生物有機(jī)肥防治煙草青枯病及對(duì)土壤微生物多樣性的影響

吳曉宗，王 巖

（1.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia Solanacearum）引起的土傳病害，它的發(fā)生不僅與高溫高濕的氣候有關(guān)，還與土壤種類、土壤養(yǎng)分、連作情況、移栽時(shí)期、田間管理等有關(guān)，難以有效防治［1-3］。近年來，人們選育出對(duì)病原菌具有拮抗效果的微生物制成生物有機(jī)肥，用來防治土傳病害，不僅能增加土壤中有益微生物數(shù)量，增強(qiáng)煙株抗病性，還能改善根際微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)根系生長(zhǎng)和對(duì)養(yǎng)分的吸收，在防病的同時(shí)還可以改善和修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境，減少化肥和農(nóng)藥的使用，突破了傳統(tǒng)有機(jī)肥的肥料效果，受到了廣泛的重視［4-5］。

土壤微生物多樣性用于表征土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變異、相互作用、營(yíng)養(yǎng)水平和組成數(shù)量變化，能較早地反映土壤生態(tài)的變化過程，通過調(diào)控土壤微生物群落以及改變土壤微生物功能多樣性可以抑制作物病蟲害［6-7］。近年來發(fā)展起來的宏基因組學(xué)利用分子生物學(xué)的研究方法繞過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法來研究微生物的多樣性及功能，為土壤微生物研究開辟了新的道路［8-9］。

實(shí)驗(yàn)室已從福建省邵武市青枯病發(fā)病嚴(yán)重的原位土壤中篩選出拮抗菌［10］，并利用該拮抗菌制成生物肥［11］。本研究考查了該生物肥施用后對(duì)煙草青枯病的防治效果，利用高通量宏基因組測(cè)序法研究土壤微生物多樣性特征差異，揭示生物肥對(duì)土壤微生物多樣性影響以及和防治青枯病之間的內(nèi)在關(guān)系，為生物防治煙草青枯病提供進(jìn)一步的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2014年3月至8月在邵武市徐溪村青枯病常發(fā)煙田進(jìn)行試驗(yàn)，該地塊于2012、2013年連續(xù)兩年青枯病發(fā)病非常嚴(yán)重。試驗(yàn)共設(shè)置2個(gè)處理，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，共6個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積固定為132 m2，設(shè)有保護(hù)行，煙株種植密度為16 500株/hm2，行間距為0.5 m×1.2 m。

在植煙移苗前進(jìn)行施肥，采用分層施肥的方法，煙葉專用肥與化肥施用量折算為純氮用量136.35kg/hm2，N∶P∶K 為 1∶0.8∶2.7。邵武煙草公司提供有機(jī)肥，有機(jī)肥為秸稈堆肥（秸稈與動(dòng)物糞便混合比例為8∶2）。鄭州大學(xué)提供拮抗菌劑，其有效菌為蠟狀芽孢桿菌 QJ-1（No.M2012271）［10］，向已降至40℃以下的秸稈堆肥中接入拮抗菌，接種量為108cfu/g（干基），生產(chǎn)生物有機(jī)肥。其它大田管理措施按邵武市優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行。處理設(shè)置如下:

T1處理:常規(guī)施肥（施煙葉專用肥+化肥+有機(jī)肥，對(duì)照）；

T2處理:施生物有機(jī)肥（施煙葉專用肥+化肥+生物有機(jī)肥，煙葉專用肥、化肥的施用量同常規(guī)施肥，生物有機(jī)肥施用量按常規(guī)施肥施用的有機(jī)肥量所生產(chǎn)的生物有機(jī)肥量進(jìn)行）。

1.2 試驗(yàn)方法

土壤取樣方法:采用五點(diǎn)取樣法取根際土樣［12］，樣品編號(hào)見表1。

表1 土壤樣品分類與編號(hào)

土壤微生物多樣性測(cè)定:利用OMEGA試劑盒提取土壤DNA。送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序和多樣性分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析與試驗(yàn)觀測(cè)

采用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。依據(jù)《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》（GB/T 23222-2008）記載青枯病發(fā)生病情級(jí)數(shù)，以株為單位分組調(diào)查病害嚴(yán)重程度，病情指數(shù)計(jì)算如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 生物有機(jī)肥對(duì)煙株青枯病防治的效果

