精神依賴藥物成癮模型建立及小腦Bax基因的表達(dá)*

謝明仁 俞發(fā)榮

(甘肅政法大學(xué) 甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730070)

精神依賴物質(zhì)(海洛因)的濫用與造成機(jī)體所有系統(tǒng)器官的毒性損傷作用有關(guān)。從偶爾的喜好活動(dòng)過渡到長(zhǎng)期的濫用和成癮，大多數(shù)成癮者的復(fù)發(fā)，即使經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的禁欲，幾乎沒有有效和確定的治療機(jī)會(huì)[1]。精神依賴藥物成癮不但危害成癮者自身的身心健康,還會(huì)造成嚴(yán)重的社會(huì)問題[2]。有關(guān)海洛因成癮對(duì)大腦組織的損傷作用方面研究較多[3]，小腦與大腦、腦干和脊髓之間豐富的傳入和傳出聯(lián)系，參與軀體平衡和肌肉張力(肌緊張)的調(diào)節(jié)，以及隨意運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)。小腦損傷，機(jī)體的肌肉張力就會(huì)減退，隨意運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)性出現(xiàn)紊亂。因此，為了探索小腦在精神依賴藥物(海洛因)成癮和戒斷中的作用，建立精神依賴藥物成癮動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究精神依賴藥物成癮機(jī)制，為戒毒制定新的、有效的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar大鼠，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK (甘)2015—0001],實(shí)驗(yàn)在甘肅政法學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)[SYXK (甘)2015—0006]。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定，按3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以人道關(guān)懷(倫理委員會(huì)審批號(hào)碼:GZF—2018—003)。

海洛因：為白色粉末, 純度為86.8%,由蘭州市公安廳禁毒辦提供，實(shí)驗(yàn)時(shí)用滅菌蒸餾水配成所需要的濃度。鹽酸納洛酮，北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):1806152；大鼠凋亡因子Bax試劑盒、大鼠Caspase-9試劑盒、大鼠Caspase-3試劑盒，購(gòu)于上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；MK3-酶標(biāo)儀,上海儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物處理：取SPF級(jí)Wistar大鼠20只(雄性)，體質(zhì)量185～190 g。全部動(dòng)物在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室IVC飼育盒飼養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水，明暗周期12 h，單籠飼養(yǎng)。動(dòng)物房溫度22～24 ℃，濕度55%～65%，適應(yīng)7 d。動(dòng)物隨機(jī)分為2組,每組10只。對(duì)照組：肌肉注射生理鹽水10 mL/kg，每天2次；海洛因組：給予海洛因、納洛酮的方法、劑量以及持續(xù)時(shí)間均按文獻(xiàn)[4]操作。第15天腹腔注射鹽酸納洛酮(納洛酮是嗎啡樣物質(zhì)受體特異拮抗劑，能迅速翻轉(zhuǎn)嗎啡作用，采用該藥的目的為觀察是否出現(xiàn)戒斷癥狀，判斷成癮模型建成與否)，待觀察完戒斷癥狀后取樣。

1.2.2取樣：實(shí)驗(yàn)第15天，動(dòng)物經(jīng)乙醚吸入無痛麻醉，打開胸腔，從左心室推注生理鹽水100 mL，沖去血液，用4%多聚甲醛-1.25%戊二醛磷酸緩沖液(pH7.4)灌注固定，剝?nèi)〈笫笮∧X皮層組織5 mg，研磨成勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清用,以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，在540 nm波長(zhǎng)下，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。分別將大鼠小腦組織A值代入直線回歸方程，計(jì)算出樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 成癮大鼠戒斷癥狀

按Maldonad法評(píng)分，給予鹽酸納洛酮1 h后, 大鼠出現(xiàn)扭體、濕狗樣抖、咬牙,跳躍、站立、上瞼下垂、清理毛發(fā)等戒斷癥狀,成癮動(dòng)物模型建立成功，表1。

表1 海洛因成癮戒斷癥狀及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Heroin addiction withdrawal scoring criteria

