非編碼RNA在植物中的研究進(jìn)展

馬博涵，姚 丹，焦蘇淇，魯中爽，李澤遠(yuǎn)，張愛晶，何浩博，張家野

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

早在20世紀(jì)，人們就開始研究非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)，但是直到基因組時(shí)代的到來，ncRNAs才逐漸受到重視。隨著近年來轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多新的ncRNAs逐漸浮出水面，這些新ncRNAs的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

ncRNAs是一類不編碼蛋白且具有催化活性的RNA分子，廣泛存在于各種生物體中。由于結(jié)構(gòu)不同，ncRNAs可分為線性ncRNAs（linear ncRNAs）和環(huán)形 ncRNAs（circRNAs），其中l(wèi)inear ncRNAs包括小ncRNAs如（microRNAs miRNAs）和長(zhǎng)鏈 ncRNAs（lncRNAs）。植 物miRNAs在近些年研究較多，其能夠降解或者抑制靶標(biāo)mRNA的翻譯、抑制目的基因的表達(dá)，進(jìn)而影響生物過程；lncRNAs在動(dòng)物醫(yī)學(xué)方面研究比較深入，而通過這兩年在植物中的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs具有順式或者反式調(diào)節(jié)因子、調(diào)控基因的功能；circRNAs是一種新型的ncRNAs，它與miRNAs之間的海綿機(jī)制一直是人們研究的熱點(diǎn)，XING等［1］系統(tǒng)分析了我國非編碼RNA研究的主要現(xiàn)狀。2000年以前，國內(nèi)還未見非編碼RNA相關(guān)的文章，但到了2015年，非編碼RNA的文章高達(dá)600余篇，占世界此類研究文總數(shù)的1/2，表明我國非編碼RNA研究的速度驚人。WANG等［2］研究表明，這些ncRNAs對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育尤其是在應(yīng)激反應(yīng)過程中起著重要的調(diào)控作用；YE等［3］對(duì)環(huán)形非編碼RNA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。本研究簡(jiǎn)述了ncRNAs的分類及相關(guān)功能，總結(jié)了近年來植物中幾種主要ncRNAs（miRNAs、lncRNAs、circRNAs）的研究進(jìn)展，包括這些ncRNAs的特征、鑒定、功能以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫等，重點(diǎn)總結(jié)了在植物應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的研究現(xiàn)狀，并展望了未來植物ncRNAs的研究方向，為進(jìn)一步深入研究這些植物ncRNAs的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 植物miRNAs的研究進(jìn)展

1.1 miRNAs的產(chǎn)生

miRNAs是由內(nèi)源基因編碼的一類非編碼單鏈小RNA分子，其長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，大多數(shù)miRNAs具有高度的保守性和組織特異性［4］。早在1993年，LEE等［5］首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)miRNA基因lin-4；在隨后的2000年，REINHART等［6］在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第2個(gè)miRNA基因let-7。與動(dòng)物相比，雖然植物miRNAs的研究相對(duì)較晚，但后期發(fā)展迅速。REINHART等［7］在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)miRNAs基因并鑒定出20種miRNAs；WANG等［8］從水稻中鑒定出20種miRNAs；隨著對(duì)植物miRNAs研究的深入，截至2011年，已在植物中發(fā)現(xiàn)72種miRNAs。至今，已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、 大 豆（Glycine max L.）、水稻（Orza sativa L.）、煙草（Nicotiana tabacum L.）、玉米（Zea mays L.）、小麥（Triticum aestivum L.）等多種植物中發(fā)現(xiàn)許多不同類型的miRNAs［9-13］，為今后研究植物中的 miRNAs提供參考。

