XRCC4基因多態(tài)性與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

胡建敏 譚桂花

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是當(dāng)前比較危重的疾病，5年生存率不足5%，我國每年死亡病例接近60萬[1-2]。我國肝癌發(fā)病率東南沿海地區(qū)高于內(nèi)地，且當(dāng)前的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。肝癌預(yù)后差的主要原因是癌細胞增值快，且容易侵犯門靜脈導(dǎo)致肝內(nèi)播散，出現(xiàn)肝內(nèi)高轉(zhuǎn)移率[3-4]。肝癌的發(fā)病機制仍不清楚，臨床上認為該病是由遺傳和環(huán)境因素之間聯(lián)合作用引發(fā)的復(fù)雜疾病，具有很強的家族聚集性，有接近大約300余種肝癌的易感候選基因[5-6]。肝癌的發(fā)生與發(fā)展反映在基因及分子水平上主要與原癌基因的激活、抑癌基因的失活、DNA修復(fù)基因的改變等有關(guān)。DNA修復(fù)基因也稱為XRCC4(X線交叉互補基因-4)是涉及惡性腫瘤發(fā)生多個環(huán)節(jié)的重要基因[7]。XRCC4定位于人染色體5q13.q14，是DNA連接酶Ⅳ的輔助因子，能作用于非同源末端連接的連接點，在DNA雙鏈斷裂的完善修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[8]。目前對XRCC4研究最為廣泛的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點為Ale247Ser，已廣泛開展了XRCC4 Ale247Ser與乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌的關(guān)聯(lián)性研究[9-11]，但是與肝癌的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系還無相關(guān)報道。本文具體探討了XRCC4基因多態(tài)性與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，希望能為肝癌的流行病學(xué)研究提供病因線索。現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用回顧性、病例-對照的研究方法，研究時間為2014年5月至2018年2月，選擇在我院腫瘤科進行診治的肝癌患者56例(肝癌組，肝癌診斷依據(jù)包括病理組織學(xué)/細胞學(xué)診斷、血清學(xué)定量檢測、肝臟影像學(xué)檢查等，乙肝病毒檢測陽性)，同期選擇肝癌高危人群120例(高危組，有肝癌家族史，無臨床癥狀的乙肝病毒攜帶者)和健康人156例(對照組，健康獻血人員，乙肝病毒檢測陰性)，納入標(biāo)準(zhǔn)：醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)了此次研究；臨床資料完整；年齡20～75歲；入選者簽署了知情同意書；未經(jīng)放療、化療或生物治療等干預(yù)措施的處理。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝功能不良者；妊娠、哺乳期者；患急性感染性疾病者；心腦血管意外患者。

1.2 XRCC4基因多態(tài)性檢測

所有入選者在晨起空腹取舒適體位，肘前靜脈無菌采血5～8 ml后，采用QIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血淋巴細胞的DNA。使用DNA MAN軟件設(shè)計待測多態(tài)性位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，XRCC4 Ale247Ser引物序列為：正向引物：5‘-ACGTTGGATGAGGGCCCCAGTTTTTTAGAC-3’，反向引物：5‘-ACGTTGGATGCCCGGCCTCAACAAATGTAT-3’。探針和引物由大連TAKARA公司設(shè)計和提供，嚴格按照實驗說明進行操作。5 μl反應(yīng)體系：2×Mix 2.5 μl，40×Mix Kit 0.115 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 1.385 μl，PCR條件：40個循環(huán)，95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。擴增產(chǎn)物片段長度為186 bp。

所有入選者的血糖、血脂指標(biāo)由我院檢驗科統(tǒng)一檢測(奧林巴斯全自動生化分析儀)，同時記錄所有入選者的性別、年齡、體重指數(shù)、HBsAg、吸煙、飲酒等資料。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 基本特征對比

三組入選者的性別、年齡、體重指數(shù)、血糖、血脂等對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，肝癌組的吸煙、飲酒比例高于高危組與對照組，高危組高于對照組，對比差異都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組入選者的基本特征對比

注：*與對照組對比，P<0.05；與高危組對比，#為P<0.05。

2.2 XRCC4基因型與等位基因分布

三組入選者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，Ale247Ser位點的3種基因型CC、CT、TT和等位基因C、T在肝癌組、對照組、高危組之間的頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組入選者的Ale247Ser位點基因型及等位基因分布對比(例，%)

