培養(yǎng)溫度、水分活度對稻谷和大米黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響

呂 聰 王 平 常 鵬 靳 婧 劉 陽,*馬龍雪 楊慶利 邢福國,*

(1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯及管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266108)

DOI:10.11869/j.issn.100-8551.2019.10.2033

稻谷是人類主要食用的糧食作物，全世界有超過半數(shù)的人口以其為主食，在我國糧食產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位，因此保障稻谷安全至關(guān)重要[1-2]。稻谷在儲藏和加工過程中受貯藏溫度、水分、氧氣和蟲霉等因素的影響，容易被霉菌污染[3]。2016年，中儲糧成都糧食儲藏科學(xué)研究所測定我國14個省農(nóng)戶儲藏稻谷樣品的黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)含量，發(fā)現(xiàn)四川、貴州、云南、廣西和江蘇5省稻谷中AFB1檢出率超過20%[4]；2011年廣西省抽樣調(diào)查34批市售大米，其中有3批檢測出(陽性)AFB1，檢出率為8.8%，AFB1污染量均為1 μg·kg-1[5]；2013年深圳福田區(qū)疾病預(yù)防控制中心抽樣檢測51份深圳地區(qū)市售大米的AFB1含量，檢出率為33.3%[6]。由此可見，我國稻米黃曲霉毒素污染現(xiàn)象普遍，對人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等產(chǎn)生的具有強(qiáng)毒性和致癌性的衍生化合物[7-8]。黃曲霉產(chǎn)生的強(qiáng)致癌性代謝產(chǎn)物AFT可以通過食物進(jìn)入人和動物體內(nèi)，對人畜健康造成巨大威脅[9-10]。黃曲霉可以產(chǎn)生多種毒素(B1、B2、G1、G2)，其中危害性最強(qiáng)和致癌性最高的是AFB1。研究發(fā)現(xiàn)人體過量攝入AFB1后會誘發(fā)肝癌[11]。

在儲藏過程中，AFT污染稻谷和大米程度主要受溫度和濕度的影響。Ayerst[12]和Magan等[13]研究糧食儲藏過程中溫度和濕度對真菌生長的影響發(fā)現(xiàn)，不同的真菌孢子在糧食上萌發(fā)時所需的最低相對濕度略有不同。Cotty等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在高溫度和低濕度環(huán)境下，玉米上容易生長黃曲霉菌。岳曉禹等[15]研究糧食貯藏條件發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水分活度高于0.90時，黃曲霉生長較快，水分活度低于0.90時，黃曲霉生長延緩。實(shí)際上在較高的濕度條件下，稻米容易發(fā)生霉變，但此時霉菌尚處于菌絲早期生長階段，帶菌量的增加并不明顯[16]。因此，本試驗(yàn)探究不同溫度和不同水分活度(water activity,aw)下稻米受黃曲霉侵染及AFB1污染的相關(guān)情況，以期揭示稻米中AFB1污染的主要影響因素及相關(guān)機(jī)理，為科學(xué)制定稻米黃曲霉毒素污染的防控策略和方法提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與試劑

試驗(yàn)樣品采用2017年收獲的湖南黃華占稻谷和黑龍江五常稻花香大米，在當(dāng)?shù)剡M(jìn)行常規(guī)包裝后運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行黃曲霉分離及AFB1含量的檢測。每種樣品采集100 kg。

培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；甲醇(分析純)購自北京化工廠；甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司；AFB1黃曲霉毒素免疫親和柱購自北京華安麥科公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma 公司；Gotaq PCR Master Mix購自美國Promega公司；TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Genius 3型渦旋振蕩器，德國IKA公司； SZ2-1LST型電子顯微鏡，日本Olympus公司；T100型PCR儀，美國Bio-Rad公司；Aqualab 4TE水分活度測定儀，美國Decagon Devices公司；Moisture Analyzer MJ33水分測定儀，瑞士Mettler Toledo公司；實(shí)時熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃曲霉菌株活化及孢子液的制備 將農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉陽實(shí)驗(yàn)室保存的黃曲霉菌株YC-15接種到DG18培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d進(jìn)行活化，隨后用滅菌的50 mL 0.1%吐溫80制成濃度為1×106的均勻孢子液，備用。