2012年，KHRAIWESH等［14］報(bào)道了miRNAs的生物合成途徑（圖1），在RNA聚合酶Ⅱ（RNA Pol Ⅱ）的作用下，首先由miRNAs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)轉(zhuǎn)錄物pri-miRNAs，接著Dicer-like1酶（DCL1）將植物初級(jí)轉(zhuǎn)錄物pri-miRNAs剪切加工形成雙鏈 的 pre-miRNAs（precursor miRNAs），premiRNAs為成熟miRNA的前體；然后DCL1酶進(jìn)行第2次切割形成由pre-miRNAs與成熟miRNAs的互補(bǔ)片段所組成的雙鏈miRNAs，并借助于HST（轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5在植物中的同源類似物）將miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，最終經(jīng)酶切后在細(xì)胞質(zhì)中形成成熟的miRNAs。成熟的miRNAs進(jìn)入核糖核蛋白復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）并在其中發(fā)揮作用。

圖1 植物miRNAs的主要生物合成途徑(改自文獻(xiàn)［15］)Fig.1 Major biogenesis pathways of plant miRNAs (Change from reference［15］)

1.2 miRNAs的功能

通過近10年的研究，一些植物miRNAs的功能已經(jīng)被鑒定，這些小分子miRNAs在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用，它們通過抑制靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、株型變化以及器官分化等過程（表1）。

表1 植物miRNAs在信號(hào)通路中的作用Table 1 Role of plant miRNAs in signaling pathways

1.3 miRNAs的最新數(shù)據(jù)庫

植物miRNAs通過抑制靶mRNA間接地調(diào)控目的基因的表達(dá)，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，因此，如何鑒定植物miRNAs的靶基因，成為生物學(xué)研究的難點(diǎn)。迄今為止，常用一些生物信息學(xué)工具對(duì)植物miRNA作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，目前有許多miRNAs數(shù)據(jù)庫，如miRBase［39］從已經(jīng)鑒定的不同生物實(shí)驗(yàn)計(jì)算收集miRNAs；PmiRKB［40］植物miRNAs信息庫是眾所周知的植物特異性miRNAs的注釋數(shù)據(jù)庫；miRTarBase［41］是常見的miRNAs與靶標(biāo)相互作用數(shù)據(jù)庫；miRPlant［42］、miRanalyzer［43］、miRA［44］、miRDeep-P［45］可用于預(yù)測(cè)新的miRNAs，miRU［46］、psRNATarget［47］和 TAPIR［48］都可以用來預(yù)測(cè)植物miRNAs的靶標(biāo)。但是，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因以后，還需要采用如q-PCR、測(cè)序等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證植物miRNA靶基因的準(zhǔn)確性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

2 植物lncRNAs的研究進(jìn)展

2.1 lncRNAs的特征

lncRNAs是一類長(zhǎng)度大于200 nt的ncRNAs，具有啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和polyA尾巴，存在組織特異性與時(shí)空特異性，在不同植物組織之間的lncRNAs表達(dá)量不同［49］。ncRNAs最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”，因?yàn)樗鼈兙哂休^低的表達(dá)水平和序列保守性，但隨著近些年的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs是細(xì)胞過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可作為基因表達(dá)的順式或反式調(diào)節(jié)因子在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，具有調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的功能。

