黃綠綠僵菌侵染褐飛虱的電鏡觀察

張玨鋒，陳建明，李 芳，鐘海英，吳 鴻

(1.中國林業(yè)科學(xué)院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江.杭州 310021)

褐飛虱[Nilaparvatalugens(St?l)]是我國及東南亞水稻產(chǎn)區(qū)的主要害蟲之一，屬“r對策型”、遷飛性害蟲，多年來給我國水稻生產(chǎn)造成極大危害[1]。由于化學(xué)殺蟲劑在田間被多用、濫用，近年來褐飛虱的抗藥性日益增強(qiáng)，而且褐飛虱在對抗性水稻的為害過程中，容易產(chǎn)生新的致害性種群[2]。新的致害性種群的出現(xiàn)，使得大面積推廣種植的抗性品種水稻，如IR系列、Mudgo、ASD7等失去褐飛虱抗性。多因素累加，致使當(dāng)下褐飛虱的田間防控困難重重。

綠僵菌(Metarhiziumspp.)是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲防治的無性真菌[3-4]，具有強(qiáng)大的粘附寄主的功能，能夠以獨(dú)特的方式侵入昆蟲體壁，即使在堅硬的表面如玻璃等上都可產(chǎn)生附著胞。綠僵菌的附著胞具有穿刺作用的結(jié)構(gòu)，它可以沿氣孔開口處或直接刺透寄主表皮進(jìn)入寄主內(nèi)部[5-7]，也可通過消化道、傷口等途徑侵入蟲體[8-9]，使寄主感染微生物而死，對刺吸式害蟲的防治具有積極效果。同時，綠僵菌還具有田間再侵染的能力，為褐飛虱的生物防治提供了可能，有望成為化學(xué)殺蟲劑的良好替代物。但綠僵菌也具有起效時間長、對環(huán)境溫濕度要求高等缺陷，田間防效往往遠(yuǎn)不及實驗室效果，如從自然界感染綠僵菌的棕櫚象(Rhynchophorusferrugineus)上分離獲得的菌株僅在實驗室條件下有效[10]。相對于活動的蟲態(tài)，活體真菌對靜止蟲態(tài)作用時間更長，作用成功概率也更大。因此，明確綠僵菌是否能夠通過侵染褐飛虱卵巢實現(xiàn)繼代傳播，以及是否能夠侵染稻株內(nèi)卵塊從而致使卵塊無法孵化，對褐飛虱的生物防治具有應(yīng)用價值。有關(guān)綠僵菌對寄主昆蟲體壁侵染的過程，已在小菜蛾(Plutellaxylostalla)[11-12]、棕櫚象[13]、榛實象甲(Curculionucum)[14]、褐飛虱[15]上有過報道，但關(guān)于綠僵菌侵染寄主卵巢、卵塊的相關(guān)報道較少。

本試驗應(yīng)用掃描電鏡結(jié)合半薄切片觀察研究了黃綠綠僵菌(Metarhiziumflavoviride)對褐飛虱從體表侵染至體內(nèi)定殖、萌發(fā)的過程，以及入侵寄主卵巢的現(xiàn)象，可直觀地表現(xiàn)黃綠綠僵菌對褐飛虱的侵染能力和侵入方式，旨在為評價該菌的殺蟲作用和應(yīng)用前景提供基礎(chǔ)資料和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)研究所提供的黃綠綠僵菌。

供試褐飛虱在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所人工氣候培養(yǎng)室內(nèi)繁殖10代以上，選取發(fā)育狀況一致的褐飛虱成蟲作為接菌對象。

1.2 黃綠綠僵菌孢子懸浮液的配制

將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，(25±2)℃、無光條件下培養(yǎng)10 d，待真菌充分產(chǎn)孢后，用滅菌的接種環(huán)輕輕將該菌株的分生孢子粉刮到盛有5 mL 0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tween-80的三角瓶中，充分振蕩30 min后按比例稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)，配制成1.0×108mL-1的孢子懸浮液。

1.3 褐飛虱接菌方法

取褐飛虱成蟲10頭，用手握式噴霧器均勻噴施1.0×108mL-1的孢子懸浮液后接入45日齡TN1水稻苗，外罩玻璃罩，以噴施0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tween-80的褐飛虱為對照。處理后試蟲置于(28±2)℃、相對濕度85%和光/暗周期14 h/10 h的恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，72 h后取樣：部分解剖取卵巢，并做冷凍切片，觀察卵巢侵染狀態(tài)；部分用于制作半薄切片，觀察體壁侵染情況。持續(xù)觀察處理過的褐飛虱，其間如有死亡褐飛虱，取樣用于掃描電鏡觀察。