1.3.2 水分活度(aw)的調(diào)節(jié) 按照Abdel-Hadi等[17]的方法調(diào)節(jié)稻谷和大米aw：在稻谷和大米中添加不同量的水，于4℃冰箱中平衡過夜，使其水分活度達(dá)到目標(biāo)要求(0.85、0.90、0.96、0.99)，然后利用水分測定儀測定稻米水分含量，并采用水分活度測定儀測定稻米aw。

1.3.3 黃曲霉侵染稻米試驗(yàn) 將2 mL孢子濃度為1×106的黃曲霉孢子液接種至裝有經(jīng)紫外殺菌后的200 g目標(biāo)aw稻米樣品的三角瓶中。每組試驗(yàn)設(shè)置3個平行，封口后震蕩、搖勻。然后分別置于不同溫度(20、25、28、33、37、42℃)的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.3.4 帶菌量的檢測 經(jīng)7 d培養(yǎng)后，在生物安全柜中準(zhǔn)確稱量10 g稻谷和10 g大米樣品，置于3% NaClO 溶液中清洗30 s，再用無菌水清洗2次，最后加入10 mL無菌水，得到1 g·mL-1的稻米樣品菌懸液。然后依次梯度稀釋，制成1∶10樣品稀釋液[18]。取100 μL各稀釋度的樣品菌懸液涂布于DG18平板[19]，并置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d，通過菌落計(jì)數(shù)分析樣品的帶菌數(shù)量。

1.3.5 AFB1含量的檢測 將培養(yǎng)7 d后的稻谷和大米用高壓滅菌鍋滅菌30 min，磨粉后分別稱取20 g研磨樣品于150 mL三角瓶中，加入100 mL(70∶30，v∶v)甲醇/水萃取溶液[20]，然后高速振蕩1 h后靜置30 min，收集濾液。按照1∶2的比例加入蒸餾水稀釋濾液，然后取15 mL稀釋后的濾液過柱，待濾液流干后用去離子水洗滌2次，每次10 mL，最后用1 mL色譜級甲醇洗脫，得到的洗脫液用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶，備用。

HPLC檢測條件：反向C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)、柱溫30℃；流動相為甲醇/水(6∶4)，流速為1 mL·min-1。熒光檢測器為Waters2475型，激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長440 nm，進(jìn)樣量20 μL[21]。

1.3.6 實(shí)時熒光定量PCR分析試驗(yàn) 將培養(yǎng)7 d后的稻谷和大米上的黃曲霉菌絲剝離下來，液氮預(yù)冷后置于-70℃保存?zhèn)溆??？俁NA的提取步驟按照RNeasy Plant Mini Kit說明書。將提取出的總RNA按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度、水分活度對大米中黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響

由圖1可知，高溫(T≥42℃)幾乎完全抑制了黃曲霉的生長和產(chǎn)毒，低溫(T≤20℃)條件下大米上黃曲霉的生長和產(chǎn)毒也非常少，結(jié)果可將黃曲霉的最佳生長溫度范圍進(jìn)一步縮小為28～37℃，且在20～42℃范圍內(nèi)黃曲霉的生長整體呈先上升后下降的趨勢，其中黃曲霉最適生長溫度為33℃。由圖2可知，低溫20℃條件下，水分活度(aw)為0.96時，黃曲霉的產(chǎn)毒量要高于aw為0.90時的產(chǎn)毒量；高溫37℃條件下，aw為0.90時黃曲霉的產(chǎn)毒量高于aw為0.96時的產(chǎn)毒量。培養(yǎng)溫度為42℃時，所有水分活度條件下的黃曲霉幾乎不生長，且不適合毒素產(chǎn)生。綜上，大米黃曲霉的最適生長和產(chǎn)毒的溫度均為33℃。