2.2 lncRNAs的作用機(jī)制

近年來，植物lncRNAs的研究突飛猛進(jìn)，目前在擬南芥［50］、小麥［51］、水稻［52］、獼猴桃［53］、玉米［54］、桃樹［55］、黃瓜［56］等鑒定出了大量lncRNAs，而對(duì)lncRNAs功能的研究是目前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一，探究植物lncRNAs的作用機(jī)制有助于更加深入地理解其特征及相關(guān)生物學(xué)功能。雖然lncRNAs不能編碼蛋白，與已知編碼蛋白的基因類似，一些植物lncRNAs可以充當(dāng)ceRNAs，通過靶標(biāo)靶向調(diào)控miRNAs，從而阻斷miRNA與其靶標(biāo)之間的相互作用，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，如BARDOU等［57］報(bào)道了擬南芥中低磷誘導(dǎo)的lncRNAs IPS1采取模擬靶基因的方法，解除了miR399對(duì)靶基因PHO2的抑制，因此調(diào)控磷反應(yīng)過程進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；WANG等［58］報(bào)道了幾種lncRNAs被鑒定為響應(yīng)番茄黃葉卷曲病毒（TYLCV）感染的番茄miRNA的靶標(biāo)模擬物；最近一項(xiàng)研究報(bào)道，有13種lncRNAs被預(yù)測(cè)為96種miRNAs的前體，這些miRNAs參與了對(duì)甘藍(lán)型油菜菌核病菌的感染過程［52］；針對(duì)小麥的一項(xiàng)研究報(bào)道了3種lncRNAs作為miR-2004和miR-2066的前體，16種lncRNAs作為97種siRNAs響應(yīng)白粉病感染的前體［59］。雖然已經(jīng)有l(wèi)ncRNAs作用機(jī)制及功能的相關(guān)報(bào)道，但其在植物上的研究還不夠深入，因此還有待于進(jìn)一步研究植物中不同類型lncRNAs的特征，這對(duì)作用機(jī)制的研究具有很大幫助。

2.3 lncRNAs的最新數(shù)據(jù)庫

為了鑒定lncRNAs及其生物學(xué)特征，已經(jīng)開發(fā)了幾個(gè)數(shù)據(jù)庫用于進(jìn)一步的lncRNAs研究。例如，NONCODE是16種ncRNAs的完整收集和注釋數(shù)據(jù)庫，涵蓋動(dòng)物中各種類型的ncRNAs，并使用CNCI軟件評(píng)估lncRNAs編碼潛力［60］，然而在植物中，NONCODE中僅包括擬南芥lncRNAs；lncRNAdb［61］提供了287個(gè)真核生物lncRNAs的綜合注釋，以及它們實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的生物學(xué)功能，lncRNAdb中同樣只有很少的植物lncRNAs，包括7個(gè)擬南芥lncRNAs和2個(gè)水稻lncRNAs；QUEK等［62］開發(fā)了PlncDB，它提供了與lncRNAs相關(guān)的全面信息，但也僅適用于擬南芥；PNRD［63］是最大的植物lncRNAs數(shù)據(jù)庫，PNRD包括主要有4種植物物種的lncRNAs序列，包括擬南芥、水稻、楊樹和玉米，因此，如果鑒定植物中的lncRNAs，PNRD是首選數(shù)據(jù)庫。相比較鑒定動(dòng)物lncRNAs而言，鑒定植物lncRNAs較少且受物種的局限，還有待于進(jìn)一步研究并建立植物lncRNAs相關(guān)數(shù)據(jù)庫。

3 植物circRNAs的研究進(jìn)展

3.1 circRNAs的產(chǎn)生

circRNAs是一類內(nèi)源性非編碼環(huán)狀RNA，具有3’和5’末端共價(jià)結(jié)合形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有組織特異性。與傳統(tǒng)的線性RNA相比，circRNAs沒有5’末端帽子結(jié)構(gòu)和3’末端poly(A)尾巴，不易被核酸外切酶RNaseR降解，因此circRNAs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；一些circRNAs含有miRNAs應(yīng)答元件，能夠miRNAs靶向結(jié)合，在細(xì)胞中與miRNAs存在海綿機(jī)制作用，消除miRNAs對(duì)靶基因的抑制，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。