本試驗(yàn)所用的生物有機(jī)肥對(duì)煙草青枯病的抑制作用較為明顯，在以往發(fā)病嚴(yán)重的煙田中施入后，青枯病的發(fā)生情況顯著減輕，通過田間試驗(yàn)觀測(cè)，青枯病從煙株移栽83 d時(shí)開始出現(xiàn)，青枯病病情指數(shù)如圖1所示。在煙株移栽85、95、105 d的3次觀察期內(nèi)，T2的病情指數(shù)均低于T1，尤其在移栽后95 d時(shí)，青枯病病情指數(shù)下降了31.43%，說明施用生物肥可以有效抑制煙草青枯病的發(fā)生，降低病情指數(shù)，提高防控效果。

圖1 兩種處理對(duì)煙株青枯病發(fā)病的影響

2.2 生物有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 土壤細(xì)菌群落多樣性分析

7個(gè)樣本的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)如表2所示，Coverage表示測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例。Shannon指數(shù)反映細(xì)菌群落的變化度或差異度，受樣本總數(shù)和均勻度的影響，數(shù)值越大，表明土壤中微生物多樣性越高［6-8］。ACE指數(shù)反映物種豐富度，值越大，表明群落中含有的OTU（Operational taxonomic units）數(shù)目越多，群落豐富度越高。

表2 不同土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

各樣本的Coverage值均高于0.7，表明測(cè)序獲得的序列覆蓋程度較高，具有較好的代表性。這反映出本試驗(yàn)構(gòu)建的克隆文庫能比較真實(shí)代表該地區(qū)土壤細(xì)菌的多樣性。T2處理的Shannon指數(shù)均比同期T1處理的要大，說明生物肥的添加提高了土壤中細(xì)菌的多樣性。T1與T2處理中發(fā)病煙株土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)均大于健康煙株土壤和發(fā)病前煙株土壤，說明青枯病的發(fā)病與土壤細(xì)菌多樣性有一定關(guān)系。發(fā)病后T1B 的ACE指數(shù)比發(fā)病前T1W增加了12.05%，豐富度指數(shù)提高不明顯。而T2B的ACE指數(shù)比T2W增加了42.67%，說明生物肥的添加對(duì)青枯病發(fā)病時(shí)煙株土壤細(xì)菌種群豐富度影響較大。

2.2.2 生物有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)7個(gè)樣本土壤細(xì)菌群落的組成在科與屬水平上進(jìn)行了相對(duì)豐度的比較。從表3中可以看出，在科水平上，煙株移栽前TY樣本的土壤草酸桿菌科Oxalobacteraceae、芽孢桿菌科Bacillaceae、梭菌科Clostridiaceae相對(duì)豐度明顯高于煙株移栽后各樣本。T1W、T2W與T1C、T2C細(xì)菌群落豐度相差不大，與T1B、 T2B相比差距明顯，比如鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae、間孢囊菌科Intrasporangiaceae在煙株發(fā)病的土壤中含量較低，說明在科水平上，移栽后70 d的煙株發(fā)病前土壤樣本與移栽后90 d的健康煙株土壤樣本細(xì)菌群落相似，而移栽后90 d的發(fā)病煙株土壤樣本細(xì)菌群落則差別較大，這與青枯病的發(fā)病密切相關(guān)。

表3 科水平各土壤樣本細(xì)菌群落的相對(duì)豐度 （%）

由圖2可知，在屬水平上，TY細(xì)菌種類最少，群落結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，未分類細(xì)菌和其他類細(xì)菌的含量也較低，已分類細(xì)菌中Massilia含量最高，為優(yōu)勢(shì)菌。T1C、T2C、T1B、T2B未分類細(xì)菌的相對(duì)豐度逐漸上升，說明未分類細(xì)菌中種類和數(shù)量在增加；而已分類細(xì)菌種類相似，優(yōu)勢(shì)菌都為:酸桿菌Gp1（Acidobacteria_Gp1）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、酸桿菌Gp3（Acidobacteria_Gp3）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium），但相對(duì)豐度差異較大。