不同大米水分活度(aw)對黃曲霉生長的影響差異較大(圖1)。aw為0.90和0.96時，黃曲霉的生長要優(yōu)于aw為0.85和0.99，且隨著aw的增加，黃曲霉生長大體上呈先升高后降低的趨勢，最佳生長aw為0.90。溫度高于33℃條件下，aw為0.96時，黃曲霉生長量略低于aw為0.90時，但兩者在25～37℃條件下都有較好的長勢；當(dāng)aw增加到0.99時，大米中黃曲霉生長量則大幅度下降。由圖2可知，當(dāng)aw為0.85時，黃曲霉產(chǎn)毒量較低，而aw為0.90～0.99時比較適宜黃曲霉產(chǎn)毒，其中最佳產(chǎn)毒aw為0.96。當(dāng)aw從0.90升至0.96時，產(chǎn)毒量幾乎均急劇上升，當(dāng)aw從0.96增至0.99時，黃曲霉的產(chǎn)毒量下降；33℃下aw對大米中黃曲霉的生長和產(chǎn)毒影響最為顯著，aw為0.90時，黃曲霉達(dá)到最大生長量，但其最佳產(chǎn)毒aw為0.96。綜上，黃曲霉的最適生長aw為0.90，最佳產(chǎn)毒aw為0.96。

圖1 培養(yǎng)溫度、水分活度對大米中黃曲霉生長的影響Fig.1 Effect of culture temperature and water activity on the growth of A. flavus in rice

圖2 培養(yǎng)溫度、水分活度對大米中AFB1含量的影響Fig.2 Effect of culture temperature and water activity on the production of AFB1 in rice

2.2 培養(yǎng)溫度、水分活度對稻谷中黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響

由圖3可知，培養(yǎng)溫度低于28℃時不適合黃曲霉的生長和產(chǎn)毒。培養(yǎng)溫度為42℃時，aw在0.90～0.96范圍內(nèi)，黃曲霉可以生長，而其他過高或過低水分活度均不適合黃曲霉生長。稻谷上黃曲霉的適宜生長溫度范圍為28～40℃，其生長趨勢為先上升后下降，其中最佳生長溫度為37℃。由圖4可知，培養(yǎng)溫度為20～25℃時，各水分活度的稻谷中黃曲霉均不產(chǎn)毒，低溫完全抑制了黃曲霉毒素的生物合成。但培養(yǎng)溫度為25～37℃時，黃曲霉產(chǎn)毒量逐漸增加，其中最適產(chǎn)毒溫度為37℃。培養(yǎng)溫度為42℃時，各水分溫度下黃曲霉幾乎不產(chǎn)生毒素。

圖3 培養(yǎng)溫度、水分活度對稻谷中黃曲霉生長的影響Fig.3 Effect of culture temperature and water activity on the growth of A. flavus in paddy

由圖3可知，aw為0.85時抑制了稻谷中黃曲霉的生長；培養(yǎng)溫度為25～42℃，aw為0.90～0.99條件下，隨著aw增大，黃曲霉的生長呈先升高后降低的趨勢，并在aw為0.96生長最好，且aw為0.99的稻谷中黃曲霉生長情況優(yōu)于aw為0.90的稻谷中的黃曲霉。由圖4可知，aw為0.85時，幾乎沒有毒素產(chǎn)生，aw為0.90時產(chǎn)毒量達(dá)到最大，而后隨著aw的增加，產(chǎn)毒量逐漸下降。對aw為0.99來說，在33℃時產(chǎn)毒最多，隨后溫度升高產(chǎn)毒降低。

圖4 培養(yǎng)溫度、水分活度對稻谷中AFB1含量的影響Fig.4 Effect of culture temperature and water activity on the production of AFB1 in paddy