1.4 水稻植株接菌方法

取45日齡稻株洗凈，剪除葉片后將莖稈剪成5～7 cm小段，ddH2O沖洗3次，晾干后用小號縫衣針輕扎，模仿褐飛虱取食，用手握式噴霧器在模仿取食處均勻噴施1.0×108mL-1的孢子懸浮液。將處理后的水稻莖稈放入鋪有3層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，以噴施0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tween-80的莖稈為對照，72 h后取樣、切片，用于電鏡觀察。

1.5 褐飛虱卵塊接菌方法

取初孵褐飛虱雌雄成蟲各1頭，接入置有45日齡TN1稻株的盆缽中產(chǎn)卵，外罩玻璃罩，48 h后移去褐飛虱雌雄成蟲，于莖稈部噴施1.0×108mL-1的孢子懸浮液10 mL，以噴施0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tween-80的稻株為對照。將帶卵稻株置于(28±2)℃、相對濕度85%和光/暗周期14 h/10 h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后解剖稻株取卵塊用于掃描電鏡觀察。取對照稻株中卵塊10枚，噴施黃綠綠僵菌后置于滅菌水瓊脂平板上，以噴施0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tween-80的卵塊為對照，(28±2)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后用于掃描電鏡觀察。

1.6 綠僵菌對褐飛虱卵塊孵化率及幼蟲、成蟲歷期的影響

取初孵褐飛虱雌雄成蟲各1頭，噴施1.0×108mL-1的孢子懸浮液，作為處理(T)，以噴施0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tween-80作為對照(CK)。處理后的試蟲接入45日齡TN1水稻苗，放入(25±2)℃、相對濕度85%和光/暗周期14 h/10 h的恒溫培養(yǎng)箱中產(chǎn)卵，每處理10個重復(fù)，每24 h換置一批稻苗。72 h后移去褐飛虱，后期檢查卵塊孵化率及各蟲態(tài)發(fā)育歷期。

1.7 掃描電鏡處理方法

所取樣品用3%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛隔夜固定12 h后，用鋨酸固定12 h，磷酸緩沖液浸洗3次，每次30 min，然后依次用體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇逐級梯度脫水，每級12 h，其中用100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫水2次[16]。醋酸異戊酯置換2次，每次停留30 min。樣品置于室溫下自然干燥后，用導(dǎo)電膠將樣品粘于掃描電鏡樣品臺上，然后經(jīng)離子濺射法噴金，在TM-1000 HICHMI型掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.8 半薄切片處理方法

取褐飛虱樣品置于卡諾固定液中固定12 h后，依次于體積分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、95%的乙醇中逐級脫水，每級脫水3 h，脫水后材料按塑料包埋劑(Technovit7100)的說明書中方法進(jìn)行包埋，之后將樣品置于預(yù)滲透液(等體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇與base liquid Technovit7100混合)中，12 h后轉(zhuǎn)入滲透液(1 g硬化劑1溶于100 mL base liquid Technovit7100)，滲透6～12 h后在小包埋孔中擺好，后置于新鮮包埋液(硬化劑1與base liquid Technovit7100的質(zhì)量體積比為1∶15)中，聚合2 h以后，于Leica Ultracut R型超薄切片機(jī)切片，厚度1 μm，切好的片子用小銅網(wǎng)撈片，直接轉(zhuǎn)到滴有水的干凈載玻片上，電熱臺展開、烘干后，用加拿大樹膠封片。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃綠綠僵菌分生孢子在褐飛虱體表的侵染過程

由掃描電鏡觀察結(jié)果可知：黃綠綠僵菌侵染褐飛虱時，在寄主褐飛虱體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)的入侵行為存在一定差異。黃綠綠僵菌最先從寄主腹部侵染(圖1-A)，推測可能是由于褐飛虱腹部褶皺處較多，易于菌體入侵。菌體在褐飛虱腹部定殖后慢慢延伸至寄主背部褶皺凹陷處(圖1-B)，再逐步侵染至背部體壁光滑處，以菌絲體形式包圍寄主蟲體后繼續(xù)延伸侵染至寄主褐飛虱的翅(圖1-C、D)、復(fù)眼(圖1-E)、觸角(圖1-F)等部位。黃綠綠僵菌侵染褐飛虱以后，在寄主表皮以孢子(圖1-G)和菌絲體(圖1-H)2種形態(tài)存在。已有的研究表明，綠僵菌以附著孢和菌絲體的方式侵入寄主蟲體，侵染過程中附著胞的產(chǎn)生受寄主表皮營養(yǎng)條件、pH值等的影響。在本試驗中我們也觀察到，黃綠綠僵菌分生孢子附著于寄主體表后，可利用體表的營養(yǎng)物質(zhì)萌發(fā)產(chǎn)生芽管，形成附著胞入侵(圖1-C)，當(dāng)未找到侵入點時，則形成菌絲在寄主體表橫向生長(圖1-D)，尋找體表較薄弱部位侵入。

