過氧化氫酶-2能力驗證樣品的制備及其 均一性和穩(wěn)定性測定

魏 杰 王 洪 賈松華 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

隨著實驗室認可制度的發(fā)展和實驗室質量意識的不斷提升，作為實驗室評定重要部分的能力驗證也在迅速發(fā)展；而加速這一發(fā)展的，正是中國合格評定國家認可委員會于2002年啟動的能力驗證提供者(PTP)認可計劃[1-2]。能力驗證提供者計劃的實施，不僅能增強參與實驗室對提供者的信任，也為計劃的有效性、結果的承認與利用起到了積極作用。

對于提供者的認可，需要考察管理、技術等多方面因素來保證項目的順利實施。而技術核心與出現(xiàn)問題的集中要素都是試樣的均勻性與穩(wěn)定性[2-3]。

中國食品藥品檢定研究院2015年在北京率先通過了實驗動物檢測項目的PTP認可，并組織全國范圍的實驗動物檢測的能力驗證活動。為滿足能力驗證認可要求，保障能力驗證計劃的順利進行，本文即對2018年項目“NIFDC-PT -171實驗小鼠腎勻漿中過氧化氫酶-2的檢測”樣品制備中的均勻性和穩(wěn)定性進行研究，并對近幾年樣品制備工作進行回顧，為樣品的研制發(fā)放提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源

a型BALB/c小鼠20只，8周齡，來自中國食品藥品檢定研究院；b型C3H小鼠20只，8周齡，來自北京維通利華實驗動物技術有限公司。生產許可證號分別是SYXK(京)2017-0013和SCXK(京)2016-0011。

1.2 儀器

海爾BCD冰箱，THERMO恒溫箱，Sartorius酸度計，ML4002電子天平，DY89-1勻漿機，HITACHI低溫離心機，LABCONACO凍干機，BIO-RAD電泳儀。

1.3 試劑和耗材

7 mL無菌離心管，滅菌手術器械(剪刀，鑷子，解剖板)，冰袋， CORNINIG凍存管，穩(wěn)定保護劑、乙酸纖維素薄膜，三羥甲基氨基甲烷，檸檬酸、過氧化氫酶-2染色試劑盒。

1.4 標準樣品的制備[4]及均勻性測定程序

1.4.1觀察動物外觀及編號；

1.4.2二氧化碳安樂死處理，解剖小鼠取腎臟，剝除脂肪等附著物。

1.4.3按照品系，分別稱取BALB/c、C3H小鼠腎臟總質量。

1.4.4按照W(腎)∶V(水)=1∶2的比例，分別向裝有BALB/c、C3H腎臟的2支管中加入蒸餾水，用勻漿機勻漿。

1.4.5配平后置于離心機中離心勻漿液。15 000 r/min離心30 min，分別分離上清入新管，得到a型和b型腎勻漿各1份(BALB/c及C3H分別為a、b型)。

1.4.6分別向2新管中加入一定比例的穩(wěn)定保護劑混勻，分裝至凍存管中，置于凍干機中凍干。共制得a型樣品112瓶，b型樣品84瓶。-20 ℃凍存待檢。各樣品取出實驗時均需加入70 μL水還原后使用。

1.5 樣品的均勻性測定

1.5.1按照4%的比例隨機抽取a、b型樣品試樣，還原于微量加樣器加樣。醋纖膜點樣電泳、染色，并判讀條帶。具體實驗條件及判定標準參見GB/T 14927.1—2008過氧化氫酶-2項目[4]。

1.5.2如所得a型條帶和b型條帶均清晰可讀，且與標準規(guī)定一致，即認為符合樣品的均勻性要求。如未通過均勻性檢測，則需重新制樣并檢測，直到符合標準規(guī)定。