2.3 儲藏溫度對AFB1生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了探究不同儲藏溫度(25、33、37℃)對AFB1生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，選擇大米最適產(chǎn)毒水分活度(aw)為0.96作為目標(biāo)水分活度。由圖5可知，以黃曲霉的最適產(chǎn)毒溫度33℃為基準(zhǔn)，低溫25℃時的ABF1生物合成的大部分基因相對表達(dá)量顯著上升(P< 0.05)，其中aflG、aflE、aflH、aflJ、aflT基因相對表達(dá)量上調(diào)極顯著(P<0.01)；37℃下不同AFB1生物合成相關(guān)基因相對表達(dá)量較33℃時表現(xiàn)出較大差異，aflR、aflS、aflA、aflE、aflF、aflJ、aflL、aflG、aflH、afll基因相對表達(dá)量上調(diào)，其中aflE顯著上調(diào)，而產(chǎn)孢基因abaA相對表達(dá)量顯著下調(diào)，aflM、aflN、aflP、aflO、aflQ、aflU、aflX、laeA、brlA基因相對表達(dá)量也顯著下調(diào)。溫度低于25℃時，大多數(shù)的AFB1生物合成基因表達(dá)上調(diào)，但由于黃曲霉菌的生長量非常少，導(dǎo)致AFB1含量較低。綜上所述，高溫不利于黃曲霉產(chǎn)毒，主要可能是因?yàn)橐恍┫嚓P(guān)基因表達(dá)量下降，導(dǎo)致整個毒素的轉(zhuǎn)錄合成過程受阻。

圖5 儲藏溫度對ABF1生物合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of storage temperature on gene expression of aflatoxin B1 biosynthesis

3 討論

黃曲霉毒素的強(qiáng)毒性和強(qiáng)致癌性，對人們的生產(chǎn)生活產(chǎn)生了巨大的影響。國內(nèi)外專家學(xué)者一直致力于揭示黃曲霉毒素產(chǎn)生的規(guī)律、黃曲霉及其毒素的防控、毒素產(chǎn)生后的去除和降解技術(shù)的研發(fā)。本研究結(jié)果表明，就稻谷和大米而言，低水分活度(aw=0.85)不適合黃曲霉的生長及產(chǎn)毒，當(dāng)aw低于0.80時，黃曲霉的孢子基本停止萌發(fā)。路子顯等[22]研究表明29～30℃是黃曲霉毒素合成的最適溫度，溫度過高黃曲霉毒素的合成會完全被抑制，而在低溫下毒素的合成相對減少。Abdel-Hadi等[23]分析了不同aw(0.85、0.90、0.95、0.99)和不同溫度(20～42℃)對YES培養(yǎng)基上黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響，發(fā)現(xiàn)黃曲霉在aw為0.85的YES培養(yǎng)基上的生長和產(chǎn)毒遠(yuǎn)落后于其他aw，隨著aw的升高，黃曲霉的生長和產(chǎn)毒也呈上升趨勢，并在aw為0.99時達(dá)到最適，此時黃曲霉生長最好，產(chǎn)毒最多，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似，表明黃曲霉在低aw下的生長和產(chǎn)毒受到抑制，適當(dāng)升高aw有利于毒素的產(chǎn)生。Gallo等[24]研究不同aw(0.90～0.99)和不同溫度(20～37℃)下杏仁培養(yǎng)基中黃曲霉生長和產(chǎn)毒的情況，發(fā)現(xiàn)28℃下黃曲霉長勢最好，明顯優(yōu)于20℃和37℃，黃曲霉的最佳生長及產(chǎn)毒條件是28℃、aw為0.96，與YES培養(yǎng)基中最佳產(chǎn)毒aw(0.99)不同，同時也與本試驗(yàn)中黃曲霉在稻谷和大米上的最佳生長及產(chǎn)毒的aw不同，說明不同培養(yǎng)基質(zhì)對黃曲霉生長及產(chǎn)毒的影響存在差異，但導(dǎo)致這種差別的具體原因尚有待深入研究。Schmidt-Heydt等[25]通過探究不同溫度和aw下YES培養(yǎng)基上黃曲霉毒素生物合成的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)極端水分活度和溫度條件不利于黃曲霉生長及產(chǎn)毒。Liu等[26]研究黃曲霉在不同aw的花生中產(chǎn)毒情況，發(fā)現(xiàn)隨著aw的增大，AFB1含量呈先增加后減少的趨勢，同時在不同溫度范圍內(nèi)，最佳產(chǎn)毒aw也不同，當(dāng)溫度為20～33℃時，黃曲霉最佳產(chǎn)毒aw為0.96；溫度為33～40℃時，黃曲霉最佳產(chǎn)毒aw降至0.92。本研究結(jié)果顯示，就大米而言，溫度33℃、aw為0.96是黃曲霉的最佳產(chǎn)毒條件；就稻谷而言，黃曲霉的最佳產(chǎn)毒條件為溫度37℃、aw為0.90，與Liu等[26]的研究結(jié)果不同。