2.2 黃綠綠僵菌分生孢子對稻株的侵染觀察

觀察黃綠綠僵菌處理的模擬褐飛虱取食水稻莖稈部切片可見：橫切面的表皮、基本組織和維管束完整，排列整齊(圖2-A)，與對照處理(圖2-B)相比無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)有明顯外力破壞痕跡。同時，鏡檢也未在稻莖體腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)有類似于黃綠綠僵菌孢子或菌絲體的物質(zhì)。

如圖3所示，黃綠綠僵菌溶液處理稻株中解剖獲得的卵塊(圖3-A)與對照稻株內(nèi)解剖獲得的卵塊(圖3-B)，在電鏡觀察下兩者外觀形態(tài)相似，體表光滑，無明顯菌絲黏附，但在處理稻株內(nèi)獲得的卵塊體表可觀察到少量的黃綠綠僵菌孢子(圖3-C)。黃綠綠僵菌處理的離體褐飛虱卵塊72 h后即被大量菌絲體包被(圖3-E)，且卵塊表面可觀察到黃綠綠僵菌菌絲體及分生孢子(圖3-F)。由以上結(jié)果推測：黃綠綠僵菌并不能在水稻植株內(nèi)定殖，但可定殖于離體的褐飛虱卵塊，因而噴施于稻株表面的黃綠綠僵菌在稻株表面存在產(chǎn)卵痕時有可能通過產(chǎn)卵痕侵染產(chǎn)于稻株葉鞘組織內(nèi)的褐飛虱卵塊。

A，綠僵菌對褐飛虱表皮的侵染(腹部)；B，綠僵菌對褐飛虱表皮的侵染(背部)；C，褐飛虱翅上的黃綠綠僵菌孢子；D，褐飛虱翅上的黃綠綠僵菌菌絲體；E，褐飛虱復(fù)眼處孢子；F，褐飛虱觸角處孢子；G，形成穿透板；H，體表布滿菌絲體。A， Invasion behavior of M. flavoviride on the cuticle of N. lugens(Abdomen); B， Invasion behavior of M. flavoviride on the cuticle of N. lugens(Back); C， M. flavoviride conidia on the wing of N. lugens; D， Mycelia of M. flavoviride on the wing of N. lugens; E， Conidia on compound eye; F， Conidia on antenna; G， Penetrating plate; H， Extensive growth of hyphae.圖1 寄主體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)黃綠綠僵菌的入侵行為Fig.1 Invasion behavior of M. flavoviride on different surface topography of host

圖2 試驗處理(A)和對照(B)稻株莖稈的顯微觀察Fig.2 Observation of semithin section of stem of Oryza sativa under both treatment (A) and control (B)

2.3 黃綠綠僵菌分生孢子對褐飛虱體壁的侵染

電鏡下觀察黃綠綠僵菌侵染72 h的褐飛虱表皮組織可見，相對于健康體壁細(xì)胞(圖4-A)，被侵染的褐飛虱表皮組織內(nèi)大量菌絲穿透形成大小、形狀各異的菌絲段和菌絲取代表皮組織，且組織內(nèi)細(xì)胞器因菌絲穿透遭到破壞，細(xì)胞排列松弛，部分變成空泡(圖4-B、C)。

解剖死亡24 h之內(nèi)的褐飛虱，蟲體腹部呈硬塊狀(圖5-A)，電鏡下可見孢子堆積(圖5-B)。推測黃綠綠僵菌通過體表薄弱處侵入寄主體內(nèi)后，借助寄主的營養(yǎng)快速繁殖，導(dǎo)致菌體大量堆積在褐飛虱腹部，引起寄主死亡。