1.6 樣品的穩(wěn)定性測定

1.6.1凍融穩(wěn)定性:a、b型樣品試樣各取3管，首次測定于-20 ℃冰箱中取出加水還原測定。實驗條件同1.5.1。如所得條帶清晰可讀且與標準一致，則認為1次凍融穩(wěn)定性良好。初次凍融后，即將試樣放入-20 ℃冰箱冷凍，每隔2 h再次取出，融化點樣測定。結果判讀依據(jù)與初次相同。如過程中發(fā)生拖帶、彌散等情況，終止凍融測定并記錄測定次數(shù)。如過程中一直穩(wěn)定，也以4次凍融為測定終點。

1.6.2時間-溫度穩(wěn)定性

1.6.2.1 制作一個測試計劃表，擬定放置的時間和溫度。分別將時間和溫度設為觀測的橫、縱坐標，設定4、20、37 ℃這3個溫度觀測點，1、2、3、7、15、30 d為觀測時間，在每個坐標交點，每個型別的樣品分別隨機抽取2瓶進行編號。

1.6.2.2 編號規(guī)則。標記順序為：時間-溫度-型別。如4 ℃存放a型1 d樣品標記為“1-4-a1”、“1-4-a2”，b型37 ℃存放4 d樣品標記為“4-37-b1”、“4-37-b2”，等。

1.6.2.3 在取出日期，進行穩(wěn)定性的檢測。如所得條帶清晰可讀且與標準一致，則認為該溫度時間坐標點穩(wěn)定性良好。如所得條帶中任何1條發(fā)生條帶模糊不可讀，則認為在該坐標點已經(jīng)發(fā)生了樣品的穩(wěn)定性變化，記錄不穩(wěn)定坐標點。且當不穩(wěn)定點出現(xiàn)后，其之后的時間溫度觀測點隨之取消。但即使一直穩(wěn)定，本測定的觀測周期也僅為30 d時長。

1.6.3匯總各型別穩(wěn)定性結果，填寫時間溫度穩(wěn)定性表格。穩(wěn)定用“○”表示，不穩(wěn)定用“×”表示。

2 結果

2.1 均勻性測定結果

本次抽樣按照小樣本4%的比例抽取了過氧化氫酶-2標準樣品a型4管、b型3管[4]。經(jīng)過兩次重復電泳染色所得結果一致，表現(xiàn)為100%a型和100%b型，見圖1。

圖1 過氧化氫酶-2均勻性抽樣結果圖注：1～9分別為a1、a2、a3、a4、標準a、標準b、b1、b2、b3Fig.1 Sampling results of catalase-2 uniformityNote: 1～9 shows a1,a2,a3,a4,standard a,standard b,b1,b2,b3 respectively

2.2 凍融穩(wěn)定性結果

經(jīng)檢驗，凍融1～4次的a、b型過氧化氫酶-2樣品均表現(xiàn)穩(wěn)定，所制樣品的凍融穩(wěn)定性良好，見圖2。

圖2 過氧化氫酶-2四次凍融穩(wěn)定性結果圖注：F1～F4分別代表1～4次凍融；每組的1～3均為a型，4為標準a，5為標準b，6～8為b型。Fig.2 4-time freeze thawing stability results of catalase-2Note: F1～F4 show the first to forth freeze thawing test results; number1 to 3 are the a type samples results, 4 and 5 are standard a and standard b results respectively, and 6 to 8 are the b type samples results.

2.3 時間-溫度穩(wěn)定性測定結果

a型及b型標準樣品在4 ℃、20 ℃和37 ℃條件下均可穩(wěn)定存放至30 d，不同個體之間沒有顯著差異，不同型別之間沒有顯著差異，見表1。

當然，溫度對酶的活性強度仍存在一定影響。4 ℃及室溫條件下，樣品表觀顏色基本沒有改變且電泳后染料著色度高。37 ℃條件下，樣品的表觀顏色變深，電泳后雖能分辨帶型，但染料著色度降低。圖3給出了b型樣品37 ℃存放1～30 d的加樣和染色結果。

表1 過氧化氫酶-2樣品不同溫度時間穩(wěn)定性結果Table 1 Results of catalase-2 stability under different time and temperature condition