aw及溫度等環(huán)境因子主要通過影響毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)來影響真菌毒素的產(chǎn)生[27-29]。Schmidt-Heydt等[25]通過微陣列研究黃曲霉在不同溫度和aw下毒素的生物合成，進(jìn)而分析其相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果與本試驗(yàn)類似，相較于高溫37℃，33℃更能促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)毒基因的表達(dá)，表明相對于極端溫度和水分活度，黃曲霉產(chǎn)毒關(guān)鍵基因更易在溫和條件下表達(dá)。O′Brian 等[30]觀察到aflR和aflS的差異表達(dá)與黃曲霉毒素生物合成相關(guān)，且在高溫下即使調(diào)節(jié)基因高度表達(dá)，毒素的合成也較少。Yu等[31]對不同溫度下的黃曲霉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)大部分基因有差異表達(dá)，其中aflS在37℃仍有較高表達(dá)，但aflS/aflR的表達(dá)比例下降，從而導(dǎo)致產(chǎn)毒下降。劉肖[32]發(fā)現(xiàn)在37、42℃下黃曲霉毒素關(guān)鍵基因相對表達(dá)量相比28℃顯著下降，但aflR、aflS、aflF、aflI、aflM、aflU、nadA基因在37℃的相對表達(dá)量上調(diào)，aflI、nadA基因在42℃的相對表達(dá)量上調(diào)；調(diào)控次級代謝的abaA基因相對表達(dá)量在37、42℃均上調(diào)，但生長發(fā)育基因brlA相對表達(dá)量只在37℃上調(diào)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度和水分活度對大米中黃曲霉產(chǎn)毒基因的表達(dá)有著復(fù)雜的影響，低溫25℃時黃曲霉毒素生物合成基因的表達(dá)量相對于33℃大部分均是顯著上調(diào)的，表明低溫激發(fā)基因表達(dá)，推測是因?yàn)辄S曲霉菌的產(chǎn)菌量低，導(dǎo)致黃曲霉產(chǎn)毒減少；而高溫37℃時，brlA、abaA、laeA基因相對表達(dá)量相比33℃時顯著下調(diào)，laeA基因?yàn)榇渭壌x主要調(diào)控因子，brlA、abaA基因?yàn)樯L發(fā)育調(diào)控因子，推測高溫導(dǎo)致了重要結(jié)構(gòu)基因的相對表達(dá)量降低，從而毒素的產(chǎn)生量降低。

4 結(jié)論

大米中黃曲霉的最適產(chǎn)毒條件是溫度33℃、aw為0.96，aw低于0.85和低溫20℃時黃曲霉基本不產(chǎn)毒，高溫42℃下也不產(chǎn)毒；稻谷中黃曲霉的最適產(chǎn)毒條件是溫度37℃、aw為0.90，aw低于0.85和溫度低于25℃時黃曲霉基本不產(chǎn)毒，高溫(42℃)和高aw(0.99)時黃曲霉也不產(chǎn)毒。低溫25℃可以促進(jìn)黃曲霉產(chǎn)毒基因表達(dá)，但因黃曲霉菌產(chǎn)菌量低而導(dǎo)致毒素含量低，高溫37℃則抑制黃曲霉次級代謝調(diào)控基因及部分結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而阻抑毒素的生成。因此，稻米在儲藏過程中應(yīng)遵循保持干燥、低溫的原則，可極大地減輕毒素的污染情況，同時降低黃曲霉毒素生物合成基因的表達(dá)，從而有效降低毒素的產(chǎn)生，這對減少我國因霉變而造成的糧食浪費(fèi)具有重要意義。