目前發(fā)現(xiàn)的circRNAs主要來源于基因外顯子(exon)，這些circRNAs廣泛存在于多種真核生物中，circRNAs的生物合成有幾個(gè)途徑（圖2）。首先外顯子環(huán)化的效率依賴于外顯子附近出現(xiàn)的剪切位點(diǎn)，正常情況下反向剪切效率一般都低于相同位置的線性轉(zhuǎn)錄本，這是由于剪切子在反向剪切位點(diǎn)位置上的組裝不利于5'端和3'端的連接；大多數(shù)的circRNAs包含幾個(gè)外顯子，其外顯子序列用于反向剪切，然后同一個(gè)基因通過可變剪切能夠產(chǎn)生多個(gè)circRNAs，在此過程中，環(huán)化的外顯子側(cè)翼內(nèi)含子中可能會(huì)頻繁出現(xiàn)順式調(diào)控元件，如形成RNA雙鏈結(jié)構(gòu)將明顯增強(qiáng)反向剪切，另外內(nèi)含子序列中短的順式作用元件能夠識(shí)別RNA結(jié)合蛋白（PBRs）進(jìn)而促進(jìn)外顯子環(huán)化；circRNAs結(jié)合蛋白介導(dǎo)的調(diào)控合成途徑除了順式作用元件過表達(dá)RBPs，也可以在側(cè)翼內(nèi)含子序列中添加RNA蛋白結(jié)合位點(diǎn)，同樣能促進(jìn)circRNAs的表達(dá)。

3.2 circRNAs的鑒定及功能

SANGER等［64］于20世紀(jì)70年代在植物病毒體中發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)circRNAs。2014年在擬南芥根部首次發(fā)現(xiàn)circRNAs，隨后2016年YE等［65］補(bǔ)充報(bào)道了水稻中有12 307個(gè)circRNAs，模式植物擬南芥中有6 012個(gè)circRNAs（表2）。2015年，LU等［66］通過高通量測(cè)序和RNA-seq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)計(jì)算后，在水稻中鑒定了2 354個(gè)circRNAs，其中1 356是外顯子來源的circRNAs，一些差異表達(dá)的circRNAs表現(xiàn)出組織特異性。LIU等［67］對(duì)不同生長(zhǎng)階段的擬南芥葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過對(duì)擬南芥葉片生長(zhǎng)與衰老過程的表達(dá)譜進(jìn)行分析，鑒定了168個(gè)circRNAs，其中包括40種新型circRNAs，在擬南芥葉片中有158個(gè)是基因外顯子來源的circRNAs。通過GO分析和KEGG分析，一些circRNAs被注釋，從中發(fā)現(xiàn)circRNAs具有調(diào)控?cái)M南芥葉片衰老的功能。

圖2 circRNAs的生物合成Fig.2 Biosynthesis pathways of plant circRNAs

表2 植物circRNAs鑒定Table 2 Identification of plant circular RNAs

ZHANG等［68］在玉米和擬南芥中分別鑒定了2 174和1 354個(gè)circRNAs，并且大多數(shù)差異表達(dá)的circRNAs參與干旱反應(yīng)途徑。截止至目前，在玉米、大豆、水稻、小麥、大麥、擬南芥、獼猴桃（Pseudomonas syringaeL.）、番茄（Solanum lycopersicumL.）等植物中鑒定到了circRNAs （表2）。由于存在植物本身的特異性和取樣組織部位的特異性，不同樣品之間的測(cè)序深度不同，導(dǎo)致當(dāng)前報(bào)道的circRNAs數(shù)量有明顯差異。

近年來，ZHAO等［69］通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析在鑒定了大豆中circRNAs，對(duì)3 904個(gè)circRNAs進(jìn)行了GO分析和KEGG分析，在分子功能方面，GO分析的注釋包括核苷酸結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和mRNA加工等功能。在生物過程方面，circRNAs主要參與一些代謝過程；KEGG途徑分析顯示，circRNAs在檸檬酸循環(huán)途徑、氨?；?tRNA生物合成、糖酵解/糖異生、甘油磷脂代謝、丙酮酸代謝和氧化磷酸化等相關(guān)途徑中顯著富集。ZHAO等［74］運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)大豆抗蟲基因進(jìn)行分析，從中鑒定出5 367個(gè)circRNAs，并預(yù)測(cè)在大豆中有5 356個(gè)circRNAs能與miRNAs靶標(biāo)結(jié)合，這些miRNAs來自69個(gè)家族，包括miRNA1520、miRNA172、miRNA159、miRNA156和 miR395家 族 等，其中miRNA1514家族與circRNAs結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目最多。