2.3 相關(guān)性分析

在校正了年齡、性別、體重指數(shù)、血糖、血脂等混雜因素后，二元logistics回歸模型顯示與C等位基因相比，T等位基因入選者肝癌患病OR值為0.992；與CC基因型相比，攜帶CT、TT、CT+TT基因型的入選者肝癌患病OR值為0.872、0.983和0.911。見表3。

表3 不同XRCC4基因型入選者的肝癌患病風(fēng)險(n=332)

3 討論

肝癌是惡性度極高的腫瘤，具有病情進展快、侵襲性強、起病隱匿、潛伏期長、易轉(zhuǎn)移等特點，嚴重威脅著人們的健康及生命[12]。肝癌的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果，其中基因是1個重要的因素，基因作為重要的內(nèi)源性因素對肝癌的形成具有重要的作用[13]。

人類正常細胞中存在完整的DNA修復(fù)系統(tǒng)，通過多種DNA修復(fù)通路逆轉(zhuǎn)DNA損傷，以維持基因的穩(wěn)定性與正常的細胞進程[14]。DNA修復(fù)通路的獲得性、遺傳性缺陷將破壞基因的完整性，使細胞向惡性轉(zhuǎn)變，可顯著影響個體對腫瘤的易感性[15]。XRCC4是第1個被分離出來的影響細胞對電離輻射敏感性的哺乳類動物的修復(fù)基因，是1種重要的DNA修復(fù)基因，可廣泛參與DNA損傷的修復(fù)，是1種重要的DNA修復(fù)基因。XRCC4可參與因電離輻射和氧化損傷引起的堿基切除修復(fù)和DNA單鏈斷裂修復(fù)，其表達異常和多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)[16-17]。XRCC4全長33 kb，編碼633個氨基酸，包含17個外顯子，包括CAAT盒、N端區(qū)、CREB位點和尚未明確的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。XRCC4基因的SNP位點比較多，主要位于XRCCI的編碼區(qū)。其中Ale247Ser位點位于XRCC4基因第6外顯子區(qū)域，第194密碼子位點C-T的變異，可導(dǎo)致相應(yīng)密碼子丙氨酸-絲氨酸(Ale-Ser)的改變的變化[18]。本研究顯示三組入選者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，Ale247Ser位點的三種基因型CC、CT、TT和等位基因C、T在肝癌組、對照組、高危組之間的頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。有學(xué)者對我國140例肝癌患者和536例對照的研究表明，在病例和對照組中，399Arg/Gln+Gln/Gln的基因型頻率分別為48.6%和32.5%，對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[19]。攜帶399Gln等位基因為肝癌的風(fēng)險OR值為2.481，且與甲胎蛋白有聯(lián)合作用，OR值為2.06[20]。

肝癌是多因素、多步驟、多基因、長期發(fā)展而成的，即在HBV感染及甲胎蛋白異常這兩個主要風(fēng)險因素以外，還有吸煙、飲酒以及遺傳背景等因素[21]。特別是個體是否患肝癌不僅取決于環(huán)境因素，在很大程度上還取決于遺傳易感性[22]。SNP是人類長期進化過程中由于環(huán)境的選擇形成的基因點的突變，人群中的發(fā)生頻率大于1%，是指基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的變化以及單堿基的插入/缺失等表現(xiàn)形式[23]。本研究顯示二元logistics回歸模型顯示與C等位基因相比，T等位基因入選者肝癌患病OR值為0.992；與CC 基因型相比，攜帶CT、TT、CT+TT基因型的入選者肝癌患病OR值為0.872、0.983和0.911。XRCC4是KuTO/KuSO介導(dǎo)的DNA末端結(jié)合復(fù)合物的一部分，XRCC4與DNA連接酶Ⅳ有密切關(guān)系，能增強DNA連接酶Ⅳ的活性[24-25]。不過本研究未在動物水平進一步驗證XRCC4的功能，另外在機制研究方面還有待進一步深入，將在后續(xù)的工作中進行完善。

綜上所述，肝癌患者可表現(xiàn)為XRCC4基因多態(tài)性，XRCC4 Ale247Ser可導(dǎo)致肝癌的患病風(fēng)險發(fā)生變化，可參與調(diào)節(jié)肝癌的發(fā)生與發(fā)展。