圖2 屬水平各土壤樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

在對(duì)T1C、T1B和T2C、T2B比較后發(fā)現(xiàn)，發(fā)病煙株根際土壤區(qū)系中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）均未出現(xiàn)，而在未發(fā)病煙株根際土壤中，卻有著一定的相對(duì)豐度，可能與煙草青枯病發(fā)病相關(guān)。

2.2.3 不同樣本細(xì)菌群落主成分分析

對(duì)7個(gè)樣本進(jìn)行細(xì)菌組成的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），提取兩個(gè)主成分因子，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）是造成4個(gè)樣品的兩個(gè)最大差異特征，分別可以解釋為所有變量的56.4%和20.2%，兩個(gè)主成分累加方差貢獻(xiàn)率達(dá)到76.6%，可以表征大多數(shù)的標(biāo)量特征。因此，取兩個(gè)主成分（PC1和PC2）作圖來表示細(xì)菌群落的特征，見圖3。

從 圖3可 以 看 出， 相 比TY，T1W、T2W、T1C、T2C、T1B、T2B 中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了較大改變。在第一主成分上，TY與T1B處理土壤細(xì)菌群落組成基本一致，與T1W、T2W處理存在較大差異。在第二主成分上，TY、T1W、T2W、T1C和T2C處理間的土壤細(xì)菌群落組成具有一致性，PC2的貢獻(xiàn)率大于PC1的貢獻(xiàn)率，可以認(rèn)為生物肥是影響土壤細(xì)菌群落組成的主要因素。

圖3 不同樣本細(xì)菌群落PCA分析

2.3 生物有機(jī)肥對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 土壤真菌群落多樣性分析

7個(gè)樣本的土壤真菌多樣性指數(shù)如表4所示，7個(gè)樣本的Coverage值均高于0.8，表明測(cè)序獲得的序列覆蓋程度較高，反映出本試驗(yàn)構(gòu)建的克隆文庫能比較真實(shí)代表該地區(qū)土壤真菌的多樣性。TY土壤中的OTU數(shù)目最高，T2C土壤中OTU數(shù)目大于T2W，且兩者均遠(yuǎn)大于T1B，說明生物肥的添加能增加土壤中真菌的多樣性，而T2處理下的發(fā)病土壤中Shannon指數(shù)要高于健康狀態(tài)下的，說明煙草青枯病的發(fā)生與土壤中真菌多樣性有關(guān)。發(fā)病后與發(fā)病前的ACE指數(shù)變化不大，說明施肥對(duì)土壤的真菌豐富度影響不大。

表4 不同樣本的土壤真菌多樣性指數(shù)

2.3.2 生物肥對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)7個(gè)樣本的土壤真菌群落的組成在科水平上進(jìn)行了相對(duì)豐度的比較，結(jié)果如表5所示。TY處理的土壤中被孢霉科Mortierellaceae含量最高，T2C處理的土壤除了被孢霉科Mortierellaceae增加外，其余的都有不同程度的降低，說明生物肥有利于該菌的生長(zhǎng)，是土壤中的優(yōu)勢(shì)菌。T2B處理的土壤中被孢霉科Mortierellaceae和叢赤殼科Nectriaceae的含量分別降低了76.1%、92.3%，而糞盤菌科Ascobolaceae的含量增加了64.9%，說明青枯病的發(fā)生與這3種菌科的含量變化有一定的關(guān)系。

表5 科水平各土壤樣本真菌群落的相對(duì)豐度 （%）

由圖4可以看出，在屬水平上，TY真菌種類最少，群落結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，未分類真菌和其他類真菌的含量也較低，已分類真菌中被孢霉屬M(fèi)ortierella含量最高，為優(yōu)勢(shì)菌。T1C、T2C、T1B、T2B未分類真菌的相對(duì)豐度逐漸上升，說明未分類真菌中種類和數(shù)量在增加；已分類真菌種類存在一定的差異，T1C優(yōu)勢(shì)菌為:被孢霉屬（Mortierella）、BG01－7、糞盤菌屬（Ascobolus）、暗殼腔菌屬（Phaeosphaeria），T2C的優(yōu)勢(shì)菌為:被孢霉屬（Mortierella）、叢赤殼屬（Nectria），T1B的優(yōu)勢(shì)菌為:被孢霉屬（Mortierella）、叢赤殼屬（Nectria）、Lulwoana，T2B優(yōu)勢(shì)菌為:BG01－7、被孢霉屬（Mortierella）、糞盤菌屬（Ascobolus）、酵母屬（Saccharomyces），并且相對(duì)豐度存在一定的差異。

