其功能詳細(xì)注釋分析，顯得尤為重要，不僅有助于剖析葉夾角的遺傳基礎(chǔ)，增加對其遺傳結(jié)構(gòu)的了解，系統(tǒng)研究其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，闡明葉夾角形成的分子機(jī)制，還可為耐密理想株型的分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)，在玉米高密度育種及株型育種中也具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。