注：“○”表示樣品穩(wěn)定

Note: “○”means stable

圖3 過氧化氫酶-2 b型37℃30 d穩(wěn)定性結果圖注：1～16分別表示1-37-b1,1-37-b2,2-37-b1,2-37-b2,標準b,標準a,3-37-b1,3-37-b2,7-37-b1,7-37-b2,標準a,標準b,15-37-b1,15-37-b2,30-37-b1,30-37-b2Fig.3 30-day stability results of b type catalase-2 at 37 ℃Note: 1～16 shows 1-37-b1,1-37-b2,2-37-b1,2-37-b2,standard b, standard a,3-37-b1,3-37-b2,7-37-b1,7-37-b2,standard a,standard b,15-37-b1,15-37-b2,30-37-b1,30-37-b2 respectively

3 討論

3.1 過氧化氫酶與動物選擇

過氧化氫酶是一類存在于動植物及微生物體內的末端氧化酶，其同工酶在物種和組織特異性鑒別、藥物毒物等損傷評價等方面有著廣泛的應用[5-7]。不同來源的過氧化氫酶的特點存在差異，就小鼠而言，過氧化氫酶在肝、腎組織中更為豐富，且1～4月齡的小鼠過氧化氫酶活性與年齡無明顯相關性，大于4月齡后隨年齡增長酶活性降低[8]。我們在選擇動物時使用了2月齡的小鼠，考慮了這一特點，同時兼顧了飼養(yǎng)購買成本。

3.2 樣品的型別設計方案

過氧化氫酶-2是國標GB/T14927.1—2008中近交系小鼠檢測常規(guī)項目之一，其常見帶型為快帶a型和慢帶b型[4]。在之前的樣品制備中，我們曾做過酯酶-3的雜合型樣品，并通過了均勻性和穩(wěn)定性驗證，對于實際檢測也有雜合型的判讀應用[9]。然而，基于文獻對于過氧化氫酶-2雜合型容易誤判的研究，本研究僅設定了快帶a型、慢帶b型兩個容易判讀型別[10]。通過應用標準品比對條帶泳動速度的快慢，進行定性判斷。

3.3 樣品穩(wěn)定性方案設計

樣品從制備到發(fā)放需經(jīng)歷存儲、運輸、實驗等環(huán)節(jié)，溫度、時間等因素都會對其品質產生影響。在近幾年的樣品制備中，我們曾研究過-20、4、20 ℃和37 ℃溫度坐標以及1～90 d時間坐標的存放穩(wěn)定性，而對于凍融穩(wěn)定性研究較少[9,11]。由于采用冷鏈運輸，溫度在運輸過程中基本可控。但就近兩年快遞樣品代簽收的情況，使得部分樣品存在凍融狀態(tài)。為此，在過氧化氫酶-2樣品的制備過程中，我們加強了凍融穩(wěn)定性研究，共測定了4次凍融結果，其穩(wěn)定性較好。

生化標記電泳檢測是國家標準規(guī)定的近交系大、小鼠遺傳質量監(jiān)測方法，也是目前進行近交系小鼠遺傳質量檢測的有效方法[12]。但目前所有生化標記檢測項目均為定性項目，只能依據(jù)電泳快慢進行型別判讀，以及通過條帶有或無進行穩(wěn)定性的判斷。通過相關研究，我們發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶在常溫下穩(wěn)定性較好，可以在25 ℃條件下穩(wěn)定存在3個月[13]，而我們通常在1個月以內就會完成發(fā)放到結果回收。因此時間長度設定在30 d以內，溫度上也貼合運輸和實驗中可能存在的溫度范圍，選擇了4、20 ℃和37 ℃進行樣品的測定。經(jīng)測定，在已知的小鼠生化標記樣品中，過氧化氫酶-2在37 ℃穩(wěn)定性最佳(酯酶-3和肽酶-1在37 ℃僅能穩(wěn)定存在1 d[9,11])，30 d的樣品雖然表觀有變色，仍可檢測出相應的帶型。即能在37 ℃穩(wěn)定存在30 d，更適于作為樣品滿足能力驗證項目的需求。