2.4 黃綠綠僵菌分生孢子在褐飛虱卵巢的侵染過程

對黃綠綠僵菌侵染的褐飛虱卵巢進(jìn)行鏡檢可見，內(nèi)部分布著大量形似黃綠綠僵菌孢子的物質(zhì)(圖6-A、B)，但由于褐飛虱體內(nèi)存在可垂直卵傳的共生類酵母菌，因而僅通過鏡檢無法判斷圖6中黃綠綠僵菌是否可以侵染寄主卵巢。

A，處理稻株內(nèi)卵塊；B，對照稻株內(nèi)卵塊；C，處理稻株內(nèi)卵塊(箭頭1、2所指為黃綠綠僵菌孢子)；D，對照處理離體卵塊；E，黃綠綠僵菌處理離體卵塊；F，卵塊表面分布的黃綠綠僵菌菌絲體。A， Eggs in M. flavoviride treated rice plant; B， Eggs in control rice plant; C， Eggs in M. flavoviride treated rice plant (Arrow 1， 2 referred to M. flavoriride spores); D， Isolated egg under control; E， Isolated egg treated by M. flavoviride; F， Mycelium on the surface of the isolated egg.圖3 不同處理褐飛虱卵塊的電鏡觀察Fig.3 Scanning electron microscope observation of N. lugens eggs under different treatments

A，對照處理；B，黃綠綠僵菌分解的體壁；C，體壁內(nèi)分布的孢子。A， Control cuticle; B， Cuticle decomposed by M. flavoviride; C， Conidia distributed in cuticle.圖4 褐飛虱體壁被黃綠綠僵菌侵染前后對比Fig.4 Comparison of the cuticle of N. lugens before and after infection of M. flavoviride

A，腹部；B，堆積的孢子。A， Abdomen; B， Accumulated spores.圖5 死亡褐飛虱腹部電鏡觀察Fig.5 Electron microscopic observation of dead N. lugens

2.5 黃綠綠僵菌對褐飛虱卵塊孵化率及幼蟲、成蟲歷期的影響

由圖7可知，處理褐飛虱種群的卵塊孵化率集中在61.10%～72.67%，黃綠綠僵菌處理時間的延長并未降低寄主的卵塊孵化率，且與對照褐飛虱種群的孵化率相比也無顯著差異。表1的數(shù)據(jù)表明，不同處理的褐飛虱若蟲歷期和成蟲歷期并無顯著差異，說明黃綠綠僵菌處理并未對褐飛虱若蟲與成蟲歷期造成影響。由上述結(jié)果推測，短期(24～72 h)黃綠綠僵菌處理還不足以對寄主體內(nèi)的卵塊產(chǎn)生影響。

箭頭所指為黃綠綠僵菌孢子。The arrows in the picture referred to M. flavoviride spores.圖6 黃綠綠僵菌侵染后的褐飛虱卵巢半薄切片觀察Fig.6 Observation of semithin section of N. lugens ovary after M. flavoviride infection

圖7 不同處理的褐飛虱卵塊孵化率Fig.7 Hatching rate of N. lugens under different treatments

表1 不同處理的褐飛虱若蟲歷期和成蟲歷期

Table 1 Adult and nymph duration ofN.lugensafter different treatments

處理Treatment若蟲歷期Nymph duration/d1齡 1 instar2齡 2 instar3齡 3 instar4齡 4 instar5齡 5 instar成蟲歷期Adult duration/dT-24 h1.93±0.072.00±0.012.00±0.012.29±0.112.95±0.0519.60±2.00T-48 h1.86±0.102.14±0.091.87±0.092.18±0.102.85±0.1121.65±1.77T-72 h1.93±0.072.07±0.072.00±0.012.29±0.112.80±0.1220.75±1.80CK-24 h1.57±0.142.07±0.072.00±0.012.41±0.122.90±0.0719.55±2.18CK-48 h1.93±0.072.00±0.012.07±0.072.24±0.113.10±0.1022.55±2.52CK-72 h1.93±0.072.14±0.102.13±0.132.29±0.112.80±0.0914.80±1.70

3 討論

綠僵菌與傳統(tǒng)的化學(xué)殺蟲劑相比，具有環(huán)境友好、人畜無害、效果持續(xù)時間長等優(yōu)點，但真菌殺蟲劑的有效成分均為活體細(xì)胞，其田間防效及穩(wěn)定性受環(huán)境因子，如溫濕度[17]、紫外線[18-19]、化學(xué)藥劑[20]等的影響，使得生防真菌的應(yīng)用受到作物生長環(huán)境和季節(jié)的限制。生防真菌具有獨(dú)特的體壁侵染方式，以寄主蟲體體壁作為侵染的第一道屏障。這在生防真菌的抗逆及害蟲侵染過程中發(fā)揮著重要作用。