目前在植物中鑒定到的circRNAs數(shù)量較少，鑒定到的miRNAs不夠全面，如在miRNAs一些新的數(shù)據(jù)庫中，鑒定到的玉米miRNAs有325個(gè)，但在動(dòng)物中（包括人類）已達(dá)到2 000多個(gè)，這讓circRNAs和miRNAs之間的靶向關(guān)系變得模糊，因此有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)語與展望

植 物 ncRNAs除 了 miRNAs、lncRNAs、circRNAs外，還有幾種較重要的RNA。例如，snRNAs核內(nèi)小分子RNA(small nuclear RNA)，它參與mRNA前體的加工，是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過程中RNA剪接體的主要成分；snoRNAs核仁小分子RNA（small nucleolar RNAs），它在核糖體RNA 的生物合成中發(fā)揮重要作用，還能指導(dǎo)snRNA、tRNA 和mRNA 的轉(zhuǎn)錄后修飾；siRNAs是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的靶標(biāo)mRNA的沉默；piRNAs（Piwi-interacting RNA）目前研究較少，它是一類長(zhǎng)度為24～32 nt的單鏈小RNA，具有專一性，piRNAs主要與PIWI亞家族成員Piwi蛋白或AGO3蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮作用。隨著ncRNAs研究的深入，會(huì)出現(xiàn)越來越多新的ncRNAs。

植物ncRNAs的作用機(jī)理是當(dāng)今分子生物學(xué)研究的前沿與熱點(diǎn)之一，鑒定ncRNAs的種類及功能，闡明ncRNAs的生物合成途徑是該領(lǐng)域的基本科學(xué)問題。近年來開發(fā)的單細(xì)胞測(cè)序和單分子測(cè)序可能會(huì)為鑒定植物中新的ncRNAs提供機(jī)會(huì)，因此，有必要開發(fā)新的生物信息學(xué)方法來鑒定更多的 ncRNAs［62］。雖然 miRNAs、circRNAs和lncRNAs在植物應(yīng)激反應(yīng)中取得了顯著進(jìn)展，但它們之間的互相作用還有待進(jìn)一步研究。研究miRNAs、circRNAs、lncRNAs之間的表達(dá)模式并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)將會(huì)很有趣，這使我們對(duì)應(yīng)激反應(yīng)中基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有更深的了解。即使編碼蛋白質(zhì)的基因在植物中相對(duì)變化較少，隨著ncRNAs的增加，植物的結(jié)構(gòu)域是動(dòng)態(tài)的，每年都在不斷地發(fā)現(xiàn)新成員。

除在水稻和大豆等作物中有一些研究外，當(dāng)前對(duì)植物ncRNAs的生物學(xué)功能和作用機(jī)制的研究還主要集中在擬南芥等模式植物方面。植物中circRNAs和lncRNAs的研究還處于起步階段，尤其是與植物circRNAs相關(guān)的問題有待深入研究，包括植物circRNAs的作用機(jī)制和生物學(xué)功能；還有受生物和非生物等環(huán)境因素所調(diào)控的比較重要的分子機(jī)制等，包括現(xiàn)在基因編輯CRISPR/Cas9技術(shù)的通用性可能對(duì)ncRNAs功能表征有一定作用，預(yù)計(jì)這些新的技術(shù)將在ncRNAs研究中得到廣泛應(yīng)用。期望不久的將來會(huì)發(fā)現(xiàn)更多新的ncRNAs、成熟的研究技術(shù)以及利用ncRNAs的作用機(jī)制促進(jìn)分子的植物育種。