注：與對(duì)照組比：**P<0.01

Note：compared with the control group：**P<0.01

2.2 海洛因?qū)Υ笫笮∧X組織Bax水平的影響

Bax標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為：Y=6.3×10-3x+1.4×10-2，R2=0.9979。將大鼠小腦組織吸光度(A)代入方程，成癮大鼠小腦組織Bax水平比對(duì)照組升高了88.21%，圖1。

圖1 海洛因?qū)Υ笫笮∧X組織Bax水平的影響注：與對(duì)照組比：**P<0.01Fig.1 Effect of heroin on Bax level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group **P<0.01

2.3 海洛因?qū)Υ笫笮∧X組織Caspase-9水平的影響

Caspase-9標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為：Y=1.4×10-3x+4.43×10-2，R2=0.998。將大鼠小腦組織吸光度(A)代入方程，成癮大鼠小腦組織Caspase-9水平比對(duì)照組升高了87.24%，圖2。

圖2 海洛因?qū)Υ笫笮∧X組織Caspase-9水平的影響注：與對(duì)照組比：**P<0.01Fig.2 Effect of heroin on Caspase-9 level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group： **P<0.01

2.4 海洛因?qū)Υ笫笮∧X組織Caspase-3水平的影響

Caspase-3標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為：Y=5.0×10-4x+5.2×10-3，R2=0.999。將大鼠小腦組織吸光度(A)代入方程，成癮大鼠小腦組織Caspase-3水平比對(duì)照組升高了94.21%，圖3。

圖3 海洛因?qū)Υ笫笮∧X組織Caspase-3水平的影響注：與對(duì)照組比：**P<0.01Fig.3 Effect of heroin on Caspase-3 level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group： **P<0.01

3 討論

海洛因成癮者抑制控制功能受損是一種持久性的、不可逆的腦損傷[5], 海洛因成癮致使大腦皮質(zhì)下中樞灰質(zhì)體積減少[6]。功能性磁共振成像(fMRI)研究證明，長(zhǎng)期吸食海洛因的成癮者大腦突顯性網(wǎng)絡(luò)功能連接異常增強(qiáng)[7]，從而引起腦默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連接和功能連接不同程度破壞[8]以及頜下腺神經(jīng)內(nèi)分泌功能異常[9]。Bax基因是一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。人類Bax基因定位于染色體19q13.3～19q13.4，含6個(gè)外顯子，其C端含有疏水氨基酸組成的跨膜結(jié)構(gòu)域，Bax蛋白為整合膜蛋白[10]。細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)具有調(diào)節(jié)線粒體通透性的作用。正常情況下,PTP是關(guān)閉的。在凋亡誘導(dǎo)因素 Bax 作用下，線粒體跨膜電位降低，PTP開放,導(dǎo)致線粒體膜通透性增大,使細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子如：細(xì)胞色素C,凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等從線粒體內(nèi)釋放出來。細(xì)胞色素C(Cytc)作為呼吸鏈中重要的電子傳遞體[11]，它從線粒體內(nèi)膜上的釋放阻斷了電子向下游的傳遞，危及呼吸鏈的功能并導(dǎo)致超氧陰離子的加速產(chǎn)生，細(xì)胞色素C和Apaf相互作用可激活caspase-9,進(jìn)而激活caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。給予海洛因后，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠小腦皮質(zhì)細(xì)胞中Bax陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多[4]，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠小腦皮質(zhì)細(xì)胞中Bax表達(dá)水平顯著升高，caspase-9和caspase-3活性顯著增強(qiáng),與對(duì)照組比有顯著性差異(P<0.01)，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。免疫組化法和ELISA法檢測(cè)結(jié)果相互驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，海洛因成癮不但與大腦神經(jīng)中樞有關(guān)，而且小腦皮質(zhì)也參與海洛因成癮和戒斷過程。海洛因可能通過誘導(dǎo)小腦皮質(zhì)Bax基因表達(dá)，激活caspase-9和caspase-3,引起小腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致小腦皮質(zhì)細(xì)胞的損傷。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究精神依賴藥物成癮機(jī)制和戒毒治療提供新的參考依據(jù)。