本試驗所用的黃綠綠僵菌菌株在實驗室條件下能識別褐飛虱表皮，破壞表皮組織，使表皮層疏松以利菌絲體穿透，從而形成大小、形狀各異的菌絲段和菌絲取代表皮組織，成功附著建立寄生關(guān)系[21-22]。菌絲體同時侵入寄主各器官組織，破壞寄主組織與器官，直至整個蟲體充滿菌絲和菌絲段，導(dǎo)致寄主褐飛虱死亡。

綠僵菌的生長周期較長，易受田間環(huán)境因子的影響，且在菌絲體侵入破壞寄主組織與器官之前并不影響寄主的取食、產(chǎn)卵等行為，雖可侵染褐飛虱，但田間防治效果并不明顯。因此，明確綠僵菌是否能夠侵染褐飛虱卵巢致其無法正常產(chǎn)卵，以及是否能夠感染稻株內(nèi)卵塊導(dǎo)致其無法孵化，對褐飛虱的田間防治更具應(yīng)用價值。這是因為相對于活動的蟲態(tài)，活體真菌對靜止蟲態(tài)的作用時間更長，作用成功概率也更大。目前，關(guān)于真菌侵染寄主卵塊的相關(guān)報道較少，Toledo等[23]曾在蠟蟬(Peregrinusmaidis)雌成蟲被白僵菌(Beauveriabassiana)和綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)侵染48 h后的卵巢管和卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)菌絲體，說明48 h之后綠僵菌即可侵染蠟蟬的生殖系統(tǒng)。本試驗中，黃綠綠僵菌處理72 h的褐飛虱卵巢切片可見大量形似黃綠綠僵菌孢子的物質(zhì)，但由于褐飛虱自身攜帶的類酵母共生菌可垂直卵傳，且形態(tài)與黃綠綠僵菌相似，因此單憑鏡檢無法判斷綠僵菌是否可以侵染褐飛虱卵巢，且黃綠綠僵菌處理72 h之后的褐飛虱所產(chǎn)卵塊孵化率，以及成蟲、若蟲歷期都與對照種群無顯著差異。此外，試驗結(jié)果表明，黃綠綠僵菌菌體可定殖于褐飛虱卵塊體表。結(jié)合以上試驗結(jié)果推測，黃綠綠僵菌可以侵染褐飛虱生殖系統(tǒng)并定殖于卵塊，但72 h還不足以使其菌絲體侵入寄主褐飛虱的生殖系統(tǒng)并對其生殖行為產(chǎn)生影響。這與Toledo等[23]的試驗結(jié)果存在差異，可能是由于蠟蟬與褐飛虱的表皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組成成分等存在差異，導(dǎo)致黃綠綠僵菌在寄主褐飛虱的體表定殖、產(chǎn)生附著胞、侵染所需時間較長。綠僵菌對褐飛虱卵塊的侵染對于褐飛虱的田間防控具有重要意義。李茂業(yè)等[15]曾報道綠僵菌可通過稻株產(chǎn)卵痕侵染褐飛虱卵塊。本試驗也發(fā)現(xiàn)，噴施于稻株表面的黃綠綠僵菌在稻株表面存在產(chǎn)卵痕時有可能通過產(chǎn)卵痕侵染產(chǎn)于稻株葉鞘組織內(nèi)的褐飛虱卵塊，但觀察到的卵塊體表孢子數(shù)量較少，推測并不能對卵塊存活率產(chǎn)生影響，此外，也未觀察到卵塊變色死亡的現(xiàn)象。綠僵菌的穩(wěn)定性易受環(huán)境因子影響，且水稻不同生長期植株的含水量、營養(yǎng)成分、表皮結(jié)構(gòu)等都存在差異，推測以上原因共同造成了綠僵菌對稻株侵染的不穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果表明，黃綠綠僵菌可侵染褐飛虱及其卵塊，但侵染所需時間較長，且易受外界因子影響。因此，黃綠綠僵菌對褐飛虱的田間防控，在使用上需結(jié)合田間氣候變化趨勢、褐飛虱蟲齡等因素綜合考慮，適時施用。同時，進(jìn)一步提高黃綠綠僵菌的侵染效率，加強(qiáng)黃綠綠僵菌侵染能力方面的研究，對于提高黃綠綠僵菌對褐飛虱的田間防效具有現(xiàn)實意義。