在對(duì)T1C、T1B和T2C、T2B比較后發(fā)現(xiàn)，發(fā)病煙株根際土壤區(qū)系中田頭菇屬（Agrocybe）均未出現(xiàn)，而在未發(fā)病煙株根際土壤中，卻有一定的相對(duì)豐度，可能與煙草青枯病發(fā)病相關(guān)。

2.3.3 不同樣本真菌群落主成分分析

對(duì)7個(gè)樣本進(jìn)行真菌組成的主成分分析，提取兩個(gè)主成分因子，分別可以解釋所有變量的42.7%和26.1%，兩個(gè)主成分累加方差貢獻(xiàn)率達(dá)到68.8%。從圖5可以看出，在第一主成分上，T2W與TY距離較遠(yuǎn)，土壤中的真菌菌落存在較大差異，說明生物肥是影響土壤真菌群落組成的主要因素。在第二主成分上，TY與T2W處理間的土壤真菌群落組成

具有一致性，而T2C與T2B距離較遠(yuǎn)，說明生物肥是影響土壤真菌群落組成的主要因素。

3 討論與結(jié)論

眾多研究表明，采用拮抗菌制成生物有機(jī)肥施用來防治植物病害具有良好的效果［13-14］，生物肥不僅滿足了植物的生長(zhǎng)需要，還為拮抗菌提供了足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其在根際土壤微生物區(qū)系中更易成為優(yōu)勢(shì)菌［15］。本研究中微生物有機(jī)肥的施用可以顯著降低煙草青枯病的病情指數(shù)，與王麗麗等［16］和陳巧玲等［17］的研究結(jié)果一致。生物肥的施用不僅抑制了煙草青枯病的發(fā)生，更促進(jìn)了煙葉的生長(zhǎng)和上等煙葉的比例，整體上提高了煙葉的經(jīng)濟(jì)性狀。

高通量宏基因組測(cè)序從土壤樣本中直接提取微生物DNA，避免了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法會(huì)遺漏土壤中絕大多數(shù)微生物的缺點(diǎn)，較為真實(shí)地反映了土壤微生物群落的豐度及其作用機(jī)制。T2發(fā)病株與健康株的香農(nóng)系數(shù)均比T1對(duì)應(yīng)處理要高，說明生物肥的加入提高了煙株根際土壤細(xì)菌的多樣性［18］。而發(fā)病株根際細(xì)菌數(shù)量高于未發(fā)病株，可能是因?yàn)榍嗫莶【谇秩爰闹鬟^程中或在侵入后，一定程度上干擾植物的正常代謝，而煙株為了抵抗這種變化，通過改變根系分泌物或內(nèi)生細(xì)菌來進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而造成根際微生物區(qū)系微生物種類增加，說明發(fā)病株青枯病菌誘導(dǎo)了根際環(huán)境發(fā)生變化。存在于發(fā)病株和健康株根際土壤中的細(xì)菌屬類大部分相同，尤其是優(yōu)勢(shì)菌都一樣，但相對(duì)豐度有差異。對(duì)于T1處理，發(fā)病株與健康株優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度差異較大，而施用生物肥的T2處理，發(fā)病株與健康株優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度差異不大，說明拮抗菌的加入，使得青枯病菌數(shù)量減少，或者說煙株更易于應(yīng)對(duì)青枯病菌的侵?jǐn)_，因而根際土壤微生物區(qū)系優(yōu)勢(shì)菌變化不大。在對(duì)T1C、T1B和T2C、T2B比較后發(fā)現(xiàn)，發(fā)病煙株根際土壤區(qū)系中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）均未出現(xiàn)，而在健康煙株根際土壤中，卻有著一定的相對(duì)豐度，可能與煙草青枯病發(fā)病有關(guān)。

圖4 屬水平各土壤樣本真菌群落結(jié)構(gòu)比較

圖5 不同樣本真菌群落PCA分析